JP6067572B2 - タンパク質再生マイクロ流体デバイス、及びそれを製造して使用する方法 - Google Patents

タンパク質再生マイクロ流体デバイス、及びそれを製造して使用する方法 Download PDF

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Description

国際公開第2010／135364号パンフレット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、生化学、細胞及び分子生物学、並びに臨床診断の分野においてタンパク質をサイズのみに基づいて分離するために広く使用されている基本的な手段である。タンパク質のサイズは、単位質量当たり同一の負電荷で様々なタンパク質を覆うＳＤＳ分子のタンパク質への結合により判定される。タンパク質のＰＡＧＥサイジング用に複数の界面活性剤（例えば、臭化セトリモニウム、酸に不安定な界面活性剤）が発見されているが、ＳＤＳは、依然としてＰＡＧＥでのタンパク質のサイズの測定に広く使用されている界面活性剤である。しかしながら、ＳＤＳ処理は、タンパク質の本来の構造に重大な影響を及ぼし、正常なレベルの生物学的活性を減少させる可能性がある。従って、特にウエスタンブロット法では、タンパク質の再生又はＳＤＳの除去が、免疫プロービング又は質量分析による識別の前に必要である。現在、希釈、ゲル濾過及びサイズ排除クロマトグラフィーを含む複数のタンパク質再生技術はベンチトップで行われている。
タンパク質再生要素を備えたマイクロ流体デバイス、及びマイクロ流体デバイスを使用するための方法を提供する。本開示の態様は、第１の流路を有する分離媒体と、該分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素とを備えているマイクロ流体デバイスを含む。更に、本マイクロ流体デバイスを使用する方法、並びにマイクロ流体デバイスを備えたシステム及びキットを提供する。本マイクロ流体デバイス、システム及び方法は、診断アッセイ及び検証アッセイを含む様々な異なる用途に使用される。
本開示の態様は、第１の流路を有する分離媒体と、該分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素とを備えているマイクロ流体デバイスを含む。
ある実施形態では、前記マイクロ流体デバイスは、前記分離媒体と流体連通し、第３の流路を有する結合媒体を更に備えている。場合によっては、前記第１の流路は第１の方向軸を有し、前記第２の流路は第２の方向軸を有する。ある場合には、前記第２の流路及び前記第３の流路は、前記第２の方向軸に沿って逆方向である。
ある実施形態では、前記タンパク質再生要素は、サブナノ細孔のゲル膜を含んでいる。前記サブナノ細孔のゲル膜は、４０〜５０％Ｔの範囲のモノマー濃度を有する前駆体から重合してもよい。
ある実施形態では、前記結合媒体は、支持体と安定して会合している結合メンバーを含んでいる。場合によっては、前記結合メンバーは、タンパク質性結合メンバーである。ある場合には、前記タンパク質性結合メンバーは、抗体又はそのフラグメントを含んでいる。場合によっては、前記タンパク質性結合メンバーはレクチンを含んでいる。
場合によっては、前記マイクロ流体デバイスは、前記分離媒体と流体連通する充填媒体を更に備えている。ある実施形態では、前記マイクロ流体デバイスは、前記タンパク質再生要素が前記分離媒体の第１の側と隣接し、結合媒体が前記第１の側の反対側の前記分離媒体の第２の側と隣接し、前記充填媒体が前記第１の側と第２の側との間の前記分離媒体の第３の側と隣接するように構成されている。
場合によっては、前記マイクロ流体デバイスは、前記タンパク質再生要素を有する第１組のサイドチャネル、及び前記結合媒体を有する第２組のサイドチャネルを更に備えている。
ある場合には、前記マイクロ流体デバイスは、前記分離媒体に、方向が異なる第１及び第２の電場を印加するように構成されている。ある実施形態では、前記第１及び第２の電場は互いに直交する。
ある実施形態では、前記マイクロ流体デバイスは緩衝液を更に備えている。場合によっては、前記緩衝液には界面活性剤が含まれている。場合によっては、前記マイクロ流体デバイスは試料を更に備えている。ある実施形態では、前記試料は、対象となる分析物を含んでいる。ある場合には、前記分析物は蛍光標識を含んでいる。
本開示の態様は、流体試料を本明細書に記載されているマイクロ流体デバイスに導入すること、流体試料に分離媒体を通過させ、分離した試料を生成すること、及び分離した試料を再生条件に供して、再生した試料を生成することを有する方法を含む。
場合によっては、本方法は、再生した試料を結合媒体に移動させることを更に有する。ある実施形態では、本方法は、試料中の１以上の分析物の有無を検出することを更に有する。ある場合には、分析物は疾患バイオマーカーを含んでいる。ある場合には、移動させることは、結合媒体に結合したタンパク質性結合メンバーに試料を接触させることを含む。場合によっては、タンパク質性結合メンバーは抗体又はそのフラグメントを含んでいる。場合によっては、タンパク質性結合メンバーはレクチンを含んでいる。
本開示の態様は、本明細書に記載されているマイクロ流体デバイスと、該マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに電場を印加するように構成されている電場印加装置とを備えているシステムを含む。上述したように、前記マイクロ流体デバイスは、第１の流路を有する分離媒体と、該分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素とを備えている。
ある実施形態では、前記システムは、前記マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルを評価して、シグナルを得るように構成されている検出器を備えている。場合によっては、前記システムは、流体にマイクロ流体デバイスを通過させるように構成されているマイクロ流体要素を備えている。
本開示の態様は、本明細書に記載されているマイクロ流体デバイスと、標識が付された結合メンバーとを備えているキットを更に含む。
ある実施形態では、キットは、限定されないが、緩衝液、検出試薬、剥離剤、界面活性剤、リフォールディング試薬及び変性試薬等の１以上の試薬を備えている。
（ａ）は、本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを示す写真図であり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る、充填媒体、分離媒体、タンパク質再生要素及び結合媒体を備えたマイクロ流体デバイスを示す概略図である。 （ａ）は、本開示の実施形態に係る、試料を充填するための注入部、分離のための矩形状のチャンバ、再生のための左サイドチャネル、及び結合（例えば、ブロッティング）のための右サイドチャネルを備えた多次元操作のためのマイクロ流体デバイスを示す概略図であり、（ｂ）〜（ｄ）は、本開示の実施形態に係る、その場所でのタンパク質再生を伴うマイクロ流体ウエスタンブロットプロトコルの概略図を重ねた画像を示す図である。 本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの明視野画像を示す図である。 （ａ）は、本開示の実施形態に係る、異なる濃度のＳＤＳ及び異なるインキュベーション時間で（例えば、異なる変性条件下で）処理した緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の蛍光放出特性を示すグラフであり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る、異なる濃度のＳＤＳ及び異なるインキュベーション時間で（例えば、異なる変性条件下で）処理したＩｇＡの蛍光放出特性を示すグラフである。 本開示の実施形態に係るマイクロ流体ウエスタンブロットデバイスの再生要素及び結合媒体の性能を示し、（ａ）は、再生膜（左）及び結合媒体（右）をパターニングしたマイクロ流体デバイスの明視野画像を示す図であり、（ｂ）は、５％のＳＤＳで処理したＧＦＰの流れの連続的な充填の蛍光画像を示す図であり、（ｃ）は、５％ＳＤＳで処理したＧＦＰの再生要素における再生の蛍光画像を示す図であり、（ｄ）は、再生後の再生要素の界面からのＧＦＰの溶出の蛍光画像を示す図であり、（ｅ）は、再生したＧＦＰの結合媒体への移動の蛍光画像を示す図であり、（ｆ）は、結合媒体に捕捉されたＧＦＰの蛍光画像を示す図であり、（ｇ）は、再生要素の界面で観察されたＧＦＰの再生動態プロファイルを示すグラフであり、（ｈ）は、再生後のＧＦＰのブロッティングプロファイルを示すグラフであり、（ｉ）は、陰性対照のグラフを示し、ＢＳＡの蛍光がその未変性状態と関連しなかったため、５％ＳＤＳで処理したＢＳＡは著しく異なる再生プロファイルを示した。挿入図に示されているように、結合媒体におけるＢＳＡの結合は観察されなかった。 （ａ）は、本開示の実施形態に係る３％ＳＤＳで処理したＧＦＰを未変性ＧＦＰと比較した再生の進行プロファイルを示すグラフであり、ＳＤＳで処理したＧＦＰの蛍光増加は（破線の四角で強調されている）効果的な再生を示し、（ｂ）は、本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスにおけるＧＦＰに関する再生動態を示すグラフであり、（ｃ）は、本開示の実施形態に係る、ＳＤＳ濃度依存性の蛍光回復を観察することによって得られた効果的な再生時間を示すグラフである。 本開示の実施形態に係る、タンパク質の分子量（Ｍｒ）を決定するためのスラブゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ較正曲線を示すグラフである。 マイクロ流体デバイスのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離及び分子量較正曲線を示す。使用したタンパク質標準物質は、１．β−ガラクトシダーゼ（分子量１１４ｋＤａ）、２．ＢＳＡ（分子量６６ｋＤａ）、３．卵白アルブミン（分子量４５ｋＤａ）、４．ＧＦＰ（分子量２７ｋＤａ）、５．トリプシン阻害剤（分子量２１ｋＤａ）であった。（ａ）は、本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを使用した未変性タンパク質ラダー分離の蛍光画像を示す図であり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥラダー分離の蛍光画像を示す図であり、（ｃ）は、本開示の実施形態に係るタンパク質分子量較正曲線を示すグラフである。 本開示の実施形態に係るオンラインタンパク質再生を伴うＧＦＰのマイクロ流体のウエスタンブロッティングを示し、（ａ）は、本開示の実施形態に係る、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、移動、再生及びブロッティングを含む、ＧＦＰのマイクロ流体ウエスタンブロットの一連の蛍光画像を示す図であり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る第１の流路でのＳＤＳ−ＰＡＧＥサイジングから得られた分子量較正曲線を示すグラフであり、（ｃ）は、本開示の実施形態に係るＧＦＰ、ＢＳＡ及びトリプシン阻害剤の再生プロファイルを示すグラフである。 本開示の実施形態に係る、タンパク質の分離、アッセイ中の試料操作、及び固定したレクチンでのプロービングのために構成されたマイクロ流体デバイスを示す概略図であり、Ａは、本開示の実施形態に係るマイクロチャンバを中央に有するガラス製のマイクロ流体デバイスを示す写真図であり、Ｂは、本開示の実施形態に係る、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク質の再生中の精密濾過を介したＳＤＳの希釈、及びストレプトアビジンアクリルアミドに固定したビオチン化レクチンを使用した再生タンパク質のプロービングの３つのアッセイ段階を示す概略図であり、「Ｍｒ」は分子量を表す。Ｃは、本開示の実施形態に係る、分離後のＳＤＳ除去に使用した分子量カットオフ（ＭｒＣＯ）マイクロフィルタを示す顕微鏡写真図であり、Ｄは、本開示の実施形態に係るマイクロチャンバの右側に隣接するマイクロチャネルアレイのストレプトアビジンアクリルアミドに含有されたビオチン化レクチン（又は抗体）を示す概略図である。 本開示の実施形態に係る、オンチップＭｒＣＯマイクロフィルタでの処理中の５％ＳＤＳで処理したＧＦＰの再生を示すグラフであり、Ａは、本開示の実施形態に係る、処理中に二重指数関数にフィッティングさせた蛍光シグナルの時間展開を示すグラフであり、ＧＦＰ濃度は２００ｎＭであった。Ｂは、本発明の実施形態に係る、ＳＤＳ濃度に対する再生半減時間及び蛍光回復を示すグラフである。 本開示の実施形態に係る、アッセイ中の試料取扱及び処理から生じた移動損失を特徴付ける蛍光顕微鏡写真図及びグラフを示す。 本開示の実施形態に係る、ガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質のマイクロ流体ＨＡＡレクチンブロットを示す蛍光顕微鏡写真図及びグラフであり、Ａは、本開示の実施形態に係る、分子量ラダー及び骨髄腫ＩｇＡ１サイジングの２色モニタリングを示す蛍光顕微鏡写真図であり、Ｂは、本開示の実施形態に係る、ガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質のＨＡＡレクチンブロットの時間展開を示す蛍光顕微鏡写真図であり、Ｃは、本開示の実施形態に係る、未変性条件及びＳＤＳ条件下でブロッティング領域に捕捉した骨髄腫ＩｇＡ１の量の比較により、回復した活性の評価を示すグラフであり、Ｄは、本開示の実施形態に係る、陰性対照としてオンライン再生なしの５％ＳＤＳで処理した骨髄腫ＩｇＡ１（緑色）及び分子量ラダー（６８〜２００ｋＤａ、赤色）のＨＡＡブロットを示す蛍光顕微鏡写真図である。 本開示の実施形態に係る濾過膜、ブロッティングゲル、分離ゲル及び充填ゲルを備えたマイクロ流体デバイスを示す写真図である。 本開示の実施形態に係る、Ｖ１〜Ｖ８と呼ばれる貯留部を有するマイクロ流体デバイスを示す写真図である。 （ａ）は、本開示の実施形態に係る分離及び横方向移動プロセス中の、チップチャンバの幾何学的配置内での電場の分布を示すＣＯＭＳＯＬシミュレーションを示す概略図であり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る、（左側の）小さな孔径の濾過膜と（右側の）抗体を有するブロッティング膜とが隣接するマイクロチャンバにおける、５％ＳＤＳで処理したＧＦＰの４ステップでの再生を示す蛍光顕微鏡写真図である。 ＥＬＩＳＡ（図１７の（ａ））及びオンチップレクチンブロッティングゲル（図１７の（ｂ））によって測定されたガラクトース欠損ＩｇＡ１へのＨＡＡの結合の解離定数を示すグラフであり、表面固定によりＥＬＩＳＡによって測定したＫd は７３．１ｎＭであった（図１７の（ａ））。オンチップのレクチンブロッティングゲルを通じて測定したＫd は４７．２ｎＭであった（図１７の（ｂ））。 本開示の実施形態に係る、ブロッティングのための再生移動後の膜界面を示すＣＣＤ画像であり、矢印は、膜界面の位置を示す。横方向移動の後に膜界面で観察されたタンパク質残留物は試料の損失を示した（図１８の（ａ））。再生の最終段階で振動電圧を連続して印加することにより、再生後の試料損失を最小限度に抑えた（図１８の（ｂ））。 本開示の実施形態に係る、表２に関する回帰曲線を示すグラフであり、（ａ）は、３％ＳＤＳ−ＧＦＰに関する回帰曲線を示すグラフであり、（ｂ）は、５％ＳＤＳ−ＧＦＰに関する回帰曲線を示すグラフであり、（ｃ）は、８％ＳＤＳ−ＧＦＰに関する回帰曲線を示すグラフであり、（ｄ）は、１０％ＳＤＳ−ＧＦＰに関する回帰曲線を示すグラフである。 （ａ）は、本開示の実施形態に係るオンチップ再生区画アレイの性能を示すグラフであり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る、陰性対照としての５％ＳＤＳ−ＢＳＡからのオンライン再生進行曲線を示すグラフである。 （ａ）は、エイリアシングが分離分解能を減少させることを示すグラフであり、（ｂ）は、本開示の実施形態に係る高密度のサイドチャネルが、エイリアシング無しに良好に再構成されたシグナルを生成することを示すグラフである。 本開示の実施形態に係るガラス製のチップにおける種々のアレイネットワーク設計の明視野画像を示す図である。各サイドチャネルの幅及び隣接するチャネル間の間隔の両方を調節した。チャネルの幅が約５０μｍであり、矢印によって示されているチャネル間の間隔が１００μｍ、５０μｍ及び１０μｍとして示されているマイクロ流体デバイスを示す図である。 本開示の実施形態に係る複数のモデルタンパク質（５％ＳＤＳで処理されたホスホリラーゼＢ（９６ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）及びトリプシン阻害剤（２１ｋＤａ））に関する統合されたアッセイの時間展開を示す蛍光顕微鏡写真図である。 （ａ）は、異常なグリコシル化、すなわち、ガラクトース欠損変異体（星印によって示されている２つの底部構造）を含むヒトＩｇＡ１のヒンジ領域で可能なＯ−グリカン構造を示す概略図である。Ｏ−グリカン付着の潜在性部位としてのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基も示されている。（ｂ）は、還元ＰＡＧＥ条件と比較した、ガラクトース欠損ＩｇＡ１（−ｇ）骨髄腫タンパク質及び正常ヒト血清由来のＩｇＡ１（＋ｇ）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光画像（図２４の（ｂ）の左）、並びに正常ヒト血清ＩｇＡ１（＋ｇ）と比較したガラクトース欠損ＩｇＡ１（−ｇ）骨髄腫タンパク質のＨＡＡブロッティングの蛍光画像（図２４の（ｂ）の右）を示す。
タンパク質再生要素を備えたマイクロ流体デバイス、及びマイクロ流体デバイスを使用するための方法を提供する。本開示の態様は、第１の流路を有する分離媒体と、分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素とを備えたマイクロ流体デバイスを含む。更に、本マイクロ流体デバイスを使用する方法、並びにマイクロ流体デバイスを備えたシステム及びキットを提供する。本マイクロ流体デバイス、システム及び方法は、診断アッセイ及び検証アッセイを含む様々な異なる用途に使用される。
以下に、主題のマイクロ流体デバイスについてまず詳細に記載する。主題のマイクロ流体デバイスを使用して流体試料中の分析物を検出する方法を更に開示する。更に、主題のマイクロ流体デバイスを備えたシステム及びキットについても記載する。
マイクロ流体デバイス
