JP6512757B2 - 被検物質の定量方法及びそのための定量デバイス - Google Patents
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Automatic Analysis And Handling Materials Therefor (AREA)
Description
前記特異結合物質固定化領域を洗浄後、前記被検物質に特異的に結合する、標識された第2の特異結合物質を前記流路に流通させて前記第1の特異結合物質に結合した被検物質と第2の特異結合物質とを結合させる工程と、
前記特異結合物質固定化領域を洗浄後、被検物質に結合した標識を定量する工程とを含み、前記試料の流速が、下記の式[I]
5 ≦ (2Dτ) 1/2 /d [I]
(式中、Dは被検物質の拡散係数(m 2 /s)、τは特異結合物質固定化領域上に被検物質の分子が滞在する平均時間(s)、dは流路の深さ(m))
を満足させる流速である、試料中の被検物質の定量方法
を提供する。
5 ≦ (2Dτ)1/2/d [I]
(式中、Dは被検物質の拡散係数(m2/s)、τは特異結合物質固定化領域上に被検物質の分子が滞在する平均時間(s)、dは流路の深さ(m))
が満足される流速で試料を流通させることが好ましい。Dの拡散係数(m2/s)自体は、当業者にとって周知であり、該デバイスが用いる温度に依存する値である。被検物質のDは、濃度勾配を利用した従来の周知の拡散係数の測定等により測定することができる。また、文献(Small, 8(8),1237-1242(2012))に掲載されているように、拡張ナノ空間やマイクロ空間で直接測定してもよい。特定の試料に含まれる被検物質を、特定の定量デバイスで定量する場合、D及びdは定数となるので、変数はτのみであり、τは、流路を流通する試料の平均流速と特異結合物質固定化領域の長さから直ちに算出可能であるので、特定の試料に含まれる被検物質を、特定の定量デバイスで定量する場合、上記式[I]は、試料の流速や流量を適切に選択することにより達成することができる。試料の流速や流量は、マイクロ流路チップの分野で常用されている定量ポンプを用いて試料を注入することにより容易に調節可能である。なお、この工程の反応温度は、被検物質と第1の特異結合物質との反応に適した温度であり、例えば、抗原抗体反応の場合や、レセプターとリガンドの反応の場合、通常、室温〜37℃であり、核酸相補鎖間の反応の場合には、特異的なハイブリダイゼーションを達成するのに適した温度(例えば、50℃〜60℃)である。
1.1.抗体パターニング法
熱接合の過程で機能性分子が熱に伴い損傷するのを防ぐため低温接合を利用した。この方法により、フッ素を含む酸素プラズマ表面活性化による25〜100℃でのガラス−ガラス接合が可能となる。しかしながら、この酸素プラズマ表面活性化プロセスは、官能基や抗体等の表面修飾分子を損傷する。ここでは、抗体を固定化するための官能基をパターニングし、接合させるガラス表面を活性化するため、高い光子エネルギー(λ=172nm)による強い酸化効果を有する真空紫外線(VUV)光を使用した。
ナノ流体用のイムノアッセイデバイスは、液体体積と液体交換の調節により標的分子を導入し捕捉するために、圧力駆動型の流体制御を要する。これにより、免疫化学的反応体を他の分子から適切に分離することが可能となる。本目的のための実験装置の概略図を図2に示す。前述のように、液流は圧力駆動型の流通系により制御した。バイアルに含まれた液体の流れをコンプレッサーに接続した圧力制御装置により調節した空気圧により導入した。ポリエーテルエーテルケトン(PEEK)製のキャピラリーをマイクロ流路(幅500μm×深さ6μm)の入口と出口に接続した。マイクロ流路とナノ流路の溶液を迅速に交換するために、マイクロ流路の両端を貫通孔を通して外部と接続した。この溶液を、マイクロ流路の一方の入口に圧力をかけることによりナノ流路に導入した。次いで、提案方法を用いて作製されたデバイスが漏出なく圧力駆動型の流体制御を可能とするか否かを検討した。
フェムトリットル量の反応空間を構築するためには、デバイス表面を精密に設計する必要がある。拡張ナノ流路の表面積/体積比が大きいため、標的分子の非特異的吸着は試料の著しい損失をもたらし、その結果定量分析を妨げる場合がある。一般にタンパク質は露出したシリカ表面上に不可逆的に吸着し、捕捉抗体と標的抗原の著しい非特異的吸着をもたらす。従って、非特異的吸着を低減するために、シラノール基にシラン化PEGを直接結合させる方法を選択する。設計通りに分子捕捉領域(即ち、抗体固定化領域)(特異結合物質固定化領域)が形成されたことを立証するため、抗原過剰条件下で蛍光標識抗原を結合させて固定化抗体を間接的に視覚化した。本目的のために、抗マウスIgG(抗体)とDylight488標識マウスIgG(抗原)を使用した。可視化前には、キャピラリーとマイクロ流路及びナノ流路の表面を2%BSAのPBS溶液で30分間ブロックした。68nMの抗原溶液を用いた反応と反応緩衝液による洗浄の後に、分子補足領域(特異結合物質固定化領域)を観察した。図4(a)に示すように、蛍光強度の像と線プロファイルの両方において明確なコントラストが観察された。測定幅130μmはVUV光照射工程で使用されたフォトマスクの設計幅135μmとほぼ同じであったため、抗体固定化表面は十分調節可能である。VUV光の屈折により生じるAPTESパターンの不均一性により、パターン幅のわずかな減少と、パターン両端における強度の段階的変化が生じた。ナノ流路の閉塞と漏出は観察されなかった。上記結果は、分子補足領域を予め設定した場所に構築でき、免疫化学反応場体積86fLで成功したことを示した。この反応場体積は抗体が固定化されマイクロビーズが充填されたマイクロ流路の反応量(100nL)より5桁小さい。