本開示の態様は、流体試料中の分析物を検出するためのマイクロ流体デバイスを含む。「マイクロ流体デバイス」は、小さな縮尺（例えば、サブミリメートル）に幾何学的に拘束された流体を制御して処理するように構成されているデバイスである。マイクロ流体デバイスの実施形態では、分離媒体及びタンパク質再生要素が備えられている。分離媒体は、試料中の分析物を互いに分離するように構成され得る。分離した分析物をタンパク質再生条件に供することが可能なタンパク質再生要素に、分離した試料を接触させることができる。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは結合媒体を更に備えている。再生した試料を、試料中の１以上の対象となる分析物に特異的に結合する結合媒体に接触させることができる。その後、結合した対象となる１又は複数の分析物を検出することができる。分離媒体、タンパク質再生要素及び結合媒体に関する更なる詳細を以下に述べる。
分離媒体
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは分離媒体を備えている。分離媒体は、試料中の分析物を互いに分離するように構成され得る。場合によっては、分離媒体は、分析物の物理的特性に基づいて試料中の分析物を分離するように構成されている。例えば、分離媒体は、分析物の分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点等に基づいて試料中の分析物を分離するように構成されてもよい。ある場合には、分離媒体は、分析物の分子量に基づいて試料中の分析物を分離するように構成されている。場合によっては、分離媒体は、分析物の等電点（例えば、等電点焦点）に基づいて試料中の分析物を分離するように構成されている。分離媒体は、試料中の分析物を分析物の異なる検出可能なバンドに分離するように構成されてもよい。「バンド」とは、分析物の濃度が周囲の領域よりも著しく高い異なる検出可能な領域又は区域を意味する。分析物の各バンドは１又は複数の分析物を含んでもよく、分析物の単一のバンド中の各分析物は、上述したように略同様の物理的特性を有する。
ある実施形態では、分離媒体は、試料が分離媒体を横切るときに試料中の分析物を分離するように構成されている。場合によっては、分離媒体は、試料が分離媒体を通って流れるときに試料中の分析物を分離するように構成されている。分離媒体の態様は、分離媒体が方向軸を有する流路を有することを含む。「流路」とは、流体試料が移動するときに進む方向を意味する。場合によっては、流路は、試料が分離媒体等の媒体を横切るときに試料が進む方向である。分離媒体は、方向軸を有する流路を有してもよい。ある実施形態では、分離流路の方向軸は分離媒体の長さ方向に揃えられている。これらの実施形態では、試料は、分離媒体の分離流路の方向に分離媒体を横切る（例えば、試料は、分離媒体の長さ方向に沿って分離媒体を横切ってもよい）。場合によっては、分離媒体の長さは、分離媒体の幅よりも大きく、例えば、分離媒体の幅の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍等である。場合によっては、分離媒体の分離流路は、分離媒体を含む領域によって画定されている。例えば、マイクロ流体デバイスはチャンバを備えてもよい。チャンバは、分離媒体を含む分離領域を含んでもよい。分離媒体は、試料がチャンバを通って流れるときに試料が分離媒体を横切るようにチャンバ内に含まれてもよい。場合によっては、チャンバは分離媒体及び充填媒体を含んでいる。チャンバは更に、タンパク質再生要素と結合媒体を含む結合領域とを含んでもよい。他の実施形態では、タンパク質再生要素及び結合媒体は、分離媒体と流体連通するサイドチャネルに含まれている。マイクロ流体デバイスのこれらの態様及び更なる態様を、以下の部分に更に詳細に説明する。
ある実施形態では、分離媒体は、ポリマーゲル等のポリマーを含んでいる。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に好適なゲルであってもよい。ポリマーゲルには、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等が含まれるが、これらに限定されない。分離媒体の分解能は、限定されないが、孔径、総ポリマー含有量（例えば、総アクリルアミド含有量、％Ｔ）、架橋剤の濃度（例えば、ビスアクリルアミド濃度、％Ｃ）、印加される電場、アッセイ時間等の種々の要因に依存してもよい。例えば、分離媒体の分解能は分離媒体の孔径に依存してもよい。場合によっては、孔径は、分離媒体中の総ポリマー含有量及び／又は分離媒体中の架橋剤の濃度に依存する。ある場合には、分離媒体は、分子量の差が５０，０００Ｄａ以下、２５，０００Ｄａ以下又は１０，０００Ｄａ以下、例えば５，０００Ｄａ以下、２，０００Ｄａ以下又は１，０００Ｄａ以下を含む７，０００Ｄａ以下、例えば５００Ｄａ以下又は１００Ｄａ以下である分析物を分解するように構成されている。場合によっては、分離媒体は、総アクリルアミド含有量Ｔ（Ｔ＝アクリルアミド及びビスアクリルアミド単量体の総濃度）が１〜２０％Ｔ、例えば１〜１０％Ｔを含む１〜１５％Ｔ、例えば３〜７％Ｔの範囲であるポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合によっては、分離媒体は５％Ｔの総アクリルアミド含有量を有する。ある場合には、分離媒体は、架橋剤濃度Ｃ（Ｃ＝架橋剤の濃度）が１〜１０％Ｃ、例えば１〜５％Ｃを含む１〜７％Ｃであるポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合によっては、分離媒体は３％Ｃの架橋剤濃度を有する。
ある実施形態では、分離媒体は緩衝液を含んでいる。緩衝液は、ゲル電気泳動に使用されるあらゆる便利な緩衝液であってもよい。ある実施形態では、分離媒体は、トリス−グリシン緩衝液等の緩衝液を含んでいる。例えば、緩衝液はトリス及びグリシンの混合物を含んでもよい。トリシン−アルギニン緩衝液等の他の緩衝液も、限定されないが、必要に応じて使用されてもよい。
場合によっては、緩衝液は界面活性剤を含んでいる。ある場合には、界面活性剤は、試料中の分析物に略同様の電荷対質量比を与えるように構成されている。略同様の電荷対質量比を有する分析物は、試料中の分析物の分子量に基づいて分離媒体の１以上のバンドへの分析物の分離を容易にする。緩衝液のある実施形態では、陰イオン界面活性剤が含まれてもよい。ある場合には、界面活性剤は、試料中の分析物に負の電荷を与えるように構成されている陰イオン界面活性剤である。例えば、界面活性剤は、限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の陰イオン界面活性剤であってもよい。ある場合には、界面活性剤は、試料中の分析物に電荷、例えば正の電荷を与えるように構成されている陽イオン界面活性剤である。例えば、界面活性剤は、試料中の分析物に正の電荷を与えるように構成されている陽イオン界面活性剤であってもよい。ある実施形態では、陽イオン界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）であり、臭化セトリモニウム又は臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムとしても知られている。
タンパク質再生要素
上述したように、本開示の実施形態では、マイクロ流体デバイスはタンパク質再生要素を備えている。タンパク質再生要素とは、タンパク質を変性状態から再生するように、例えば三次構造が復元されるようにタンパク質をリフォールディングするように機能するデバイスの要素又は部分を意味する。あらゆる便利なタンパク質再生要素を採用することができる。例えば、タンパク質の再生は、分化的移動及び拡散、透析、希釈、サイズ排除膜、フィルタ、イオン交換材料若しくはカラム、再生緩衝液、又は他のリフォールディング関連化学物質に基づいてもよい。ある実施形態では、タンパク質再生要素は、変性したタンパク質を再生試薬と接触させるように構成されている。変性したタンパク質を再生試薬と接触させることにより、タンパク質の再生を促進することができる。ある場合には、再生要素は、変性したタンパク質と会合した変性試薬を除去するように構成されている。変性したタンパク質から以前に会合した変性試薬を除去することによりタンパク質を再生させてもよい。
場合によっては、再生要素は、界面活性剤分子とタンパク質との以前の会合がタンパク質の変性をもたらしている場合、タンパク質と会合した界面活性剤分子等の変性試薬を除去するように構成されている。このようにして、場合によっては、再生要素は、三次構造が復元されるという点でタンパク質を再生することができるようにタンパク質−界面活性剤分子の複合体中のタンパク質から界面活性剤分子を分離するように構成されている。場合によっては、三次構造は、タンパク質の活性の復元によって復元される。
ある実施形態では、タンパク質再生要素は、分化的移動及び拡散、透析、希釈、サイズ排除膜、濾過、イオン交換材料又はカラムに基づいて、タンパク質と会合した変性試薬を除去するように構成されている。場合によっては、タンパク質再生要素はタンパク質再生膜である。タンパク質再生膜は、タンパク質と会合した界面活性剤分子を除去するように構成され得る。例えば、タンパク質再生膜はサイズ排除膜であってもよい。サイズ排除膜は、試料がサイズ排除膜を通って流れるときに試料中の要素をそのサイズに基づいて分離するように構成され得る。ある場合には、サイズ排除膜は、試料中の高分子量の要素を試料中の低分子量の要素から分離するように構成されている。例えば、サイズ排除膜は、サイズ排除膜の孔径より大きいサイズを有する試料中の要素（例えば、タンパク質）を保持して、より大きなサイズの要素が実質的にサイズ排除膜を通過しないようにして、その孔径よりも小さいサイズを有する要素（例えば、界面活性剤分子）がサイズ排除膜を通過して、サイズ排除膜により保持されるタンパク質から洗い流されることを可能にするように構成されている孔径を有してもよい。ある場合には、サイズ排除膜の孔径は、界面活性剤分子の平均サイズがサイズ排除膜の孔径より小さく、試料中のタンパク質の平均サイズがサイズ排除膜の孔径より大きいように、試料中の界面活性剤分子のサイズとタンパク質のサイズとの間である。タンパク質再生膜の実施形態では、遊離染料及び塩等の他の小分子からタンパク質を分離するように構成されてもよい。
ある場合には、タンパク質再生膜は、サブナノ細孔のゲル膜である。「サブナノ細孔」とは、ゲル膜が、ナノメートルサイズの孔径又は更に小さい孔径の細孔を有することを意味する。サブナノ細孔のゲル膜は、ある実施形態では、小さな界面活性剤分子、例えば５００ダルトン以下又は３００ダルトン以下等の１０００ダルトン以下の分子量を有する分子の通過を可能にするが、より大きな分子、例えば１００，０００ダルトン以上を含む１０，０００ダルトン以上等の５０００ダルトン以上の分子量を有する分子の通過を阻害するために十分なサイズを有する細孔を有する。このゲル膜の構造は多様であってもよいが、場合によっては、ゲル膜は、所望の孔径を有するのに十分な単量体（例えば、アクリルアミド）濃度を有する前駆体から重合された膜であり、その場合、単量体濃度は、３０％Ｔ以上、３５％Ｔ以上又は４０％Ｔ以上、例えば４５％Ｔ以上、例えば５０％Ｔ以上であってもよい。場合によっては、単量体濃度は、４５％Ｔ等の４０〜５０％Ｔの範囲である。架橋剤の濃度も多様であってもよく、場合によっては、１％Ｃ以上又は２％Ｃ以上、例えば４％Ｃ以上を含む３％Ｃ以上、例えば５％Ｃ以上、例えば７％Ｃ以上又は１０％Ｃ以上であってもよい。ある場合には、架橋剤の濃度は、５％Ｃ等の１〜１０％Ｃの範囲である。国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３１４号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８５９０号明細書に記載のものを含むがこれらに限定されないあらゆる便利な単量体及び架橋剤を採用してもよく、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
結合媒体
マイクロ流体デバイスの態様は、結合媒体を含む。ある実施形態では、結合媒体は、対象となる分析物に結合して分析物を保持するように構成され得る。場合によっては、結合媒体に結合した分析物は分析物の検出を容易にする。結合媒体は、限定されないが、共有結合、イオン結合、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（例えば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用、それらの組み合わせ等の、結合媒体と試料中の対象となる分析物との様々な結合相互作用のうちの１以上に基づいて対象となる分析物に結合するように構成されてもよい。
ある場合には、結合媒体は、ポリマーゲル又はポリマーモノリス等のポリマーを含んでいる。モノリスとは、単一の連続的な構造を意味する。モノリスは、同一の物理的組成及び化学的組成を有する単一領域を含んでもよく、又は物理的組成及び化学的組成が異なる２以上の領域を含んでもよい。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に好適なゲルであってもよい。ポリマーゲルは、限定されないが、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等を含んでもよい。ポリマーゲルは、限定されないが、アクリレートポリマー、アルキルアクリレートポリマー、アルキルアルキルアクリレートポリマー、そのコポリマー等のポリマーを含んでもよい。場合によっては、結合媒体は、総アクリルアミド含有量Ｔが１〜２０％Ｔ、例えば１〜１０％Ｔを含む１〜１５％Ｔ、例えば３〜７％Ｔの範囲であるポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合によっては、結合媒体は５％Ｔの総アクリルアミド含有量を有する。ある場合には、結合媒体は、架橋剤濃度Ｃが１〜１０％Ｃ、例えば１〜５％Ｃを含む１〜７％Ｃの範囲であるポリアクリルアミドゲルを含んでいる。場合によっては、分離媒体は３％Ｃの架橋剤濃度を有する。
ある実施形態では、結合媒体は結合メンバーを含んでいる。結合メンバーは、試料中の対象となる分析物に結合して分析物を保持するように構成され得る。例えば、結合メンバーは、試料中のタンパク質と特異的に結合する等、試料中の分析物と特異的に結合するように構成され得る。ある実施形態では、結合メンバーは支持体と安定して会合している。「安定して会合する」とは、ある部分が、標準的な条件下で別の部分若しくは構造体と結合するか又は会合していることを意味する。ある場合には、支持体は、上述したようなポリマーゲルである。そのため、ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、本明細書に記載されているように、結合媒体及び結合メンバーの両方を備えている。結合メンバーと支持体との結合には、共有結合及び非共有相互作用が含まれることができ、例えば、限定されないが、イオン結合、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（例えば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用等が含まれることができる。ある実施形態では、結合メンバーは、支持体に共有結合してもよく、例えば、支持体に架橋されてもよく又は共重合されてもよい。例えば、結合メンバーは、例えば限定されないが、受容体／リガンド結合対、受容体のリガンド結合部分、抗体／抗原結合対、抗体の抗原結合フラグメント、ハプテン、レクチン／炭水化物結合対、酵素／基質結合対、ビオチン／アビジン結合対、ビオチン／ストレプトアビジン結合対、ジゴキシン／抗ジゴキシン結合対、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマー結合対、ペプチドアプタマー結合対等の連結基によって支持体に結合してもよい。場合によっては、結合メンバーは、ビオチン／ストレプトアビジン又はビオチン／アビジン結合対によって支持体に結合している。上述したように、支持体に結合した結合メンバーは、対象となる分析物に特異的に結合するように構成され得る。このようにして、支持体に結合した結合メンバーへの対象となる分析物の特異的な結合により、対象となる分析物を支持体に間接的に結合させることができる。対象となる分析物の支持体への結合は、分析物を支持体と安定して会合させ、従って、対象となる分析物の検出を促進することができる。
結合メンバーは、標的とされているタンパク質、糖、核酸配列又は生体高分子（例えば、対象となる分析物）に特異的に結合する任意の分子であってもよい。分析物の性質に応じて、結合メンバーは、限定されないが、（ａ）タンパク質及びペプチドを検出するための、ペプチド分析物のエピトープに対する抗体、（ｂ）グリコシル化タンパク質の糖若しくは炭水化物に特異的に結合するレクチン、（ｃ）核酸を検出するための、標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の固有領域に相補的な一本鎖ＤＮＡ、又は（ｄ）特異的結合対のメンバー等の任意の認識分子であり得る。例えば、好適な特異的結合対には、限定されないが、抗体／抗原対のメンバー、レクチン／炭水化物対のメンバー、受容体／リガンド対、受容体のリガンド結合部分、抗体の抗原結合フラグメント、ハプテン、酵素／基質対のメンバー、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシン／抗ジゴキシン、ＤＮＡ又はＲＮＡアプタマー結合対のメンバー、ペプチドアプタマー結合対のメンバー等が含まれる。
場合によっては、結合メンバーは、タンパク質性結合メンバーである。例えば、結合メンバーは、ペプチド系又はタンパク質系の結合メンバーを形成すべくアミノ酸から構成されてもよい。ある実施形態では、タンパク質性結合メンバーは、標的とされているタンパク質、糖、核酸配列、生体高分子等に特異的に結合することができる。例えば、タンパク質性結合メンバーは、限定されないが、抗体、抗体フラグメント、レクチン等を含んでもよい。ある実施形態では、タンパク質性結合メンバーは抗体又はそのフラグメントである。抗体又は抗体フラグメントは、対象となる分析物上の抗原に特異的に結合し得る。ある実施形態では、タンパク質性結合メンバーはレクチンである。レクチンは、標的タンパク質のグリコシル化部分等の１以上の糖又は炭水化物に特異的に結合することができる。
ある実施形態では、２以上の異なる結合メンバーが、結合媒体と安定して会合する。２以上の異なる結合メンバーは、同一の分析物又は異なる分析物に特異的に結合し得る。場合によっては、２以上の異なる結合メンバーは、同じ分析物に特異的に結合し得る。例えば、２以上の異なる結合メンバーは、同じ分析物上の異なるエピトープに特異的な異なる抗体を含み得る。他の例では、２以上の異なる結合メンバーは、異なる分析物に特異的に結合し得る。例えば、２以上の結合メンバーには、異なる分析物上のエピトープに特異的な異なる抗体、又は異なる糖若しくは糖誘導体に特異的な異なるレクチンが含まれ得る。各種類の結合メンバーは、結合媒体の同じ領域又は結合媒体内の異なる領域に結合されてもよい。場合によっては、各種類の結合メンバーは結合媒体の異なる領域に結合される。例えば、マイクロ流体デバイスのサイドチャネルに結合媒体を含む実施形態では、各サイドチャネルが異なる結合メンバーを含んでもよい。異なる結合メンバーが結合媒体の異なる領域に結合する実施形態では、試料中の異なる分析物の検出が促進され、異なる分析物が夫々、結合媒体の異なる領域における対応する結合メンバーに結合される。
上述したように、結合媒体は、対象となる分析物に特異的に結合する結合メンバーを含んでもよい。対象とされない分析物は、結合メンバーによって結合されず、結合メンバーに結合することなく結合媒体を横切ってもよい。ある実施形態では、結合媒体に結合することなく結合媒体を横切る対象とされない分析物は、結合媒体から離して移動させてもよい。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、対象とされない分析物を廃液貯留部に導くように構成されている。場合によっては、マイクロ流体デバイスが、結合メンバーに結合することなく結合媒体を通過する分析物を更なる分析のための二次分析デバイスに導くべく構成されているように、マイクロ流体デバイスは二次分析デバイスと流体連通する。二次分析デバイスは、限定されないが、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイデバイス等を含み得る。場合によっては、二次分析デバイスは、マイクロ流体デバイスと同じ基板上に含まれている。これらの実施形態では、マイクロ流体デバイス及び二次分析デバイスは、１以上の異なる分析技術により試料を分析するために、単一の基板上に設けられてもよい。ある実施形態では、二次分析デバイスは、マイクロ流体デバイス及び１以上の別個の二次分析デバイスを備えているシステムの一部として含まれている。上述したように、マイクロ流体デバイス及び二次分析デバイスは、マイクロ流体デバイスを通過する分析物を、分析物の更なる特徴付けのために二次分析デバイスに導くように互いに流体連通してもよい。
ある実施形態では、結合媒体は汎捕捉性の結合媒体である。「汎捕捉性」とは、結合媒体が試料中の分析物に非特異的に結合することを意味する。例えば、汎捕捉性の結合媒体は、試料中のタンパク質に非特異的に結合し得る。非特異的結合は、試料中の略全ての分析物との結合を含んでもよい。場合によっては、非特異的結合は、試料中の分析物と汎捕捉性の結合媒体との結合相互作用に基づいている。結合相互作用は、限定されないが、共有結合、イオン結合、静電相互作用、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力（例えば、ロンドン分散力）、双極子間相互作用、それらの組み合わせ等の、汎捕捉性の結合媒体と試料中の分析物との様々な結合相互作用のうちの１以上に基づくものであり得る。結合相互作用は、（例えば、共有結合等による結合相互作用を克服するために比較的大量のエネルギーを必要とする）実質的に永久的なものであってもよく、又は（例えば、双極子間相互作用等による結合相互作用を阻害するために比較的少量のエネルギーを必要とする）可逆的なものであってもよい。
ある実施形態では、汎捕捉性の結合媒体は、静電相互作用によって試料中の分析物に非特異的に結合するように構成されている。場合によっては、静電相互作用には、２つの反対に帯電したイオン間の引力による結合相互作用が含まれている。例えば、静電相互作用は、正に帯電した分析物と負に帯電した結合媒体との間に存在し得る。同様に、静電相互作用は、負に帯電した分析物と正に帯電した結合媒体との間に存在し得る。ある場合には、結合媒体は、負の電荷を有するように構成されている。そのため、負に帯電した結合媒体は、正に帯電した分析物との静電結合相互作用を有するように構成されてもよい。他の場合には、結合媒体は、正の電荷を有するように構成されている。そのため、正に帯電した結合媒体は、負に帯電した分析物との静電相互作用を有するように構成されてもよい。汎捕捉性の結合媒体、並びにこのような汎捕捉性の結合媒体に有用な緩衝液、界面活性剤及び他の試薬の更なる態様は、２０１１年１１月２２日に出願された米国特許出願第１３／３０３，０４７号明細書に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
マイクロ流体デバイスの実施形態の更なる態様
マイクロ流体デバイスの態様は、分離媒体がタンパク質再生要素（例えば、サブナノ細孔のゲル膜）と流体連通する実施形態を含む。マイクロ流体デバイスは、まず試料に分離媒体を通過させ、分離した試料を生成するように構成されてもよい。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、再生要素が分離媒体と電気泳動により連通するように、分離媒体及び再生要素が互いに直接流体連通すべく構成されている。例えば、分離媒体は再生要素と直接接してもよい。場合によっては、分離媒体及び再生要素は互いに結合されており、例えば、隣接して連続的に光パターニングされる。分離媒体が再生要素と直接流体連通する実施形態では、試料の要素の損失を最小限度に抑えて、分離媒体から再生要素への試料の要素の移動が促進され得る。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、試料の要素が分離媒体から再生要素に定量的に且つ再現性よく移動するように構成されている。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、分離した試料を分離媒体から再生要素に導くように構成されている。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、試料又は分析物が分離媒体から再生要素に直接横切ることができるように、分離媒体及び再生要素が互いに直接流体連通すべく構成されている。上述したように、再生要素は、分離した試料中のタンパク質を再生条件に供するように構成されてもよい。例えば、再生要素は、再生膜の孔径よりも大きい平均サイズを有するタンパク質を、分離した試料中に保持する一方、再生膜の孔径よりも小さい平均サイズを有する試料の要素（例えば、界面活性剤分子）が再生膜を通過し得るように構成されてもよい。場合によっては、試料中のタンパク質から界面活性剤分子（例えば、ＳＤＳ）を除去することにより、タンパク質の再生が促進される。
場合によっては、分離媒体は更に結合媒体とも流体連通する。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、結合媒体が分離媒体と電気泳動により連通するように、分離媒体及び結合媒体が互いに直接流体連通すべく構成されている。例えば、分離媒体は結合媒体と直接接してもよい。場合によっては、分離媒体及び結合媒体は互いに結合されており、例えば、隣接して連続的に光パターニングされる。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、再生した試料を再生要素から結合媒体に導くように構成されている。例えば、マイクロ流体デバイスは、再生要素が分離媒体の第１の側と隣接し、結合媒体が、第１の側の反対側の分離媒体の第２の側と隣接するように構成されてもよい。分離媒体が再生要素及び結合媒体の両方と直接流体連通する実施形態では、移動中の試料の要素の損失を最小限度に抑えて、分離媒体から再生要素へ、及び再生要素から結合媒体への試料の要素の移動が促進され得る。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、試料の要素が、分離媒体から再生要素へ、及び再生要素から結合媒体へ定量的に且つ再現性よく移動されるように構成されている。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、多方向マイクロ流体デバイスである。「多方向」とは、２以上の方向、３以上の方向、４以上の方向等の１より多くの方向を意味する。ある場合には、２以上の方向が共平面であるように、２以上の方向が単一の平面に含まれている。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、２以上の方向、３以上の方向、４以上の方向等の１より多くの方向に流体を導くように構成されている（例えば、マイクロ流体デバイスは多方向性である）。場合によっては、マイクロ流体デバイスが平面であるように、マイクロ流体デバイスは基板に含まれている。マイクロ流体デバイスは、その面内で複数の方向に流体を導くように構成されてもよい。
マイクロ流体デバイスの態様は、第１の流路（例えば、分離流路）を有する分離媒体と、分離媒体と流体連通する再生要素とを含む。分離媒体は第１の方向軸を有する第１の流路を含んでもよく、第１の方向軸は、試料が分離媒体を横切るときに試料が進む方向に相当する。再生要素は、第２の方向軸を有する第２の流路を含んでもよい。場合によっては、第２の流路は、試料が分離媒体から再生要素（例えば、再生膜）へと横切るときに試料が進む方向である。再生膜の孔径よりも小さい試料の要素は、第２の流路の方向に再生膜を横切ることができる。例えば、界面活性剤分子等の低分子量の試料の要素は、再生膜を横切る（例えば、通過する）ことができる。再生膜の孔径よりも大きい試料の要素は再生膜によって保持され得る。例えば、タンパク質等の高分子量の試料の要素は再生膜によって保持され得る。
再生要素は、分離媒体の方向軸とは異なる方向軸を有してもよい。場合によっては、分離媒体の第１の方向軸は、再生要素の第２の方向軸とは異なる方向に揃えられている。第１の方向軸が、第２の方向軸とは異なる方向に揃えられている場合、マイクロ流体デバイスは、上述したように多次元（例えば、多方向）マイクロ流体デバイスである。例えば、第２の方向軸は、第１の方向軸に対して１８０度以下の角度であってもよく、例えば、第１の方向軸に対して１２０度以下、９０度以下、６０度以下、４５度以下又は３０度以下を含む１５０度以下、１３５度以下の角度である。ある実施形態では、第２の方向軸は第１の方向軸と直交している。
ある実施形態では、結合媒体は、方向軸を有する第３の流路（例えば、標識付与流路）を有する。場合によっては、第３の流路は、試料又は分析物が再生要素から結合媒体へと横切るときに試料が進む方向である。結合媒体は、再生要素の流路と同じか又は異なる方向軸の流路を有してもよい。例えば、上述したように、タンパク質再生要素は、第２の方向軸の流路を有し得る。ある場合には、結合媒体は、タンパク質再生要素の第２の方向軸に沿って設けられるか、又は第２の方向軸に略平行である方向軸の流路を有してもよい。場合によっては、再生要素の流路及び結合媒体の流路は、同じ方向軸に沿って設けられているが、逆の流れ方向を有する。例えば、再生要素は、第１の流れ方向を有する第２の方向軸に沿って設けられている流路を有し、結合媒体は、第２の方向軸に沿って設けられているが、第１の流れ方向とは逆方向の流れ方向を有する流路を有してもよい。上述したように、本マイクロ流体デバイスは、再生要素が分離媒体の第１の側と隣接し、結合媒体が第１の側の反対側の分離媒体の第２の側と隣接するように構成されてもよい。これらの実施形態では、本マイクロ流体デバイスは、第２の方向軸に沿って分離媒体から再生要素に向かって試料を導き、その後同じ第２の方向軸に沿って逆方向に結合媒体に向かって試料を導くように構成されてもよい。
場合によっては、マイクロ流体デバイスは、２以上の方向の異なる流れ場に試料を晒すように構成されている。「流れ場」とは、要素が略同一の方向に領域を横切る領域を意味する。例えば、流れ場は、移動性の要素が媒体を通って略同一の方向に移動する領域を含んでもよい。流れ場は、分離媒体、再生要素、結合媒体、充填媒体等の領域を含んでもよく、緩衝液、分析物、試薬等の要素が領域を通って略同一の方向に移動する。流れ場は、印加される電場、圧力差、電気浸透等によって誘導されてもよい。ある実施形態では、２以上の流れ場は方向が異なってもよい。例えば、第１の流れ場は、分離媒体の分離流路の方向軸に沿って設けられてもよい。第１の流れ場は、分離流路に沿って試料又は分析物に分離媒体を通過させるように構成されてもよい。第２の流れ場が再生要素の流路の方向軸に沿って設けられてもよい。場合によっては、第２の流れ場は、再生要素の流路に沿って分離媒体から再生要素に試料又は分析物を導くように構成されている。例えば、第２の流れ場は、分離媒体によって分離されたタンパク質の略同一の分離状態を維持しながら、分離媒体によって分離されたタンパク質を再生要素に導くように構成されてもよい。第２の流れ場は、試料中のタンパク質が再生要素と接して再生要素によって保持されるように、試料又は分析物を分離媒体から再生要素に導くように構成されてもよい。上述したように、ある場合には、再生要素の流路の方向軸は、分離媒体の流路の方向軸と直交している。これらの場合には、第２の流れ場は、第１の流れ場と直交してもよい。
場合によっては、マイクロ流体デバイスは、試料を第３の流れ場に晒すように構成されている。第３の流れ場は、結合媒体の流路の方向軸に沿って設けられてもよい。ある場合には、この方向軸は、再生要素の方向軸と一致しているか、又は再生要素の方向軸に略平行である。場合によっては、第３の流れ場は、結合媒体の流路に沿って再生要素から結合媒体に試料又は分析物を導くように構成されている。例えば、第３の流れ場は、分離媒体によって分離されたタンパク質の略同一の分離状態を維持しながら、分離媒体によって分離されて再生要素によって再生されたタンパク質を結合媒体に導くように構成されてもよい。第３の流れ場は、試料中の１以上の対象となる分析物が結合媒体と接して結合媒体に結合するように、再生要素から結合媒体に試料又は分析物を導くように構成されてもよい。上述したように、ある場合には、結合媒体の流路の方向軸は、再生要素の流路の方向軸と平行である。これらの場合には、第３の流れ場は、第２の流れ場と平行であるが、方向が逆であり得る。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、２以上の方向の異なる電場に試料を晒すように構成されている。電場は、マイクロ流体デバイスを通る試料の移動（例えば、マイクロ流体デバイスの一の領域からマイクロ流体デバイスの別の領域への試料の動電的移動）を促進することができる。電場は更に、上述したように、電気泳動（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ））による試料中の分析物の分離を促進することができる。例えば、電場は、マイクロ流体デバイスの分離媒体を試料中の分析物に通過させるように構成されてもよい。電場は、分析物の物理的特性に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成されてもよい。例えば、電場は、分析物の分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点等に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成されてもよい。ある場合には、電場は、分析物の分子量に基づく試料中の分析物の分離を促進するように構成されている。
ある実施形態では、２以上の電場の方向が異なってもよい。例えば、第１の電場が、分離媒体の分離流路の方向軸に沿って設けられてもよい。第１の電場は、分離流路に沿って試料又は分析物に分離媒体を通過させるように構成されてもよい。第２の電場が、再生要素の流路の方向軸に沿って設けられてもよい。場合によっては、第２の電場は、再生要素の流路に沿って分離媒体から再生要素に試料又は分析物を導くように構成されている。第２の電場は、試料中のタンパク質が再生要素と接して再生要素によって保持されるように、分離媒体から再生要素に分析物を導くように構成されてもよい。上述したように、ある場合には、再生要素の流路の方向軸は、分離流路の方向軸と直交している。これらの場合には、第２の電場は第１の電場と直交してもよい。
ある実施形態では、第３の電場は、結合媒体の流路の方向軸に沿って設けられてもよい。場合によっては、第３の電場は、結合媒体の流路に沿って再生要素から結合媒体に試料又は分析物を導くように構成されている。第３の電場は、分析物が結合媒体と接して結合媒体に結合するように、再生要素から結合媒体に分析物を導くべく構成されてもよい。上述したように、ある場合には、結合媒体の流路の方向軸は、再生要素の流路の方向軸と平行である。これらの場合には、第３の電場は、第２の電場と平行であるが、方向が逆であり得る。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、電場を発生するように構成されている１以上の電場発生器を備えている。電場発生器は、分離媒体、再生要素、結合媒体、充填媒体等のうちの１以上のマイクロ流体デバイスの種々の領域に電場を印加するように構成されてもよい。例えば、電場発生器は、マイクロ流体デバイスの１以上のマイクロ流体サイドチャネル等のマイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルに電場を印加するように構成されてもよい。電場発生器は、マイクロ流体デバイスの種々の媒体を通して試料中の分析物及び要素を動電的に運ぶように構成されてもよい。ある場合には、電場発生器は、マイクロ流体デバイスの近傍にあってもよく、例えば、マイクロ流体デバイスに配置されてもよい。場合によっては、電場発生器は、マイクロ流体デバイスから離れて配置されている。例えば、電場発生器は、以下により詳細に記載するように、分析物を検出するためのシステム内に組み込まれてもよい。
マイクロ流体デバイスの実施形態では、マイクロ流体デバイスは、マイクロ流体デバイスに使用されるアッセイ条件、試料、緩衝液、試薬等に適合するあらゆる好適な材料から作製されてもよい。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、主題のマイクロ流体デバイス及び方法に使用される試料、緩衝液、試薬等に対して不活性な（例えば、分解させないか又は反応しない）材料から作製されている。例えば、マイクロ流体デバイスは、限定されないが、ガラス、石英、ポリマー、エラストマー、紙、それらの組み合わせ等の材料から作製されてもよい。
場合によっては、マイクロ流体デバイスは、１以上の試料注入ポートを備えている。試料注入ポートは、試料がマイクロ流体デバイス内に導入され得るように構成されてもよい。試料注入ポートは分離媒体と流体連通してもよい。場合によっては、試料注入ポートは、分離媒体の上流端部と流体連通する。試料注入ポートは、流体が試料注入ポートから流出するのを防止するような構造を更に含んでもよい。例えば試料注入ポートは、キャップ、弁、シール等を含んでもよく、これらは、例えば、マイクロ流体デバイス内への試料の導入を可能にするように穿孔されるか又は開放されることができ、その後、試料及び／又は緩衝液を含む流体が試料注入ポートから流出するのを実質的に防止するように再密封されるか又は閉鎖されることができる。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは略透明である。「透明」とは、ある物質が、その物質に可視光を透過させることを意味する。ある実施形態では、透明なマイクロ流体デバイスは、結合媒体に結合した分析物、例えば、蛍光標識等の検出可能な標識を含む分析物等の検出を容易にする。場合によっては、マイクロ流体デバイスは略不透明である。「不透明」とは、ある物質が、その物質に可視光を透過させないことを意味する。ある場合には、不透明なマイクロ流体デバイスは、光の存在下で反応するか又は分解する分析物等の感光性の分析物の分析を容易にすることができる。