マイクロ流体デバイス又は96ウェルプレートのような従来のイムノアッセイフォーマットにおける反応空間の大きさ(μmからmmスケール)とは対照的に、拡張ナノ流路(nmスケール)の大きさは、数秒間にわたる拡散距離よりもはるかに小さい。このような条件下では、拡散距離が短いため、導入された抗原は固定化抗体と必然的に相互作用し、その結果反応は非常に効率的となり、標的分子をロスすることなく補足できる。これは拡張ナノ流路における分子補足に特有の特徴であり、この特徴により拡張ナノ流路は極めて少量の分析物の定量に理想的に適合したものとなる。
原材料及び化学薬品:APTESは東京化成工業(日本、東京)から購入した。グルタルアルデヒド(25%)は和光純薬工業(日本、大阪)から購入した。トリメトシキシラン−PEG(シラン−PEG、MW=5kDa)はNANOCS(米国、ニューヨーク州、ニューヨーク)から購入した。モノクロナール抗マウスIgG2a(ab131231)及びマウスIgG2aアイソタイプコントロール(クローン20102)抗体は、アブカム(日本、東京)及びR&Dシステムズ(米国、ミネソタ州、ミネアポリス)からそれぞれ購入した。蛍光染料Dylight488を用いたマウスIgG2aの標識は、サーモフィッシャーサイエンティフィック(米国、マサチューセッツ州、ウォルサム)から購入したDylight488マイクロスケール抗体標識キットを用いて行った。グルタルアルデヒド(2.5%)の10mMホウ酸塩緩衝溶液(pH7.0)を抗体の固定化に使用した。反応緩衝液は、2%のウシ血清アルブミンと0.05%のTween20を含む10mMのPBS(pH7.4)であり、抗体が固定化された表面を再生するのに使用した緩衝液はpH2.4のグリシン/HClであった。ウシ血清はコージンバイオ株式会社(日本、埼玉県)から購入した。全ての溶液は、流路の閉塞を防ぐため0.22μmのシリンジフィルターで濾過した。
実施例1と同様な方法により、実施例1と同様なデバイスを作製した。デバイスの拡張ナノ流路部分を模式的に図7に示す。拡張ナノ流路の高さは800nm、幅は2μmであり、APTESを選択的にコーティングした特異物質結合領域の長さは3mmであった。APTES上に固定化した第1の特異結合物質は、抗マウスIgGポリクローナル抗体であった。抗マウスIgGポリクローナル抗体を固定化後、PBS中2% BSA溶液で30分間処理してブロッキングを行った。
Claims (7)
- 第1の基板と、該第1の基板と接合される第2の基板と、該第1及び第2の基板の接合面に形成され、該第1及び第2の基板の外部に連通する流路と、該流路の一部領域であって、被検物質に特異的に結合する第1の特異結合物質が固定化された特異結合物質固定化領域とを具備し、前記流路の高さが10nm〜10μm、前記特異結合物質固定化領域の長さが1μm〜10cmである、試料中の被検物質の定量デバイスの前記流路に前記試料を流通させて該試料中の前記被検物質を、前記第1の特異結合物質に結合させる工程と、
前記特異結合物質固定化領域を洗浄後、前記被検物質に特異的に結合する、標識された第2の特異結合物質を前記流路に流通させて前記第1の特異結合物質に結合した被検物質と第2の特異結合物質とを結合させる工程と、
前記特異結合物質固定化領域を洗浄後、被検物質に結合した標識を定量する工程とを含み、前記試料の流速が、下記の式[I]
5 ≦ (2Dτ)1/2/d [I]
(式中、Dは被検物質の拡散係数(m2/s)、τは特異結合物質固定化領域上に被検物質の分子が滞在する平均時間(s)、dは流路の深さ(m))
を満足させる流速である、試料中の被検物質の定量方法。 - 前記試料の流速が、上記式[I]の右辺の値が30以上となる流速である請求項1記載の方法。
- 前記流路が、高さ10nm〜1000nmの拡張ナノ流路である、請求項1又は2記載の方法。
- 前記第1の特異結合物質が抗体若しくはその抗原結合性断片又は抗原であり、前記被検物質が抗原又は抗体である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識が酵素標識であり、該酵素は、その基質と反応して発色する酵素であり、標識酵素と、その基質を酵素反応させて発色させる工程をさらに含み、前記標識の定量は、酵素反応の結果発色した物質を微分干渉熱レンズ顕微鏡で定量することにより行われる請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記酵素反応は、試料の流通を停止した状態で行う請求項5記載の方法。
- 前記微分干渉熱レンズ顕微鏡による定量は、前記特異結合物質固定化領域よりも下流の領域で行う請求項5記載の方法。
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