ある態様では、図１に示されているように、分離媒体及び結合媒体が単一の共通のチャンバ内に含まれている。これらの実施形態では、マイクロ流体デバイスにはチャンバが備えられている。チャンバは、充填媒体、分離媒体、再生要素及び結合媒体を含むことができる。上述したように、分離媒体は、直接的な物理的接触等により、再生要素及び結合媒体と流体連通してもよい。場合によっては、分離媒体は、再生要素及び結合媒体に結合しており、例えば再生要素及び結合媒体と隣接して連続的に光パターニングされる。そのため、チャンバは、互いに流体連通する分離媒体、再生要素及び結合媒体を含むように構成されてもよい。
分離媒体、再生要素及び結合媒体に加えて、チャンバは充填媒体を更に含んでもよい。充填媒体は分離媒体と流体連通してもよい。場合によっては、充填媒体は、分離媒体と電気泳動により連通するように分離媒体と直接的且つ物理的に接している。例えば、充填媒体は、分離媒体と結合してもよく、例えば分離媒体と隣接して連続的に光パターニングされる。充填媒体は、試料が分離媒体と接する前に充填媒体と接するように設けられてもよい。例えば、充填媒体は、分離媒体の一側と隣接してもよい。上述したように、マイクロ流体デバイスは、再生要素が分離媒体の第１の側と隣接し、結合媒体が第１の側の反対側の分離媒体の第２の側と隣接するように構成されてもよい。これらの実施形態では、充填媒体は、第１の側と第２の側との間の分離媒体の第３の側と隣接してもよい。ある実施形態では、充填媒体は、試料の分離媒体との接触を促進する。例えば、充填媒体は、試料が分離媒体と接する前に試料を濃縮するように構成されてもよい。ある実施形態では、充填媒体は、異なる物理的特性及び／又は化学的特性を有する２以上の領域を含んでもよい。充填媒体は、充填領域及び蓄積領域を含んでもよい。充填媒体は、蓄積領域から上流側に充填領域を含むように構成されてもよい。
ある実施形態では、充填媒体は、ポリマーゲル等のポリマーを含んでいる。ポリマーゲルは、ゲル電気泳動に好適なゲルであってもよい。ポリマーゲルは、限定されないが、ポリアクリルアミドゲル、アガロースゲル等を含んでもよい。場合によっては、充填領域は、孔径が大きいポリマーゲルを含んでいる。例えば、充填領域は、総アクリルアミド含有量が５％Ｔ以下、例えば３％Ｔ以下又は２％Ｔ以下を含む４％Ｔ以下であるポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合によっては、充填領域は、３％Ｔの総アクリルアミド含有量を有する。充填領域は、架橋剤濃度が５％Ｃ以下、例えば３％Ｃ以下又は２％Ｃ以下を含む４％Ｃ以下である架橋剤を含んでもよい。場合によっては、充填領域は３％Ｃの架橋剤濃度を有する。場合によっては、例えば、充填媒体の蓄積領域は、試料が分離媒体と接する前に試料を濃縮するように構成されてもよい。蓄積領域は、充填領域よりも孔径が小さいポリマーゲルを含んでもよい。例えば、蓄積領域は、総アクリルアミド含有量が１％〜１０％の範囲、例えば３％〜７％を含む１％〜７％の範囲であるポリアクリルアミドゲルを含んでもよい。場合によっては、蓄積領域は、５％の総アクリルアミド含有量を有する。蓄積領域のより小さな孔径は、蓄積領域を通る試料の電気泳動移動を遅らせ、従って、試料が分離媒体に接する前に試料を濃縮することができる。
ある場合には、チャンバは、充填媒体、分離媒体、再生要素及び結合媒体を含んでいる。チャンバは、上述したように、充填媒体、分離媒体、再生要素及び結合媒体が互いに流体連通するように、充填媒体、分離媒体、再生要素及び結合媒体を含むように構成され得る。例えば、チャンバは、種々の領域を有する連続的なポリマーゲルモノリスを含んでもよい。連続的なポリマーゲルモノリスの各領域は、異なる物理的特性及び／又は化学的特性を有してもよい。連続的なポリマーゲルモノリスは、充填媒体を有する第１の領域、分離媒体を有する第２の領域、再生要素を有する第３の領域、及び結合媒体を有する第４の領域を含み得る。ポリマーゲルモノリスの各領域の流路は、試料が、まず充填媒体に接し、次いで分離媒体に接し、その後再生要素に接して、最後に結合媒体に接するように構成されてもよい。
ある実施形態では、チャンバは、１以上のアレイのサイドチャネルを有して構成されている。例えば、チャンバは、チャンバの第１の側と流体連通する第１アレイのサイドチャネル、及びチャンバの第２の側と流体連通する第２アレイのサイドチャネルを含んでもよい。場合によっては、第１アレイのサイドチャネルは、第２アレイのサイドチャネルの反対側にある。各アレイのサイドチャネルは、夫々がチャンバと流体連通する複数の個別チャネル（例えば、２以上の個別チャネル）を含んでもよい。例えば、各アレイのサイドチャネルは、２以上、４以上、６以上、８以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、５０以上、１００以上等の個別のサイドチャネルを含んでもよい。各サイドチャネルは、１００μｍ以下、例えば５０μｍ以下を含む７５μｍ以下、例えば２５μｍ以下等の幅を有してもよい。各サイドチャネル間の間隔は多様であり、ある実施形態では、２００μｍ以下、例えば５０μｍ以下又は１０μｍ以下を含む１００μｍ以下である。
各アレイのサイドチャネルは、上述したように、マイクロ流体デバイスの異なる領域を含むことができる。例えば、第１アレイのサイドチャネルは再生要素を含んでもよい。これらの実施形態では、第１アレイのサイドチャネルは夫々、再生要素が第１アレイのサイドチャネル内に含まれるように再生要素を含んでもよい。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、第２アレイのサイドチャネルを備えている。第２アレイのサイドチャネルは結合媒体を含んでもよい。これらの実施形態では、第２アレイのサイドチャネルは夫々、結合媒体が第２アレイのサイドチャネル内に含まれるように結合媒体を含んでもよい。上述した構成では、再生要素が第１アレイのサイドチャネル内に含まれ、結合媒体が第２アレイのサイドチャネル内に含まれている。第１アレイ及び第２アレイのサイドチャネルは、上述したように、チャンバの両側に構成され得る。そのため、第１アレイのサイドチャネル及び第２アレイのサイドチャネル間に構成されているチャンバは充填媒体及び分離媒体を含んでおり、上述したように、再生要素及び結合媒体が第１アレイ及び第２アレイのサイドチャネルに夫々含まれている。
マイクロ流体デバイスの様々な種類の領域又は構成の例が、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０３５３１４号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５８５９０号明細書に更に記載されており、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
図１の（ａ）は、マイクロ流体デバイス１０の写真図を示す。図１の（ａ）に示されているように、マイクロ流体デバイス１０はチャンバ１１を備えている。マイクロ流体デバイス１０は更に、流入チャネル１、２、３及び制御チャネル４、５、６、７、８等の種々のマイクロ流体チャネルを備えている。各マイクロ流体チャネルは、対応するアクセスポートを有している。
図２の（ａ）は、分離媒体２２を含むチャンバ２１を備えたマイクロ流体デバイス２０の概略図を示す。分離媒体２２は、再生要素を含有する第１アレイのサイドチャネル２３、及び結合媒体を含有する第２アレイのサイドチャネル２４と流体連通する。第１アレイのサイドチャネル２３は、チャンバ２１の第１の側に配置され、第２アレイのサイドチャネル２４は、チャンバ２１の反対側に配置されている。マイクロ流体デバイス２０は更に、流入チャネル１、２、３及び制御チャネル４、５、６、７、８等の種々のマイクロ流体チャネルを備えている。流入チャネル１、２、３は、チャンバ２１内に流体試料を導くように構成され得る。制御チャネル４、５、６、７、８は、流体（例えば、試薬、標識、緩衝液、洗浄液等）をチャンバ２１内に、及び／又はチャンバ２１から外に導くように構成され得る。更に、制御チャネル４、５、６、７、８は、分離媒体２２、再生要素及び結合媒体を通して試料中の分析物を動電的に運ぶべく、マイクロ流体デバイスの種々の領域に電場を印加するように構成され得る。
方法
本方法の実施形態は、試料中の分析物の有無を判定すること、例えば、試料中の１以上の分析物の有無を判定することを対象としている。本方法のある実施形態では、試料中の１以上の分析物の存在が定性的に又は定量的に判定され得る。定性的な判定には、試料中の分析物の存在に関する単純な存在／非存在の結果がユーザに提供される判定が含まれる。定量的な判定では、試料中の分析物の量に関して、例えば少ない、中程度、多い等の大まかな結果がユーザに提供される半定量的な判定と、分析物の濃度の正確な測定値がユーザに提供される詳細な結果との両方が含まれる。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、試料中の１以上の分析物の有無を検出するように構成されている。本方法は、流体試料をマイクロ流体デバイスに導入することを有する。マイクロ流体デバイスに流体試料を導入することは、試料を分離媒体と接触させることを含んでもよく、又は充填媒体を備えたマイクロ流体デバイスの実施形態では、試料を充填媒体と接触させることを含んでもよい。本方法は、試料に分離媒体を通過させ、分離した試料を生成することを更に有する。場合によっては、分離した試料は、上述したように、試料が分離媒体を横切るときにゲル電気泳動によって生成される。分離した試料は、分析物の異なる検出可能なバンドを含んでもよく、その場合、各バンドは、行われるゲル電気泳動の種類に応じて、分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点等、略同様の特性を有する１以上の分析物を含んでいる。
本方法の態様は、分離した試料を再生要素に移動させることを更に含み得る。ある実施形態では、本方法は、分離した試料全体を再生要素に移動させることを有する。他の場合には、分離した試料中の分析物の特定のバンドが再生要素に選択的に移動されてもよい。ある実施形態では、本方法は、試料中の分離したタンパク質を再生させることを更に有する。分離したタンパク質を再生させることは、分離したタンパク質をマイクロ流体デバイスの再生要素と接触させることを含んでもよい。上述したように、再生要素は、サブナノ細孔のゲル膜を含んでもよい。場合によっては、試料中のタンパク質を再生させることは、界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）等の変性剤からタンパク質を分離することを含む。変性剤及び／又は界面活性剤は、緩衝液又は他の洗浄液が、再生膜によって保持されている試料を通って流れることにより、再生膜によって保持されているタンパク質から洗い流され得る。膜の孔径よりも小さな平均サイズを有する要素（例えば、界面活性剤分子）は、膜の孔径よりも大きな平均サイズを有する要素（例えば、タンパク質）から洗い流され得る。
本方法の態様は更に、再生した試料を結合媒体へ移動させることを含み得る。ある実施形態では、本方法は、再生した試料全体を結合媒体へ移動させることを有する。他の例では、再生した試料中の分析物の特定のバンドが、結合媒体へ選択的に移動されてもよい。場合によっては、本方法は、再生した試料中の分析物を結合媒体と接触させることを有する。上述したように、結合媒体は、分析物に特異的に結合し、従って、結合媒体に対象とされる分析物を保持するように構成され得る。場合によっては、本方法は、再生した試料を結合媒体へ移動させることを有し、移動させることは、結合媒体に結合したタンパク質性結合メンバーに試料を接触させることを含む。上述したように、タンパク質性結合メンバーは、抗体又はそのフラグメント（例えば、抗体のフラグメント）を含んでもよい。場合によっては、タンパク質性結合メンバーはレクチンを含んでいる。
ある実施形態では、本方法は、結合媒体に結合した対象となる分析物を検出することを有する。対象となる分析物の結合媒体への検出可能な結合は、試料中の対象となる分析物の存在を示す。結合媒体を横切り、結合媒体に結合せず、対象とならない分析物は、洗い流されるか、又は二次分析デバイスに移動してもよい。二次分析デバイスは、限定されないが、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイデバイス等である。
場合によっては、結合媒体に結合した対象となる分析物を検出することは、対象となる分析物を、対象となる分析物に特異的に結合するように構成されている標識と接触させることを含む。標識は、標的とされるタンパク質、核酸配列、生体高分子又はその一部分（例えば、対象となる分析物）に特異的に結合するあらゆる分子であってもよい。分析物の性質に応じて、標識は、限定されないが、タンパク質及びペプチドを検出するためのペプチド分析物のエピトープに特異的に結合する抗体、（例えば、グリコシル化タンパク質を検出するために）糖若しくは炭水化物に特異的に結合するレクチン、核酸を検出するための標的ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の固有の領域に相補的な一本鎖ＤＮＡ、又は特異的結合対のメンバー等のあらゆる認識分子であってもよい。例えば、好適な特異的結合対には、限定されないが、受容体／リガンド対のメンバー、受容体のリガンド結合部分、抗体／抗原対のメンバー、抗体の抗原結合フラグメント、ハプテン、レクチン／炭水化物対のメンバー、酵素／基質対のメンバー、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ジゴキシン／抗ジゴキシン、ＤＮＡ又はＲＮＡのアプタマー結合対のメンバー、ペプチドアプタマー結合対のメンバー等が含まれる。ある実施形態では、標識は抗体を含んでいる。場合によっては、標識はレクチンを含んでいる。抗体又はレクチンは、対象となる分析物に特異的に結合することができる。
ある実施形態では、標識は検出可能な標識を含んでいる。検出可能な標識は、本方法及びシステムを使用して検出され得るあらゆる便利な標識を含み、限定されないが、蛍光標識、比色分析標識、化学発光標識、マルチカラー試薬、酵素結合試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、放射性標識、金粒子、磁気標識等を含んでもよい。ある実施形態では、標識は、検出可能な標識と会合した抗体を含んでいる。場合によっては、標識は、検出可能な標識と会合したレクチンを含んでいる。例えば、標識は、対象となる分析物に特異的に結合して蛍光標識が付された抗体又はレクチンを含んでもよい。
主題の方法を用いてアッセイされ得る試料は、単純試料及び複合試料の両方を含んでもよい。単純試料は、対象となる分析物を含む試料であり、対象とならない１以上の分子要素を含んでも含まなくてもよく、これらの対象とならない分子要素の数は少なくてもよく、例えば、１０以下、５以下等である。単純試料は、初期の生体試料、又は、例えば干渉する可能性のある分子要素を試料から除去するために何らかの方法で処理された他の試料を含み得る。「複合試料」とは、対象となる分析物を有しても有さなくてもよいが、多くの異なるタンパク質及び対象とならない他の分子を更に含む試料を意味する。場合によっては、主題の方法でアッセイされる複合試料は、分子構造又は物理的特性（例えば、分子量、サイズ、電荷、等電点等）の点で互いに異なる１０以上、例えば１００以上を含む２０以上、例えば１０3 以上、（１５，０００、２０，０００又は２５，０００以上のような）１０4 以上の別個の（すなわち、異なる）分子要素を含む試料である。
ある実施形態では、対象となる試料は、限定されないが、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取検体、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織（例えば、レーザー・キャプチャー・マイクロダイセクション（ＬＣＭ）から得られた試料）等の生体試料である。試料は、生体試料であってもよく、又はＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及びペプチドを適切に抽出するための従来の方法を使用してヒト、動物、植物、菌類、酵母、細菌、組織培養物、ウイルス培養物又はそれらの組み合わせに由来する生体試料から抽出されてもよい。ある実施形態では、試料は、流体中の分析物の溶液等の流体試料である。流体は、限定されないが、水、緩衝液等の水溶液であってもよい。
上述したように、主題の方法でアッセイされ得る試料は、１以上の対象となる分析物を含み得る。検出可能な分析物の例として、限定されないが、修飾されているか又は修飾されていないタンパク質及びペプチド、例えば、抗体、二重特異性抗体、Ｆａｂ断片、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質、グリコシル化タンパク質、リン酸化タンパク質（リン酸化プロテオミクス）、ペプチドアプタマー、エピトープ等と、核酸、例えば、二本鎖又は一本鎖のＤＮＡ、二本鎖又は一本鎖のＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー等と、阻害因子、活性因子、リガンド等の小分子と、オリゴ糖類又は多糖類と、それらの混合物等とが挙げられる。
場合によっては、対象とならない分析物への結合メンバーの非特異的結合による偽陽性シグナルが最小限度に抑えられる。例えば、対象とならない分析物への結合メンバーの非特異的結合が最小限度に抑えられ、対象とならない分析物は検出されない。対象とならない分析物は、結合媒体（又は結合媒体と会合した結合メンバー）に結合することなく、結合媒体を通って横切ることができる。従って、結合媒体は、対象となる分析物にのみ特異的に結合することができる。対象となる分析物のみへの結合媒体の特異的な結合により、複合試料中の対象となる分析物の特異的な検出が容易になる。
ある実施形態では、本方法は、試料に分離媒体を通過させる前に、試料を濃縮するか、希釈するか、又は緩衝液交換することを有する。試料を濃縮することは、試料を分離媒体に接触させる前に、試料を濃縮媒体に接触させることを含んでもよい。濃縮媒体は、孔径が小さいポリマーゲル、膜（例えば、サイズ排除膜）、それらの組み合わせ等を含んでもよい。試料が分離媒体を通って横切るときに分析物の各分離したバンドがあまり分散しないため、試料を分離媒体と接触させる前に試料を濃縮することによって、分離した試料中の分析物のバンド間の分解能が増大し得る。試料を希釈することは、試料を分離媒体と接触させる前に、試料を追加の緩衝液と接触させることを含んでもよい。試料の緩衝液交換は、試料を分離媒体と接触させる前に、試料を緩衝液交換媒体と接触させることを含んでもよい。緩衝液交換媒体は、試料緩衝液とは異なる緩衝液を含んでもよい。緩衝液交換媒体は、限定されないが、分子篩、多孔性樹脂等を含んでもよい。
ある実施形態では、本方法は、対象となる分析物を検出する前に、結合媒体に結合する分離した分析物をブロッキング剤と接触させることを有する。場合によっては、対象となる分析物を検出する前に、分離した分析物をブロッキング剤と接触させることにより、検出可能な標識の分離した分析物への非特異的結合を最小限度に抑えることが可能になる。例えば、対象となる分析物を検出する前に、分離した分析物をブロッキング剤と接触させることにより、標識が付された抗体又は標識が付されたレクチンの分離した分析物への非特異的結合を最小限度に抑えることが可能になる。ブロッキング剤は、上述したように機能するあらゆるブロッキング剤であってもよく、限定されないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、脱脂粉乳、カゼイン及びゼラチン等を含んでもよい。ある実施形態では、本方法は、本方法の他のステップの前、他のステップの間、及び他のステップの後の種々の時点で行われてもよい任意の洗浄ステップを更に有する。例えば、洗浄ステップは、分離した試料を分離媒体から再生要素に移動させた後、再生した試料を再生要素から結合媒体に移動させた後、分離した試料をブロッキング剤と接触させた後、分離した試料を検出可能な標識と接触させた後等に行われてもよい。
本方法の実施形態は、結合媒体に結合した分析物を剥離することを更に有してもよい。剥離することは、結合した分析物を剥離剤と接触させることを含んでもよい。剥離剤は、分析物と結合媒体との結合相互作用を阻害するように構成されてもよい。場合によっては、剥離剤は、分析物と結合媒体との結合相互作用を阻害し、結合媒体に分析物を解放させる試薬、緩衝液等である。結合媒体から分析物を剥離した後、本方法は、分析物を結合媒体から離して移動させることを有してもよい。例えば、本方法は、限定されないが、紫外分光計、赤外分光計、質量分析計、ＨＰＬＣ、親和性アッセイデバイス等の二次的分析デバイスを用いた二次分析のために又は収集のために、剥離した分析物を結合媒体から下流側に導くことを有してもよい。
ある実施形態では、本方法は、試料中の分析物の一重（ｕｎｉｐｌｅｘ）分析を有する。「一重分析」とは、試料中の一分析物の存在を検出するために試料を分析することを意味する。例えば、試料は、対象となる分析物と対象とならない他の分子要素との混合物を含み得る。場合によっては、本方法は、試料混合物中の対象となる分析物の存在を判定するための試料の一重分析を有する。
ある実施形態は、試料中の２以上の分析物の多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）分析を含む。「多重分析」とは、２以上の分析物が互いに異なる２以上の別個の分析物の存在を判定することを意味する。例えば、分析物は、それらの分子量、サイズ、電荷（例えば、電荷対質量比）、等電点等における検出可能な差異を含み得る。場合によっては、分析物の数は２より多く、例えば４以上、６以上、８以上等、最高２０以上、例えば１００以上を含む５０以上の別個の分析物である。ある実施形態では、本方法は、２〜１００の別個の分析物、例えば４〜２０の別個の分析物を含む４〜５０の別個の分析物の多重分析を有する。ある実施形態では、多重分析は、２以上の異なる検出可能な標識の使用を更に含む。２以上の異なる検出可能な標識は、同一の分析物又は異なる分析物に特異的に結合することができる。場合によっては、２以上の異なる検出可能な標識が、同一の分析物に特異的に結合してもよい。例えば、２以上の異なる検出可能な標識は、同一の分析物上の異なるエピトープに特異的な異なる抗体、又は同一の分析物上の異なる糖に特異的な異なるレクチンを含んでもよい。同一の分析物に特異的な２以上の検出可能な標識を使用することにより、シグナル対ノイズ比を向上させることによって分析物の検出が容易になる。他の場合には、２以上の異なる検出可能な標識は、異なる分析物に特異的に結合することができる。例えば、２以上の検出可能な標識は、異なる分析物上のエピトープに特異的な異なる抗体、又は異なる分析物上の糖に特異的な異なるレクチンを含んでもよい。異なる分析物に夫々特異的な２以上の検出可能な標識を使用することにより、単一のアッセイにおける試料中の２以上の分析物の夫々の検出が容易になる。
ある実施形態では、本方法は自動化された方法である。そのため、本方法は、マイクロ流体デバイス内に試料を導入した後、ユーザとマイクロ流体デバイス及びシステムとのやり取りを最小限度に抑える。例えば、試料に分離媒体を通過させ、分離した試料を生成するステップ、及び分離した試料を結合媒体に移動させるステップは、マイクロ流体デバイス及びシステムによって行われ、ユーザがこれらのステップを手動で行う必要がない。場合によっては、自動化された方法により、全アッセイ時間が短縮され得る。例えば、試料中の分析物の分離及び検出を含む本方法の実施形態は、３０分以内、例えば１５分以内、１０分以内、５分以内、２分以内又は１分以内を含む２０分以内に行われ得る。
図１の（ｂ）及び図２の（ｂ）〜（ｄ）は、試料中の分析物の存在を検出するための方法の一実施形態の概略図を示す。本方法は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、続いて分離後の試料の再生要素への移動、次いで再生後の結合媒体への移動、最後に標識が付された抗体プローブを使用した検出を有する。分析物は、ＰＡＧＥ分離媒体から隣接した再生要素へ動電的に移動され、続いて隣接した結合媒体へ動電的に移動され、特異的親和性相互作用によってその場所で特定される。ステップ１（図２の（ｂ））では、試料を分離媒体と接触させ、試料に分離媒体を通過させるために電場を分離媒体の方向軸に沿って印加し、試料中の種々の分析物が、分離媒体を通じた電気泳動によって分離される（図２の（ｂ））。分離媒体は、第１の方向軸の分離流路を有する。試料に分離媒体を通過させるために、（垂直方向の矢印によって示されている）第１の方向軸に沿って電場を印加する（図２の（ｂ））。分離した分析物を再生要素に導くために、（左向きの水平方向の矢印によって示されている）第２の方向軸に沿って電場を印加することによって、分離した分析物を再生要素に移動させることができる（図２の（ｃ））。再生要素は、界面活性剤分子（例えば、ＳＤＳ）の平均サイズよりも大きな孔径を有するが、試料中のタンパク質の平均サイズよりも小さいサブナノ細孔の膜を含み得る（図１の（ｂ）の左パネル）。膜の孔径よりも小さな平均サイズを有する要素は膜を通過するが、膜の孔径よりも大きな平均サイズを有する要素は膜によって保持される（図１の（ｂ）の左パネル）。界面活性剤分子からのタンパク質の分離により、タンパク質の再生が促進され得る。再生したタンパク質を結合媒体に導くために、第２の方向軸に沿って（右向きの水平方向の矢印によって示されている）逆方向に電場を印加することによって、再生したタンパク質を結合媒体に移動させることができる（図２の（ｄ））。結合媒体は、対象とされる分析物に特異的に結合する結合メンバーを含んでいる（図１（ｂ）の右パネル）。検出可能な標識（例えば、蛍光標識が付された抗体）を、結合媒体に結合した分析物と接触させてもよい。検出可能な標識は、対象とされる分析物（例えば、標的タンパク質）に特異的に結合する。検出可能な標識の陽性検出は、試料中の対象とされる分析物の存在を示す。図１の（ｂ）では、結合メンバーが抗体として示されているが、限定されないが、レクチン、抗体フラグメント、オリゴヌクレオチド等の他の結合メンバーが使用されてもよい。
システム
ある実施形態の態様は、試料中の分析物を検出するためのシステムを含む。場合によっては、システムは、本明細書に記載されているようなマイクロ流体デバイスを備えている。システムは検出器を更に備えてもよい。場合によっては、検出器は、検出可能な標識を検出するように構成されている検出器である。検出器は、アッセイに使用される検出可能な標識を検出するように構成されているあらゆる種類の検出器を含んでもよい。検出器は、検出可能な標識からシグナルを得るために、マイクロ流体デバイスのマイクロチャネルを評価するように構成されてもよい。上述したように、検出可能な標識は、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、マルチカラー試薬、酵素結合試薬、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬、放射性標識、金粒子、磁気標識等であってもよい。場合によっては、検出可能な標識は蛍光標識である。これらの場合には、検出器は、蛍光標識を励起して検出可能な電磁放射線（例えば、可視光等）を蛍光標識に放出させる電磁放射線（例えば、可視光、ＵＶ、Ｘ線等）と蛍光標識を接触させるように構成されてもよい。放出された電磁放射線は、結合媒体に結合した分析物の存在を判定するために、検出器によって検出され得る。
場合によっては、検出器は、上述したように、蛍光標識からの放出を検出するように構成されてもよい。ある場合には、検出器は、光電子増倍管（ＰＭＴ）、電荷結合素子（ＣＣＤ）、増強電荷結合素子（ＩＣＣＤ）、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）センサ、視覚比色読み出し装置、フォトダイオード等を含む。
本開示のシステムは、必要に応じて種々の他の構成要素を備えてもよい。例えば、システムは、マイクロ流体処理要素等の流体処理要素を備えてもよい。流体処理要素は、１以上の流体にマイクロ流体デバイスを通過させるように構成されてもよい。場合によっては、流体処理要素は、限定されないが、試料溶液、緩衝液（例えば、電気泳動緩衝液、洗浄緩衝液、剥離緩衝液等）等の流体を導くように構成されている。ある実施形態では、マイクロ流体処理要素は、流体が分離媒体に接するように、マイクロ流体デバイスの分離媒体に流体を運ぶように構成されている。流体処理要素はマイクロ流体ポンプを含んでもよい。場合によっては、マイクロ流体ポンプは、本明細書に開示されているマイクロ流体デバイス及びシステムを通る流体の圧力駆動によるマイクロ流体処理及び分配のために構成されている。ある場合には、マイクロ流体処理要素は、少量の流体、例えば１ｍＬ以下、例えば１００μＬ以下を含む５００μＬ以下、例えば５０μＬ以下、２５μＬ以下、１０μＬ以下、５μＬ以下又は１μＬ以下の流体を運ぶように構成されている。
ある実施形態では、システムは１以上の電場発生器を備えている。電場発生器は、マイクロ流体デバイスの種々の領域に電場を印加するように構成されてもよい。システムは、試料がマイクロ流体デバイスを通って動電的に運ばれるべく、電場を印加するように構成されてもよい。例えば、電場発生器は、分離媒体に電場を印加するように構成されてもよい。場合によっては、印加される電場は、分離媒体の分離流路の方向軸に揃えられてもよい。そのため、印加される電場は、分離媒体を通して試料中の分析物及び要素を動電的に運ぶように構成されてもよい。ある実施形態では、システムは、試料中の分析物及び／又は要素が分離媒体から再生要素に動電的に運ばれるべく、電場を印加するように構成されている電場発生器を備えている。例えば、印加される電場は、再生要素の流路の方向軸に沿って設けられてもよい。場合によっては、印加される電場は、分離媒体によって分離され選択された分析物を動電的に運ぶように構成されている。分離媒体によって分離された分析物は、再生要素の流路の方向軸に沿って適切な電場を印加することによって再生要素に運ばれてもよい。電場発生器は更に、試料中の分析物が再生要素から結合媒体に動電的に運ばれるべく、電場を印加するように構成されてもよい。上述したように、再生要素及び結合媒体はマイクロ流体チャンバの両側に設けられており、再生要素の流路が結合媒体の流路に略平行であるが、方向は逆である。このように、再生要素及び結合媒体は同じ電場発生器を使用してもよく、電場発生器は、（例えば、結合媒体から離れて）再生要素に向かって又は（例えば、再生要素から離れて）結合媒体に向かってのいずれかに分析物を動電的に運ぶべく、電場を印加するように構成され得る。
上述したように、ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１以上のアレイのサイドチャネル（例えば、マイクロ流体チャネル）を備えている。電場発生器は、マイクロ流体デバイスのこれらのマイクロ流体チャネルのうちの１以上に電場を印加するように構成されてもよい。例えば、電場発生器は、図１の（ａ）に示されている制御チャネル４、５、６、７、８等の１以上のマイクロ流体チャネルに電場を印加するように構成されてもよい。場合によっては、電場発生器は、１０Ｖ／ｃｍ〜１０００Ｖ／ｃｍ、例えば２００Ｖ／ｃｍ〜６００Ｖ／ｃｍを含む１００Ｖ／ｃｍ〜８００Ｖ／ｃｍの範囲の強度で電場を印加するように構成されている。
ある実施形態では、電場発生器は電圧調整要素を含んでいる。場合によっては、電圧調整要素は、印加される電場の強度が分離媒体及び／又は結合媒体に亘って略均一であるように、印加される電場の強度を制御すべく構成されている。電圧調整要素は、試料中の分析物の分解能を増加させ得る。例えば、電圧調整要素は、分離媒体を通る試料の非均一的な移動を減少させ得る。更に電圧調整要素は、分析物が分離媒体を横切るときに、分析物のバンドの分散を最小限度に抑えることができる。
ある実施形態では、主題のシステムはバイオチップ（例えば、バイオセンサチップ）である。「バイオチップ」又は「バイオセンサチップ」とは、基板の表面に２以上の別個のマイクロ流体デバイスを有する基板を備えたマイクロ流体システムを意味する。ある実施形態では、マイクロ流体システムは、マイクロ流体デバイスのアレイを有する基板を備えている。
「アレイ」は、アドレス可能な領域の任意の二次元的な配置又は実質的に二次元的な（及び三次元的な）配置、例えば、空間的にアドレス可能な領域を含んでいる。アレイは、アレイの特定の所定の位置（例えば、「アドレス」）に置かれた複数のデバイスを有する場合に、「アドレス可能」である。アレイの特徴（例えば、デバイス）は、介在する空間によって分離されてもよい。任意の所与の基板は、基板の前面に配置された１、２、４又はそれ以上のアレイを有してもよい。使用法に応じて、アレイのうちのいずれか又は全てが同一であってもよく、又は互いに異なってもよく、各々が複数の異なるマイクロ流体デバイスを有してもよい。アレイは、２以上、４以上、８以上、１０以上、２５以上、５０以上又は１００以上を含む１以上のマイクロ流体デバイスを有してもよい。ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、面積が１００ｃｍ2 以下、５０ｃｍ2 以下、２５ｃｍ2 以下、１０ｃｍ2 以下又は５ｃｍ2 以下、例えば５０ｍｍ2 以下、２０ｍｍ2 以下又は１０ｍｍ2 以下を含む１ｃｍ2 以下又はそれより更に小さいアレイ内に配置されてもよい。例えば、マイクロ流体デバイスは、１００ｍｍ×１００ｍｍ以下を含む１０ｍｍ×１０ｍｍ〜２００ｍｍ×２００ｍｍの範囲の寸法、例えば５０ｍｍ×５０ｍｍ以下、例えば２５ｍｍ×２５ｍｍ以下、１０ｍｍ×１０ｍｍ以下又は５ｍｍ×５ｍｍ以下、例えば１ｍｍ×１ｍｍ以下の寸法を有してもよい。
マイクロ流体デバイスのアレイは、試料の多重分析のために設けられてもよい。例えば、一連のマイクロ流体デバイス内で複数の異なる分析物の存在について試料を分析することができるように、複数のマイクロ流体デバイスが直列に配置されてもよい。ある実施形態では、２以上の試料を略同時に分析できるように、複数のマイクロ流体デバイスが並列に配置されてもよい。
本システムの態様は、マイクロ流体デバイスが、依然として検出可能な結果を与えながら、最小量の試料を消費するように構成され得ることを含む。例えば、本システムは、依然として検出可能な結果を与えながら、１００μＬ以下、例えば５０μＬ以下、２５μＬ以下又は１０μＬ以下を含む７５μＬ以下、例えば５μＬ以下、２μＬ以下又は１μＬ以下の試料体積を使用するように構成されてもよい。ある実施形態では、本システムは、１ｎＭ以下、例えば１００ｐＭ以下を含む５００ｐＭ以下、例えば１ｐＭ以下、５００ｆＭ以下又は２５０ｆＭ以下、例えば５０ｆＭ以下、２５ｆＭ以下又は１０ｆＭ以下を含む１００ｆＭ以下の検出感度を有するように構成されている。場合によっては、本システムは、１μｇ／ｍＬ以下、例えば１００ｎｇ／ｍＬ以下を含む５００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１０ｎｇ／ｍＬ以下又は５ｎｇ／ｍＬ以下、例えば１ｐｇ／ｍＬ以下を含む１ｎｇ／ｍＬ以下、０．１ｎｇ／ｍＬ以下又は０．０１ｎｇ／ｍＬ以下の濃度の分析物を検出し得るように構成されている。ある実施形態では、本システムは、１０-18 Ｍ〜１０Ｍ、例えば１０-12 Ｍ〜１０-6Ｍを含む１０-15 Ｍ〜１０-3Ｍのダイナミックレンジを有する。
ある実施形態では、マイクロ流体デバイスは、１℃〜１００℃、例えば１０℃〜５０℃又は２０℃〜４０℃を含む５℃〜７５℃の範囲の温度で作動される。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、３５℃〜４０℃の範囲の温度で作動される。
有用性
主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、試料中の１以上の分析物の有無の判定及び／又は定量化が所望される様々な異なる用途に使用される。例えば、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、タンパク質、ペプチド、核酸等の分離及び検出に使用される。場合によっては、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、タンパク質の分離及び検出に使用される。ある場合には、タンパク質は天然のタンパク質（例えば、未変性タンパク質）である。場合によっては、マイクロ流体デバイスは、タンパク質を変性状態で分離するように構成されている分離媒体を備えており、分離したタンパク質を再生するように構成されている再生要素を備えている。本マイクロ流体デバイスは、タンパク質の活性を略保持しながら、試料中のタンパク質を分離して再生し、検出するように構成され得る。
ある実施形態では、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、試料中の核酸、タンパク質、炭水化物（例えば、グリコシル化タンパク質若しくは異常にグリコシル化したタンパク質）、又は他の生体分子の検出に使用される。本方法は、バイオマーカー又は一組のバイオマーカー、例えば、試料中の２以上の別個のタンパク質バイオマーカーの検出を有してもよい。例えば、本方法は、例えば対象の病態の診断又は対象の病態の継続的な管理若しくは治療等に用いられるように、生体試料中の２以上の疾患バイオマーカーの迅速な臨床検出に使用されてもよい。更に、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、限定されないが、ウエスタンブロット法、サザンブロット法、ノーザンブロット法、イースタンブロット法、ファーウエスタンブロット法、サウスウエスタンブロット法等の、試料中の分析物の検出のためのプロトコルに使用され得る。
ある実施形態では、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、分析物がバイオマーカーである場合、試料中の分析物の検出に使用される。場合によっては、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、限定されないが、尿、血液、血清、血漿、唾液、精液、前立腺液、乳頭吸引液、涙液、汗、便、口腔粘膜採取検体、脳脊髄液、細胞溶解物試料、羊水、胃腸液、生検組織等の、血液、血漿、血清、又は他の体液若しくは排出物中の特定のバイオマーカーの有無、特定のバイオマーカーの濃度の増減を検出するために使用されてもよい。例えば、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、限定されないが、タンパク質の異常なグリコシル化等、バイオマーカーの有無を検出するために使用されてもよい。
バイオマーカーの有無、又はバイオマーカーの濃度の著しい変化は、個人における疾患リスク、疾患の存在を診断するため、又は個人における疾患に対する治療を調整するために使用され得る。例えば、特定のバイオマーカー又はバイオマーカーのパネルにより、個人に施される薬物治療又は投与計画の選択に影響を及ぼす可能性がある。薬物療法を評価する上で、バイオマーカーは、生存又は不可逆的な疾病等の自然なエンドポイントの代わりとして使用されてもよい。治療によって、健康の改善と直接的な関連性を有するバイオマーカーが変化する場合、バイオマーカーは、特定の治療計画又は投与計画の臨床的な利点を評価するための代替エンドポイントとしての役割を果たすことができる。従って、個人で検出された特定のバイオマーカー又はバイオマーカーのパネルに基づく個人に合わせた診断及び治療は、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法によって容易になる。更に、疾患に関連するバイオマーカーの早期検出は、上述したように、主題のマイクロ流体デバイス及びシステムの高い感度によって容易になる。感度、拡張性及び使い易さと併せて、単一のチップで複数のバイオマーカーを検出する能力により、本開示のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、携帯型のポイントオブケア診断又はベッドサイド分子診断に使用される。
ある実施形態では、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、疾患又は病態に関するバイオマーカーの検出に使用される。ある場合には、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、創薬及びワクチン開発のための細胞シグナル伝達経路及び細胞内情報伝達機構の特徴付けに関するバイオマーカーの検出に使用される。例えば、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、疾患試料、正常試料又は良性試料中のバイオマーカーの量を検出する及び／又は定量化するために使用されてもよい。ある実施形態では、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、感染症又は病態に関するバイオマーカーの検出に使用される。場合によっては、バイオマーカーは、限定されないが、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子等の分子バイオマーカーであってもよい。
主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、限定されないが、上述したようなバイオマーカーの検出及び／又は定量化、無症候性の対象について一定間隔で試料を検査するスクリーニングアッセイ、バイオマーカーの存在及び／又は量を、起こり得る疾患の経過を予測するために使用する予後アッセイ、異なる薬物治療に対する対象の反応を予測することができる層別化アッセイ、薬物治療の有効性をモニタリングする有効性アッセイのような診断アッセイに使用される。
主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は更に検証アッセイに使用される。例えば、検証アッセイは、疾患バイオマーカーが、様々な個体に亘って疾患の有無の信頼性が高い指標であることを検証するか又は確認するために使用されてもよい。主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法のアッセイ時間が短いことにより、最小の時間で複数の試料をスクリーニングするためにスループットが増大し得る。
場合によっては、主題のマイクロ流体デバイス、システム及び方法は、実施のために実験室を必要とせずに使用され得る。同等の分析研究用の実験機器と比較して、主題のマイクロ流体デバイス及びシステムは、携帯型の手持ち式システムで同等の分析感度を有する。場合によっては、大きさ及び操作コストが典型的な固定型実験機器よりも減る。対象となる分析物の分離、移動、標識の付与及び検出を含むアッセイの全てのステップを単一の装置によって行うことができるように、主題のマイクロ流体デバイス及びシステムは、単一の装置に組み込まれてもよい。例えば、場合によっては、対象となる分析物の分離、移動、標識の付与及び検出のために別個の装置は存在しない。更に、主題のマイクロ流体デバイス及びシステムは、試料中の１以上の分析物を検出するために、医療訓練を受けていない人物によって、市販の家庭用検査のために家庭環境で用いられ得る。主題のマイクロ流体デバイス及びシステムは更に、臨床現場で、例えば、迅速な診断のためにベッドサイドで、又はコスト若しくは他の理由から固定型実験機器が備えられていない現場で用いられてもよい。
キット
本開示の態様は、本明細書に詳述されているようなマイクロ流体デバイスを有するキットを更に含む。キットは、緩衝液を更に備えてもよい。例えば、キットは、電気泳動緩衝液、試料緩衝液等の緩衝液を備えてもよい。ある場合には、緩衝液は、限定されないが、トリス−グリシン緩衝液、トリシン−アルギニン緩衝液等を含む。場合によっては、緩衝液は界面活性剤（ＳＤＳ又はＣＴＡＢ等）を含み、界面活性剤は、本明細書に記載されているようにタンパク質の電気泳動分離に用いられる。場合によっては、キットは、上述したように、蛍光標識が付された結合メンバー等、標識が付された結合メンバーを備えている。
キットは、限定されないが、剥離剤、変性試薬、リフォールディング試薬、界面活性剤、検出可能な標識（例えば、蛍光標識、比色標識、化学発光標識、マルチカラー試薬、酵素結合試薬、検出試薬（例えば、アビジン−ストレプトアビジン会合検出試薬）、放射性標識、金粒子、磁気標識等）、較正標準試薬等の更なる試薬を更に備えてもよい。
上述した構成要素に加えて、主題のキットは、主題の方法を行うための使用説明書を更に備えてもよい。これらの使用説明書は、主題のキット内に様々な形態で備えられてもよく、使用説明書のうちの一又は複数がキット内に備えられてもよい。これらの使用説明書が備えられる一形態は、好適な媒体又は基板上に印刷された情報であり、例えば、情報が印刷されている一又は複数の紙片、キットの包装体、又は添付文書等である。更なる別の手段は、情報が記録されているか又は保存されているコンピュータ可読媒体であり、例えば、ディスケット、ＣＤ、ＤＶＤ、ブルーレイ、コンピュータ可読メモリ等である。存在し得る更なる別の手段は、離れた場所で情報にアクセスするためにインターネットを介して使用可能なウェブサイトアドレスである。あらゆる簡便な手段がキット内に設けられ得る。
上記に提供した開示から理解され得るように、本発明の実施形態は、広範な用途を有する。従って、本明細書に提示されている実施例は、例示のために提供されているものであって、本発明に対する何らかの制限であるとみなされることを意図するものではない。当業者は、本質的に同様の結果をもたらすために変更されるか又は修正されてもよい様々な重要ではないパラメータを容易に認識する。従って、以下の実施例は、本発明をどのように作製して使用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために記載されるのであって、本発明者が自身の発明であるとみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が、行われた全ての又は唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用された数値（例えば、量、温度等）に関して正確性を確保するために努力がなされたが、ある程度の実験誤差及び偏差は考慮されるべきである。別途記載されない限り、部は質量部であり、分子量は質量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧であるか又は大気圧に近い圧力である。
［実施例］
実施例１
Ｉ．序文
タンパク質のサイジング（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、タンパク質の再生、及び抗体のブロッティングが統合され完全に自動化されたマイクロ流体デバイスを使用して実験を行った。サイジング後の再生のために構成されたマイクロ流体デバイスは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後のタンパク質の活性（例えば、タンパク質の結合親和性）の再活性化を促進し、完全に統合されたマイクロ流体ウエスタンブロットアッセイを可能にする。１ｍｍ2 のマイクロ流体チャンバ内でのミクロンサイズのポリアクリルアミドゲルの局所的な光パターニングを使用して、単一の連続したゲル内に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、再生、移動及び免疫ブロッティングのための別個の領域を生成した。分離及び試料の移動を行うために、電場発生器により３次元で電場を印加した。ゲル膜を含む再生要素を使用して、分離したタンパク質からＳＤＳを除去した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）について、再生の定量的評価によりアッセイの性能を調べた。
本明細書に記載されている実施形態は、１）再生のためにＳＤＳ分子を希釈してタンパク質から除去し、次の免疫プロービングのためにタンパク質を未変性の親和性状態に戻すこと、２）再生の際に、第１の分離次元（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、タンパク質のサイジング）からタンパク質の分離分解能を保護すること、３）完全に自動化されたマイクロ流体ウエスタンブロット法のために、サイジング後の再生をその場所での免疫ブロッティングに組み込むことのうちの１以上を達成する。
ＩＩ．自動化されたマイクロ流体ウエスタンブロットデバイス及び方法
試料の充填、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、続いて膜を用いたサイジング後の再生、試料の移動、最後に親和性ブロッティングを含む統合された、マイクロ流体に基づくウエスタンブロットプラットフォームを使用して実験を行った。機能領域は夫々、図１の（ａ）及び（ｂ）に示されているように、ポリアクリルアミドゲルの局所的な光パターニングによって画定された。マイクロ流体デバイスは、（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離、再生及び親和性ブロッティングを含む）ウエスタンブロット法のステップが、単一のチップ上で自動的に行われることを可能にした。再生要素には、タンパク質からＳＤＳ分子をフィルタ除去するためのサブナノ孔径のゲル膜が含まれた。
図１の（ａ）及び（ｂ）は、本開示の実施形態に係る、その場所でのタンパク質の再生を伴うマイクロ流体ウエスタンブロットデバイスの画像及び概略図を示す。図１の（ａ）は、マイクロ流体ウエスタンブロットデバイスの明視野画像を示す。図１の（ｂ）は、マイクロ流体デバイスの拡大画像（図１の（ｂ）の中央）を示し、光重合した充填媒体１１０、分離媒体１２０、再生要素１３０及び結合媒体１４０を示す。充填媒体には、より小さな孔径（６％Ｔ）の蓄積ゲルに隣接した大きな孔径の３％Ｔ、３．３％Ｃのゲルが含まれた。各サイドチャネル中の再生要素（例えば、膜）は、ＳＤＳ除去のためにＳＤＳのみを通過させ得る４５％Ｔ、５％Ｃのサブナノ孔径のゲルであった。結合媒体（例えば、ブロッティングゲル領域）は、分離ゲル（６％Ｔ、３．３％Ｃ）と孔径が同様であるが、標的タンパク質の結合のためにビオチン化結合メンバー（例えば、抗体又はレクチン等のブロッティング試薬）との機能化を可能にするストレプトアビジンを含んだゲル膜アレイ（６％Ｔ、３．３％Ｃ）をサイドチャネルに含んだ。
マイクロ流体ウエスタンブロット法の操作では、タンパク質を、まず垂直方向の次元で動電的に分離した。次に、タンパク質を、左側のアレイのマイクロチャネルに含まれた再生膜に横方向に移動させた。ＳＤＳ分子の希釈及びタンパク質からの電気的除去に基づいて、タンパク質の再生を行った（図１の（ｂ）の左パネル及び図２の（ｃ）を参照）。ＳＤＳを除去した後、膜の界面上に保持されたタンパク質を、右側のアレイのマイクロチャネルに局在化された結合媒体に横方向に移動させた。抗体又はレクチンは、ストレプトアビジン−ビオチン結合により結合媒体に固定され、標的タンパク質の親和性捕捉をもたらした。
図２の（ａ）は、試料を充填するための注入部２５、分離のための矩形状のチャンバ２１、再生のための左のサイドマイクロチャネル２３、及び結合（例えば、ブロッティング）のための右のサイドマイクロチャネル２４を備えた多次元操作のためのマイクロ流体デバイスの概略図を示す。参照番号１〜８は、試料注入のためのポート及び電極を示す。図２の（ｂ）は、第１の垂直方向の流路でのタンパク質試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離及びサイジングの概略図を重ねた画像を示す。図２の（ｃ）は、再生のための再生膜への分離したタンパク質の第２の横方向の流路における移動の概略図を重ねた画像を示す。図２の（ｄ）は、右サイドチャネルに設けられた結合媒体への移動による、再生後の標的タンパク質の結合の概略図を重ねた画像を示す。
アッセイは、電圧のプログラミングによって自動化されており、圧力駆動による流れ又は流体弁構造は不要であった。膜を用いた再生の組み込みにより、死容積が最小限度に抑えられ、分離、再生、及び親和性ブロッティングの統合が促進された。再生膜のサブナノ細孔構造は、小さなＳＤＳ分子及び緩衝液イオンを通過させ、より大きなタンパク質を保持した。従って、界面活性剤がタンパク質から分離され、未変性緩衝液中でのタンパク質のリフォールディングを可能にした。光パターニング技術により、再生膜アレイをワンステップで並列して製造することが可能になった（図３を参照）。場合によっては、微小規模の幾何学形状は質量移動を高めて、タンパク質の迅速な再生を促進した。複数の再生ゲル膜を使用して、個別のタンパク質の擬似固定及び緩衝液交換によるＳＤＳ除去のための再生区画を各サイドチャネルに作製した。従って、複数のタンパク質の再生が同時に処理され、それによりマイクロ流体デバイスのスループット能力が増加した。
図３は、本開示の実施形態に係るマイクロ流体デバイスの明視野画像を示す。本マイクロ流体デバイスに備えられている４つの異なる媒体は、マイクロ流体ウエスタンブロッティングのために、充填媒体３００（３％Ｔ）、分離媒体３１０（６％Ｔ）、再生要素３２０（４５％Ｔ）、及び結合媒体３３０（６％Ｔ、抗体）を光パターニングすることにより作製された。
各サイドチャネル区画の再生性能を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の再生を定量的に評価することによって特徴付けた。ＧＦＰの蛍光強度をモニタリングすることによって、再生動態及び再生状態を評価した。図４は、異なるＳＤＳ濃度及びインキュベーション時間で（例えば、異なる変性条件下で）処理したＧＦＰ（図４の（ａ））及びＩｇＡ（図４の（ｂ））の蛍光放出特性のグラフを示す。還元条件として、６５℃で５分間加熱した２％ＳＤＳ及び１％還元剤緩衝液を用いた。図４に示されているように、ＧＦＰの蛍光は、その未変性状態と関連していた。ＳＤＳで処理したＧＦＰは、ＳＤＳの変性による発色団の破壊のために蛍光放出の減少を示した（図４の（ａ））。ＧＦＰの変性は、可視蛍光の回復によって示されるように可逆的であった。
各膜の再生能力を、ＧＦＰの再生動態をモニタリングすることによって特徴付けた。図５の（ａ）に見られるように、光パターニングした膜の界面を、左側のアレイのチャネルに設けた。５％ＳＤＳで処理したＧＦＰの連続的な流れをマイクロ流体デバイスのチャンバに充填し、左側のアレイのチャネルに移動させた（チャネル１〜６）。ＧＦＰを各再生区画に均等に分配した（図５の（ｂ）及び（ｃ））。小さなＳＤＳ分子は、膜を通過して再生緩衝液の動電的な流動下で洗い流されたが、タンパク質分子は、再生膜によるサイズ排除のために膜の界面で保持された。蛍光放出の増加が再生膜の界面で観察され、ＧＦＰの再生が示された。図５の（ｇ）に示されているように、１つの画像フレームにおける６つのチャネルのモニタリングにより、再生膜におけるＧＦＰの蛍光強度が経時的に増加した。各区画１〜６におけるＧＦＰの再生動態プロファイルは一致しており、膜を用いた再生の再現性能を高スループットで示した。再生後、ＧＦＰを膜の界面から溶出し、右側のアレイのチャネル内の結合媒体へと横方向に移動させた（図５の（ｄ）及び（ｅ）を参照）。ＧＦＰの特異的捕捉によって、結合媒体に固定されたポリ抗ＧＦＰに対するＧＦＰの親和性が示された（図５の（ｆ））。親和性捕捉プロファイルを図５の（ｈ）に示す。略１００％の捕捉効率が、各結合媒体（例えば、ブロッティングゲル）で達成され、各サイドチャネル１〜６におけるブロッティング性能は一致していた。再生後のその場所でのブロッティングを、陰性対照として５％ＳＤＳで処理したＢＳＡを導入することによって更に評価した。図５の（ｉ）に見られるように、陰性対照である５％ＳＤＳで処理したＢＳＡの再生プロファイルは、ＧＦＰと比較した場合、蛍光標識が付されたＢＳＡのその未変性状態への非相関関係のために著しく異なった。図５の（ｉ）の挿入図は、抗ＧＦＰ抗体を含有する結合媒体に対する陰性反応を示し、結合媒体へのＢＳＡの非特異的な結合は略存在しなかった。５％ＳＤＳで処理したＧＦＰのマイクロ流体再生時間は、約９５秒であった。結合媒体への移動後、再生膜の界面上に残存するタンパク質残留物は観察されなかった。
ＧＦＰの再生動態プロファイルを図６の（ａ）に示す。図６の（ａ）は、未変性ＧＦＰと比較した、３％ＳＤＳで処理したＧＦＰの再生進行プロファイルのグラフを示す。試料の充填及び再生膜への横方向の移動の後、３％ＳＤＳで処理したＧＦＰは、ＳＤＳの除去後にＧＦＰが未変性緩衝液中でリフォールディングされるにつれ、経時的により多くの蛍光を放出した。再生プロファイルは、同じ操作条件下で、リフォールディングプロセスを行わない未変性ＧＦＰと比較して著しく異なった。効果的な再生のためのＧＦＰの動態を図６の（ｂ）に示す。図６の（ｂ）は、マイクロ流体デバイスにおけるＧＦＰの再生動態のグラフを示す。リフォールディング進行曲線を、速度定数ｋ１＝２．６５×１０-2で単一指数関数にフィッティングさせた（式１を参照）。
＜Ｑ（ｔ）＞＝Ａ0−Ａ1ｅｘｐ（−ｋ1ｔ） （１）
式１中、＜Ｑ（ｔ）＞は、時間ｔの関数としてのＧＦＰ構造特性の値であり、Ａ0 、Ａ1 及びｋ1 は夫々、相対振幅及びリフォールディングの速度定数に対応するフィッティングにおける自由パラメータである。
ＳＤＳ除去ステップの際、ＧＦＰの効果的な再生が、効果的に反転された蛍光強度に従って定められ、それを使用して、再生回復（回復した蛍光）を、未変性状態のＧＦＰの蛍光に対して正規化することにより計算することができる（図６の（ｃ）を参照）。図６の（ｃ）は、ＳＤＳ濃度依存性蛍光回復を観察することによって得られた効果的な再生時間のグラフを示す。ＧＦＰの再生に要した時間は、ＳＤＳ濃度に比例している。３％ＳＤＳで処理したＧＦＰに関して、再生は、６６秒以内に９１％の再生回復で行われた。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、電気泳動・試料緩衝液へのＳＤＳの添加により、タンパク質を負電荷で均一に覆って、全タンパク質の電荷を等しくした。従って、タンパク質の相対移動度は、単にゲルの篩作用によって判定され、タンパク質の分子量（Ｍｒ）に比例した。タンパク質標準物質を使用して未知のタンパク質の分子量を判定するための較正曲線を確立した。
図７は、タンパク質分子量（Ｍｒ）を判定するためのスラブゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ較正曲線のグラフを示す。使用したタンパク質標準物質は、トリプシン阻害剤、炭酸脱水酵素、卵白アルブミン及びＢＳＡであった。未変性条件と、３％ＳＤＳ、５％ＳＤＳ、８％ＳＤＳ、１０％ＳＤＳでの処理を含む異なる試料条件とを実行し、４〜１２％Ｔのトリス−ＨＣｌスラブゲル中で２時間電気泳動した。図７に示されているように、３％ＳＤＳ、５％ＳＤＳ、８％ＳＤＳ及び１０％ＳＤＳで処理したタンパク質標準物質の移動度は同一であり、略線形の関係を示した。対照的に、未変性タンパク質標準物質は、非線形の較正曲線を示した。このため、３％ＳＤＳが、タンパク質標準物を負電荷で覆って、略線形の較正曲線をもたらすのに十分であることが示された。
ＳＤＳ処理下での移動度を、多次元マイクロ流体デバイスを使用して確認した。図８は、本明細書に記載されているマイクロ流体デバイスを使用して得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離及び分子量較正曲線を示す。使用したタンパク質標準物質は、１．β−ガラクトシダーゼ（分子量１１４ｋＤａ）、２．ＢＳＡ（分子量６６ｋＤａ）、３．卵白アルブミン（分子量４５ｋＤａ）、４．ＧＦＰ（分子量２７ｋＤａ）、５．トリプシン阻害剤（分子量２１ｋＤａ）であった。図８の（ａ）は、マイクロ流体デバイスを使用した未変性タンパク質ラダー分離の蛍光画像を示す。図８の（ｂ）は、マイクロ流体デバイスを使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥラダー分離の蛍光画像を示す。図８の（ｃ）は、タンパク質の分子量較正曲線のグラフを示す。未変性条件と、３％ＳＤＳ処理、５％ＳＤＳ処理及び８％ＳＤＳ処理を含む異なる試料条件とを、６％Ｔ分離ゲル（５倍トリス−グリシン緩衝液）でパターニングされた同じ多次元マイクロ流体デバイスで実行した。図８に示されているように、３％ＳＤＳ処理、５％ＳＤＳ処理及び８％ＳＤＳ処理下で、タンパク質移動度と分子量との間に線形関係が得られ、線形関係は、スラブゲルのデータ（図７を参照）と一致した。このため、ＳＤＳ処理が、マイクロ流体デバイスを使用した未知のタンパク質の分子量較正に効果的であることが示された。未変性タンパク質ラダー分離は、非線形の移動速度対分子量の関係を示した。ＳＤＳ処理下では、ＧＦＰの蛍光放出は低く、未変性のものと同じ濃度ではほとんど検出されなかった（図８の（ａ）及び図８の（ｂ）を参照）。３％ＳＤＳ処理、５％ＳＤＳ処理及び８％ＳＤＳ処理下での較正曲線の傾きの差異は、より多くのＳＤＳ分子でタンパク質を覆うことによる、タンパク質のより迅速な移動度のためである。
サイジング情報が、図９に示されているように、第２の再生流路への移動の前に、第１の分離流路に沿ったＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られる。トリプシン阻害剤、ＧＦＰ及びＢＳＡを、第１の流路の５％ＳＤＳ中で垂直方向に分離した（図９の（ａ））。３つのタンパク質の移動度は、それらの対数分子量に線形的に関連しており、図９の（ｂ）に示されているように、未知のタンパク質の分子量を決定するために使用可能な線形較正曲線が与えられた。図９の（ａ）に示されているように、再生膜への移動ステップは、第１の流路でのＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られた分離分解能を維持した。分離したタンパク質を、各サイドチャネル内の再生区画に移動させ、再生膜を用いたＳＤＳの分離によりリフォールディングプロセスを個別に行った。３つのタンパク質に関する再生プロファイルを図９の（ｃ）に示す。ＧＦＰの蛍光は増加し、リフォールディングの成功を示した。再生後、タンパク質を再生膜の界面から結合媒体に向かって移動させた。振動パルス電圧を使用して、移動を促進し、再生膜の界面に保持された残存するタンパク質残留物を減少させた。図９の（ａ）に示されているように、タンパク質は、再生膜の界面から完全に溶出され、移動ステップ中の著しい試料の損失は観察されなかった。その後のブロッティングステップでは、結合媒体に親和性を有するＧＦＰが保持されたが、親和性を有さないＢＳＡ及びトリプシン阻害剤は結合媒体を自由に通過して移動した。標的タンパク質であるＧＦＰは、３０秒のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離及び１００秒の再生を含む２６５秒以内にマイクロ流体ウエスタンブロットにより特定された。結合媒体に保持されたタンパク質の画像に対して最終ＰＡＧＥ画像を比較することにより、ブロットされたピーク位置（例えば、既知の抗体対）に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥピーク位置（分子量）の直接的な空間マッピングを可能にし、標的タンパク質の同一性を確認した。
実施例２
Ｉ．序文
タンパク質のサイズ及び特定のレクチンに対する親和性に基づいてタンパク質のグリコシル化を特定するために、マイクロ流体レクチンブロッティングプラットフォームを使用して実験を行った。統合された多段階アッセイは、典型的なスラブゲルレクチンブロッティングに必要な手動による介入ステップを最小限度に抑え、総アッセイスループットを増加させ、試薬及び試料の消費を減少させ、１つのデバイスに統合された。アッセイは、非還元性のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、続いてサイジング後のＳＤＳ濾過、及びレクチンに基づく親和性ブロッティングを含んだ。再生要素はナノ細孔膜を含み、ナノ細孔膜は、ＳＤＳ−タンパク質の複合体を保持し、緩衝液交換による電気泳動のＳＤＳ除去を可能にした。例えば、ガラクトース欠損Ｏ−グリカンで異常にグリコシル化した免疫グロブリンＡ１が、約３μＬの試料を使用して約６分以内にアッセイされた。
非還元条件下でのサイジング（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）が再生によるタンパク質結合能力の回復、及びその後のオンチップレクチンブロッティングと統合されて自動化した多次元マイクロ流体デバイスを使用して実験を行った（図１０）。マイクロチャンバ及びマイクロチャネルネットワークを収容しているガラス製のマイクロ流体デバイスでアッセイを行った（図１０のＡ）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、全体的な糖タンパク質構造を保持し、還元条件下で起こり得る非特異的（偽）レクチン結合を最小限度に抑えた。再生要素をマイクロ流体デバイスに統合した。再生要素は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後であって、レクチンブロッティングの前に、ＳＤＳを希釈して分解したタンパク質から除去するための再生膜（例えば、微小規模の分子量カットオフ（ＭｒＣＯ）フィルタ）を含んだ（図１０のＢ）。ＳＤＳ−タンパク質の複合体からＳＤＳを除去することによる再生は、既にサイジングされたタンパク質のタンパク質活性（例えば、結合親和性）の回復を促進し得る。
試薬及び材料
３０％アクリルアミド（２９：１のアクリルアミド／ビスアクリルアミド比）原液、９９％純粋アクリルアミド粉末及びビスアクリルアミド粉末、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、及びＴｒｉｔｏｎＸ−１００をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。使用前に混合された１０倍トリス−グリシン未変性電気泳動緩衝液（２５ｍＭトリス、ｐＨ８．３、１９２ｍＭグリシン）をＢｉｏ−Ｒａｄ社（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）から購入した。使用前に混合された１０倍ザイモグラム再生緩衝液（２．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００含有）及びストレプトアビジン−アクリルアミドをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。水溶性光開始剤２，２−アゾビス（２−メチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）プロピオンアミド）（ＶＡ−０８６）をＷａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８−抱合型ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、６８ｋＤａ）、ミオシン重鎖（２００ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１４ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９６ｋＤａ）をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８−抱合型ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、６６ｋＤａ）及びトリプシン阻害剤（２１ｋＤａ）をＡｂｃａｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。組み換え全長オワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ ｖｉｃｔｏｒｉａ）ＧＦＰ（２７ｋＤａ）及びビオチン化ヤギポリクローナル抗ＧＦＰをＡｂｃａｍ社（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から購入した。ニワマイマイ（Ｈｅｌｉｘ ａｓｐｅｒｓａ）（ＨＡＡ）由来のビオチン化レクチンをＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８タンパク質標識付与キットを使用して供給業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に従って蛍光標識をタンパク質に付与した。簡単に説明すると、５０〜１００μｇの抗体（約１ｍｇ／ｍＬ）を１Ｍ重炭酸ナトリウム溶液（ｐＨ約８．３）中で市販の反応染料と混合した。溶液を室温で１時間インキュベートした。２つの反応物質を混合して標識の付与を効率的に促進するために、バイアルを１０〜１５分毎に数回穏やかに反転させた。余分な遊離染料を、マイクロスピンカラム（カットオフ３０ｋＤａ）を使用して除去した。標識が付されたタンパク質を使用まで４℃の暗所で保管した。
ＩｇＡ１試料の調製
天然に、ガラクトースが欠損したＩｇＡ１骨髄腫タンパク質を、多発性骨髄腫を有する患者の血漿から分離した。血漿を硫酸アンモニウムで沈殿させた（５０％飽和）。沈殿物を、ＤＥＡＥセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィーによる分別前に、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中に溶解して透析した。ＩｇＡ１沈殿物の純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとＩｇＡ特異性モノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法とにより評価し、ＩｇＡ濃度をＥＬＩＳＡによって測定した。ＩｇＡ１タンパク質の分子形態を、サイズ排除クロマトグラフィー、非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗ＩｇＡ抗体を使用したウエスタンブロット法により評価した。
貯留した単一ドナーの正常ヒト血清（新たに収集、ＩＰＬＡ−ＣＳＥＲ）をＩｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ｎｏｖｉ，ＭＩ）から購入した。正常ヒト血清ＩｇＡ１をＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、その後のペプチドＭ／アガロースカラム（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社）を使用することにより精製した。
マイクロ流体チップの製造
ガラス製のマイクロ流体チップを設計し、標準的なウェットエッチングプロセスを使用して作製した（例えば、Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社，Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ，ＭＡを参照）。チップには、クロス注入器と、両側でマイクロチャネルアレイ（マスク設計では深さ２０μｍ及び幅１０μｍであるが、等方性エッチングのため実際の幅は約５０μｍ）を介して貯留部（夫々３μＬの体積）に接続された０．５×２ｍｍ2 の矩形状のマイクロチャンバとが配置された（図１４）。マイクロチャンバに接続され、間隔が１００μｍ、５０μｍ又は１０μｍ空いたサイドチャネルアレイを使用して、タンパク質を再生するための区画を形成した。矩形状のマイクロチャンバは、分離ゲル及びブロッティングゲルを収容した。マイクロチャネルアレイを、垂直方向及び水平方向の次元でマイクロチャンバ全体に均一な電場を生成するように設計した。チップの幾何学形状は、落射型蛍光顕微鏡システムでのＣＣＤに基づく画像化と適合するように選択された。ゲルを作成するために前駆体溶液を導入する前に、シラン、酢酸、メタノール及び水の２：２：３：３混合物を用いてチップを３０分間インキュベートすることによって、ガラス製のチップをシラン処理した。このシラン処理ステップにより、ポリアクリルアミドゲルが電場の印加下で移動しないように、ガラスへのポリアクリルアミドゲルの結合が増強された。
多機能性ポリアクリルアミドゲル光パターニング
複数の機能的なゲル領域を、４ステップのフォトリソグラフィプロセスを使用してマイクロチャンバ及びサイドチャネル内で連続的に光パターニングした。紫外対物レンズ（ＵＰＬＡＮＳ−ＡＰＯ ４×，Ｏｌｙｍｐｕｓ社）を透明フィルムマスク及び落射型蛍光顕微鏡システム（Ｎｉｋｏｎ社，Ｄｉａｐｈｏｔ ２００，Ｊａｐａｎ）と組み合わせて使用してリソグラフィを実行した。強度が可変に制御されるＨａｍａｍａｔｓｕ ＬｉｇｈｔｎｉｎｇＣｕｒｅ ＬＣ５紫外光源（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｃｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）を、ポリアクリルアミドゲルの光パターニングに使用した。光源からの紫外光線を、倒立落射型蛍光顕微鏡の光路に沿って紫外透過対物レンズまで導いた。
ステップ１では、５％Ｔ、３．３％Ｃの前駆体溶液（０．４ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−アクリルアミド及び１ｍｇ／ｍＬビオチン化レクチンを含有する１倍トリス−グリシン未変性電気泳動緩衝液により希釈）を充填した領域を紫外励起光（約１２．５ｍＷ／ｃｍ2 ）に３３０秒間露光することによってブロッティングゲルを作製した。％Ｔ及び％Ｃという表記は夫々、総アクリルアミド及び架橋剤のパーセンテージを示す。ゲルマトリックス中の共有結合したストレプトアビジンを使用して、免疫ブロッティング用のビオチン化抗体又はレクチンを固定した。
ステップ２では、チップに対するマスクの位置合わせを、顕微鏡の手動調節可能なｘ−ｙ軸移動ステージを使用して行い、続いて、サイドチャネルアレイ全体に５００μｍの幅の再生膜アレイを光パターニングした。顕微鏡の接眼レンズを通じて観察することによって、膜の界面を判定し、サイドチャネルとマイクロチャンバとの接続点で位置合わせを行った。再生膜前駆体溶液の組成は４５％Ｔ及び５％Ｃであり、１倍トリス−グリシン未変性電気泳動緩衝液を使用して９９％純粋アクリルアミド及びビスアクリルアミド粉末の希釈によって調製した。約４０ｍＷ／ｃｍ2 の紫外線強度で８５秒間露光した。
ステップ３では、ＰＡＧＥ分離ゲルを形成した。ＰＡＧＥ分離ゲルは、ブロッティングゲルと同様の組成及び構造を有したが、固定した抗体を含まなかった（５％Ｔ、３．３％Ｃ、０．０１％ＴｉｔｒｏｎＸ−１００を含有する１倍トリス−グリシン未変性電気泳動緩衝液によって希釈、約１０ｍＷ／ｃｍ2 で３００秒間の露光）。分離ゲル中のＴｉｔｒｏｎＸ−１００を使用して、緩衝液の強度を高ＳＤＳ濃度の試料緩衝液に合わせた。
ステップ４では、３％Ｔ、３．３％Ｃアクリルアミド溶液を使用し、冷却ファンを有するフィルタ処理した水銀ランプ（３００〜３８０ｎｍ、１０ｍＷ／ｃｍ2 、ＵＶＰ Ｂ１００−ＡＰ，Ｕｐｌａｎｄ，ＣＡ）にチップを８分間フラッド露光することにより、より大きな孔径の充填ゲルを形成した。図１４は、濾過膜１４１０（４５％Ｔ、５％Ｃ）、ブロッティングゲル１４２０（５％Ｔ、３．３％Ｃ、レクチン）、分離ゲル１４３０（５％Ｔ、３．３％Ｃ）、及び充填ゲル１４４０（３％Ｔ、３．３％Ｃ）を備えたマイクロ流体デバイス１４００の写真図を示す。光重合時間が、各紫外光源の強度、アクリルアミド前駆体溶液の組成、及びゲルの所望の機能領域の所望の孔径に基づいて経験的に決定された。
各前駆体溶液を、先の未重合溶液を加圧洗浄することによって導入した。各前駆体は、０．２％（ｗ／ｖ）ＶＡ−０８６光開始剤を含有した。静止条件をマイクロチャンバ内に使用して高分解能の光パターニングプロセスを可能にし、前駆体の充填後、各貯留部に５％ＨＥＣを滴下することによって静止条件が確立された。紫外線の露光前に１０分間の平衡化期間を使用した。使用後、ガラス製のチップハウジングは、架橋されたゲルの除去により再使用された。ポリアクリルアミドゲルを含有する使用済みチップを、過塩素酸（Ｓｉｇｍａ社、ＡＣＳグレード、７０重量％）及び過酸化水素（Ｓｉｇｍａ社、ＡＣＳグレード、３０重量％）の２：１混合物に一晩７５℃で浸した。ゲルの分解後、０．１Ｍ水酸化ナトリウムを使用してチャネルを３０分間洗浄した。
オンチップアッセイ用の装置及び画像分析
シャッターシステム及び１０倍対物レンズ（ＵＰｌａｎＦＬ，Ｎ．Ａ．＝０．３）を有する倒立落射型蛍光顕微鏡（ＩＸ−７０，Ｏｌｙｍｐｕｓ社，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）を備えたＣＣＤカメラ（ＣｏｏｌＳＮＡＰ（商標）ＨＱ２，Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社，Ｔｒｅｎｔｏｎ，ＮＪ）を使用して画像収集を行った。カメラの露光時間は、１０ＭＨｚの周波数で４００ミリ秒であった。このため、約１ｍｍ×１．３４ｍｍの視野に相当する全視野画像がもたらされた。全視野画像を使用することにより、照射シャッター制御下でのタンパク質の分離、再生、移動及び最終ブロッティングの間に全ての分析物が同時に観察されることが可能になった。ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８及び５６８標識付与タンパク質を夫々照射するために、水銀灯からの光をＸＦ１００−３又はＸＦ１１１−２フィルタセット（Ｏｍｅｇａ Ｏｐｔｉｃａｌ社，Ｂｒａｔｔｌｅｂｏｒｏ，ＶＴ）により除去した。２色の画像を、同じデバイスでの２つの別個の実行で得られた個別の赤色及び緑色の波長の画像シーケンスから作成した。いずれの実行にも同一の条件及び時間を使用した。ＩｍａｇｅＪを使用して画像分析を行い、分離領域、再生領域及びブロッティング領域に相当する対象領域を選択して一貫して適用した。対象となる領域全体にＩｍａｇｅＪを使用して蛍光プロファイルをプロットした。蛍光シグナルをバックグラウンドに対して正規化した。タンパク質バンド間の分離分解能（ＳＲ）を式ＳＲ＝ΔＬ／４σとして定め、この式中、Ｌは隣り合うバンド中心間の距離であり、平均特徴バンド幅を表した（ＯｒｉｇｉｎＬａｂを用いたガウス分布フィッティング）。
緩衝液交換を用いた電気的制御プログラム
チップへの試料の添加後、アッセイ操作はプログラム可能であり、白金電極を備えた電力供給装置（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を介して制御された。試料（Ｖ３）、試料廃液（Ｖ２）、緩衝液（Ｖ１、Ｖ４、Ｖ５、Ｖ７）及び緩衝液廃液（Ｖ６、Ｖ８）の貯留部のための電気的制御シーケンスを以下の表１に示す（Ｖ１〜Ｖ８と呼ばれる貯留部を備えたマイクロ流体デバイスの写真図を示す図１５も参照）。以下の表１に示されているような印加電流の制御を使用した。
表１に示されているように、再生ステップ中に緩衝液交換を行った。ＳＤＳで処理したタンパク質を個別の再生区画に移動させた後、電場を停止した。各再生区画は、試料を分散することなく、分解されたタンパク質を物理的に制限した。約１０μＬの１倍ザイモグラム再生緩衝液（０．２５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有）を貯留部６及び貯留部７にピペット注入することによって、泳動緩衝液を再生緩衝液で置き換えた。電場を再度横方向に１０秒間印加して、再生ステップを実行した。再生後、泳動緩衝液を貯留部６及び貯留部７内で置き換え、制御電流を再度印加して、再生緩衝液を洗い流した。再生緩衝液を５０秒間洗浄した。再生プロセスは、還元剤なしで、最高１２％（ｗ／ｖ）までの濃度のタンパク質からＳＤＳを除去するために効果的であった。標準分子量ラダーのオンチップ及びスラブゲル両方のＳＤＳ−ＰＡＧＥから明示されているように、３％及び５％の濃度のＳＤＳは、均一な電荷で大きなタンパク質（例えば、２００ｋＤａ）を覆って、分子量較正に関して滑らかな線形相関をもたらすために十分であった。
図１６の（ａ）に示されているように、設計した幾何学的配置内で垂直方向及び水平方向に印加した電場を、ＣＯＭＳＯＬ Ｍｕｌｔｉｐｈｙｓｉｃｓ（Ｖｅｒｓｉｏｎ４．０ａ，ＣＯＭＳＯＬ ＡＢ）を使用してシミュレーションした。直線的且つ均一な電場の分布により、分離、再生、移動及びブロッティング中の３方向での試料の正確な操作が促進された。実験及びシミュレーションの両方が、設計された幾何学的配置内で垂直方向及び水平方向に良好に制御された電場の分布を示した（図１６の（ａ）及び（ｂ））。再生は、流れの充填後１１秒〜１６０秒行った。図１６の（ｂ）では、ＧＦＰの垂直方向の流れの連続的な充填により、水平方向の移動プロセスが、試料の分散を最小限度に抑えて行われたことが示された。分離ゲルを２回横断した後の流形の歪曲は５％未満であった（図１６の（ｂ）を参照）。
オンチップ再生動態
予め標識が付されたタンパク質の蛍光とは異なり、ＧＦＰの蛍光は、その未変性状態と関連していた。ＧＦＰの変性プロセスは、可視蛍光の回復を示すことにより可逆的であった。この蛍光の回復により、ＧＦＰは、マイクロ流体デバイスの再生動態をモニタリングするための有用なモデルであることが分かった。再生したＧＦＰの回復を、同じ条件での非変性ＧＦＰの対応する蛍光に対して正規化することによって計算した。所定の時点で回復した蛍光をプロットすることにより、動態トレースを実験的に得た。結果として得られるグラフを、以下に示す二重指数関数にフィッティングさせた。
＜Ｑ（ｔ）＞＝Ａ0−Ａ1ｅｘｐ（−ｋ1ｔ）−Ａ2ｅｘｐ（−ｋ2ｔ）
式中、Ｑ（ｔ）は、時間の関数としての回復された蛍光の値であり、Ａ0 、Ａ1 、Ａ2 、ｋ1 及びｋ2 は夫々、相対振幅及び相の速度定数に対応するフィッティングにおける自由パラメータである。上の式を用いて、動態機構における速度定数及び半減時間を決定した。再生プロセスは、移動から開始し、膜を通る濾過の間継続した。濃縮によって引き起こされる蛍光の増加を避けるために、進行曲線は、移動の完了後の蛍光に関して示された。再生動態からの二次速度定数（ｋ）を使用して、半減時間（ｔ）＝ｌｎ２／ｋの式に従って半減時間を表した。
ナイキストシャノンのサンプリングに基づいた再生区画アレイによるタンパク質の収集
ナイキストシャノンのサンプリング定理によると、いずれのエイリアシングも有することなくシグナルを再構成するために、サンプリング周波数は、少なくともサンプリングするシグナルの最大周波数以上である。サンプリング定理は、このサンプリングバンド幅（本明細書ではチャネル間隔）がサンプリングするシグナルのバンド幅（本明細書ではタンパク質のバンド幅）以下である場合、間隔が均一である別個の試料がシグナルの完全表記であることを示す。このサンプリング定理に基づいて、間隔が均一なチャネルアレイにおける試料からの正確な再構成可能性に対する十分条件は、Ｗｓ≦Ｗｐである。用語Ｗｓは、サイドチャネルアレイのチャネル間隔であり、Ｗｐは、タンパク質のバンド幅である（図２１の（ａ）及び（ｂ）を参照）。
分離分解能を、以下の式によって定める。
ＳＲ＝（Ｃ2 −Ｃ1 ）／（１／２ＷC1＋１／２ＷC2）
ベースライン分離は、ＳＲ＝１である（図２１の（ａ）を参照）。ベースライン分離におけるバンド幅が約５０μｍである２つのタンパク質に関して、２つのピーク中心間の幅は、約５０μｍである。ＳＲの完全表記の十分条件は、収集のためのサイドチャネルの間隔が５０μｍ以下であることである。
ＩＩ．マイクロ流体レクチンブロッティングのための膜を用いた再生
再生要素は、中央のマイクロチャンバに隣接するマイクロチャネルアレイに設けられたポリアクリルアミド（ＰＡ）ゲル膜から作製された再生膜（例えば、ＭｒＣＯマイクロフィルタ）を含んだ。ＭｒＣＯマイクロフィルタは、マイクロチャネルアレイにおける４５％ＴのＰＡゲルのワンステップの光パターニングを使用して作製された（図１０のＣ）。マイクロチャネルにＭｒＣＯマイクロフィルタが配置されているため、ＭｒＣＯマイクロフィルタは、電気泳動を用いた横方向の緩衝液交換及びＳＤＳ濾過を可能にする区画を画定した（図１０のＢ及び表１を参照）。ＭｒＣＯマイクロフィルタは、分子量が２０ｋＤａを上回る種の移送を排除し、従って、図１０のＣの概略挿入図に示されているように、緩衝液及びＳＤＳのチャンバからの流出を可能にした。ＳＤＳの除去後、マイクロチャンバの反対側に隣接する結合媒体（例えば、ブロッティング領域）にタンパク質を運んだ（図１０のＤ）。ＰＡブロッティングゲルは、ビオチン化抗体又はレクチンに結合したストレプトアビジンアクリルアミドを含んだ。固定した種に親和性を有する分析物が保持された。他の種は、結合媒体を介して運ばれ、マイクロチャネルアレイの外へ電気移動した。図１０のＢ〜Ｄでは、「ＥＰ」と表示される矢印が電気泳動の方向を示す。ブロッティング領域で３次元反応性の「細孔」を通して導く電気泳動は、拡散距離を減少させることによって物質移動を促進し、捕捉試薬の制御された配向によって結合を促進することができる（図１７の（ｂ）を参照）。０．５ｍｍ×２ｍｍのゲルパターニングしたマイクロ流体チャンバにおける多次元の制御された電場の使用により、分離、再生及びブロッティングアッセイが、自動化された方法で１つの統合されたマイクロ流体デバイスで行われ得る（図１６の（ｂ）及び表１を参照）。
ＭｒＣＯマイクロフィルタは、緩衝液イオン及びＳＤＳ単量体（Ｍｒ＝２８８ｋＤａ）がマイクロチャンバから流出する一方、タンパク質（＞２０ｋＤａ）等のより大きな種を保持するように構成された。ＳＤＳの臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は６〜８ｍＭであった（約０．２３％ｗ／ｖ）。ＣＭＣを上回ると、ＳＤＳミセルが最大分子量１６ｋＤａで形成され、希釈の際に単量体に分かれる。ＳＤＳ処理したトリプシン阻害剤（ＴＩ、２１ｋＤａ）及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、２７ｋＤａ）の両方が、ＭｒＣＯマイクロフィルタを通した電気移動から排除されることが実験的に判定された（図１６の（ｂ）を参照）。ＳＤＳミセルの電気泳動移動度は、モデルタンパク質の電気泳動移動度よりも高かった（μSDS ＝−６．０×１０-4ｃｍ2 Ｖ-1ｓ-1に対してμTI＝−２．０×１０-4ｃｍ2 Ｖ-1ｓ-1、いずれもｐＨ７．０）。従って、他の条件を一定に保って同じ印加電場下でＳＤＳミセルは、より迅速に電気移動した。このように、ＳＤＳ除去プロセスは、タンパク質再生の速度が制限されるステップではなかった。再生ステップ中に、振動電圧を印加して、ＰＡゲルから作製されたＭｒＣＯマイクロフィルタへのタンパク質の絡合又は吸着を最小限度に抑えた（表１及び図１８を参照）。再生の最終段階で振動電圧シーケンスを適用することによって、再生後の試料の損失が約１６．６％減少した。
ＧＦＰの蛍光は構造と相関するため、ＧＦＰの再生を、緩衝液交換及びＳＤＳ除去（蛍光の回復）の間に、ＳＤＳで処理したＧＦＰ（ＳＤＳ−ＧＦＰ）の蛍光シグナルをＭｒＣＯマイクロフィルタで検出することによりモニタリングした。ＭｒＣＯマイクロフィルタによる再生中にＳＤＳ−ＧＦＰの蛍光回復を評価するために、５％ＳＤＳ−ＧＦＰの流れをマイクロチャンバに電気泳動させ、その後、ＭｒＣＯマイクロフィルタに移動させた（図１６の（ｂ）を参照）。未変性ＧＦＰの蛍光回復を検出し、蛍光シグナルにおける緩徐な減少を示した（図１１のＡ）。対照的に、５％ＳＤＳ−ＧＦＰは、ＧＦＰの再生を示す蛍光シグナルの著しい増加を示した。ある範囲のＳＤＳ濃度で処理したＧＦＰに関して、処理時間の過程で回復した蛍光の二重指数フィッティングから、再生速度定数（ｋ）及び半減時間（ｔ）の両方が推定された（図１１のＢ及び表２を参照）。回復した蛍光は試料中のＳＤＳ濃度に逆相関し、初期試料中のＳＤＳがより少ないほうが再生プロセスを促進することを示した。ＭｒＣＯマイクロフィルタアレイでの安定したＧＦＰ再生能力を図２０に示す。図２０の（ａ）は、サイドチャネル１〜６を含むオンチップ再生区画アレイの性能のグラフを示す。５％ＳＤＳ−ＧＦＰの流れの充填を、各再生区画１〜６に分散させた。回復した蛍光は、並列の各個別の区画から検出され、全６つのチャネルに亘って安定した再生効率を示した。図２０の（ｂ）は、陰性対照として５％ＳＤＳ−ＢＳＡからの再生進行曲線のグラフを示す。挿入図は、再生後のブロッティングプロファイルを示す。ＧＦＰ用ブロッティングゲルは、ストレプトアビジン−ビオチン結合を通じて固定した抗ＧＦＰ抗体を含んだ。ＢＳＡは、ＧＦＰ用ブロッティングゲルに検出可能に結合しなかった。
試料処理及びＭｒＣＯマイクロフィルタの統合使用によるアッセイ中の損失を判定するための実験を行った。マイクロチャネルアレイを備えたマイクロ流体デバイスを、チャネル中心線間の１０μｍ及び５０μｍの距離（例えば、ピッチ）で作製した。分子量（Ｍｒ）タンパク質ラダーを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離軸から横方向のマイクロチャネルアレイに移動させた（図２２及び表３を参照）。
図１２は、アッセイ中の試料の取扱及び処理から生じる移動の損失を特徴付ける顕微鏡写真図及びグラフを示す。蛍光顕微鏡写真図は、２つのモデルタンパク質（５％ＳＤＳで処理したホスホリラーゼＢ（９６ｋＤａ）及びβ−ガラクトシダーゼ（１１４ｋＤａ））に関する統合アッセイの時間展開を示す。分離軸での蛍光強度分布（灰色の線）のプロットを、ＭｒＣＯマイクロフィルタにおける蛍光強度分布（４０秒での黒色の破線）及びブロッティングアレイにおける蛍光強度分布（８７秒での黒色の破線）と比較した。矢印は、電気泳動の方向を示す。アレイのチャネルの間隔は、約１０μｍであった。チップの設計及び画像化領域を挿入図に示す。図１２は、タンパク質ゾーンのオーバーサンプリングが非分離及び分子量情報の損失を最小限度に抑えたことを示す（図２３及び表３も参照）。この場合、分子量情報の損失は約５ｋＤａであり、分離分解能（ＳＲ）の損失は４％未満であった。
図２３は、複数のモデルタンパク質（５％ＳＤＳで処理されたホスホリラーゼＢ（９６ｋＤａ）、ウシ血清アルブミン（６６ｋＤａ）及びトリプシン阻害剤（２１ｋＤａ））に関する統合されたマイクロ流体アッセイの時間展開の蛍光顕微鏡写真図を示す。分離軸での蛍光強度分布（灰色の線）のプロットを、ＭｒＣＯマイクロフィルタアレイ（黒色の破線）及びブロッティングアレイ（黒色の破線）の両方における蛍光強度分布と比較した。矢印は、電気泳動の方向を示す。アレイのチャネルの間隔は約５０μｍであった。チップの設計及び画像化領域を挿入図に示す。ＭｒＣＯマイクロフィルタアレイの間隔を空けた別個の試料は、ＰＡＧＥ分離媒体におけるタンパク質シグナルと相関した。
統合されたオンチップのレクチンブロッティングアッセイを使用して、ガラクトース欠損Ｏ−グリカンで異常にグリコシル化されたヒト免疫グロブリンＡ１（ＩｇＡ１）を評価するための実験を行った。このＩｇＡ１のグリコシル化の異常は、ＩｇＡ腎障害（ＩｇＡＮ）に典型的である。ＩｇＡＮは、高頻度で末期の腎疾患につながる、最も一般的な原発性糸球体腎炎である。具体的には、ＩｇＡ１中のα１重鎖のヒンジ領域でセリン及びスレオニン残基に付着したＯ−グリカンは、ガラクトースが欠損しており、従って、末端Ｎ−アセチル−ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）が晒されている（図２４の（ａ））。対照的に、正常なＩｇＡ１Ｏ−グリカンは、ＧａｌＮＡｃ及びガラクトースを含む。従って、異常にグリコシル化された血清ＩｇＡ１は、潜在的なグリコシル化関連ＩｇＡＮバイオマーカーである。図２４の（ａ）は、異常なグリコシル化、すなわち、ガラクトース欠損変異体（星印によって示されている２つの底部構造）を含むヒトＩｇＡ１のヒンジ領域における可能なＯ−グリカン構造の概略図を示す。Ｏ−グリカン付着の潜在性部位としてのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基を更に示す。典型的には、６つの部位がグリコシル化される。ＮｅｕＡｃはＮ−アセチルノイラミン酸を示し、Ｇａｌはガラクトースを示す。図２４の（ｂ）は、還元ＰＡＧＥ条件と比較した、ガラクトース欠損ＩｇＡ１（−ｇ）骨髄腫タンパク質及び正常ヒト血清由来のＩｇＡ１（＋ｇ）の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの蛍光画像（図２４の（ｂ）の左）、並びに正常ヒト血清ＩｇＡ１（＋ｇ）と比較したガラクトース欠損ＩｇＡ１（−ｇ）骨髄腫タンパク質のＨＡＡブロッティング（図２４の（ｂ）の右）を示す。ニワマイマイ（ＨＡＡ）は、ガラクトース欠損ＩｇＡ１２１上の末端ＧａｌＮＡｃに特異的であった。４〜１２％のプレキャストポリアクリルアミドスラブミニゲルを、ｐＨ８．３のトリス−グリシン緩衝液と共に使用した。弱い陽性反応（非特異的）が、還元条件下で正常ヒトＩｇＡ１から観察された。Ｈ鎖及びＬ鎖のみを示す還元条件と比較して、ＩｇＡ１タンパク質は、非還元条件下でＩｇＧ（１５０ｋＤａ）から良好に分解された１６０ｋＤａの単量体形態を示す。
ＩｇＡＮを有する患者からのＩｇＡ１に見られる異常に似た天然のガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質へのレクチンの結合を評価するための実験を行った。ニワマイマイ（ＨＡＡ）由来のレクチンは、ガラクトース欠損ＩｇＡ１２１上の末端ＧａｌＮＡｃに特異的であり、そのため、ブロッティング領域に固定された。健康な固体の血清から精製され正常にグリコシル化されたＩｇＡ１を陰性対照（例えば、ＨＡＡとの相互作用が予測されない）として使用した。従来のＨＡＡレクチンスラブゲルブロッティングを行い（図２４の（ｂ））、ＨＡＡはＩｇＡ１骨髄腫タンパク質に結合し、ＩｇＡ１のＯ−グリカンがガラクトース欠損であることを確認した。ＨＡＡは、正常ヒト血清由来のＩｇＡ１には結合せず、このため、このＩｇＡ１が正常にグリコシル化されたことが示された。還元条件下で非特異的（偽）反応を観察した。
蛍光標識が付されたガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質（緑色）のオンチップ非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、存在する５種に関して１．３の平均分離分解能（ＳＲ）（図１３のＡ）を得た。オンチップ分析は、スラブゲルと一致していたが（図２４の（ｂ）を参照）、３２秒の分離時間を要した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥタンパク質ラダー（６８〜２００ｋＤａ、赤色フルオロフォアで標識付与）を同時に分離し、第２の光学チャネルで観察した（図１３のＡ）。図１３のＡは、分子量ラダー及び骨髄腫ＩｇＡ１のサイジングの２色モニタリングの蛍光顕微鏡写真図を示す。３つのＳＤＳ処理条件（３％ＳＤＳ、５％ＳＤＳ及び１０％ＳＤＳ）下で、ミオシン重鎖（２００ｋＤａ）、β−ガラクトシダーゼ（１１４ｋＤａ）、ホスホリラーゼＢ（９６ｋＤａ）及びヒト血清アルブミン（６８ｋＤａ）を使用して、線形較正曲線（図１３のＡの右）を得た。線形較正曲線を、未知のタンパク質の分子量の計算に使用した。２色モニタリングは、未知のタンパク質の分子量（Ｍｒ）較正を可能にし、線形較正曲線を介してサイズ情報を与えた（Ｒ2 ＞０．９６）。ガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質のサイジングのために５％ＳＤＳ処理を適用した。較正関係（ｌｏｇ（Ｍｒ）＝（−０．１３×移動度）＋２．６）を使用して、ＩｇＡ１の分子量が、予測した単量体ＩｇＡ１の分子量と一致して（図１３のＡの右を参照。星印は、単量体ＩｇＡ１のサイズを示す）、１６０ｋＤａであると判定した（図１３のＡ）。種３及び種４のサイズは夫々、１４１ｋＤａ及び８５ｋＤａとして割り当て、ＩｇＡのフラグメントと一致し、種３は、１つの軽鎖（Ｌ）を欠いた１４１ｋＤａの単量体と一致し、８５ｋＤａの種４は、Ｈ（重鎖）１＋Ｌ１と一致した。種３及び種４はまた、スラブゲルサイジングでも観察された（図２４の（ｂ））。種５は、遊離染料であった（＜１ｋＤａ）。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥの後に、上述したように、ＳＤＳ除去及び緩衝液交換のために、１００秒間移動電位を印加することによって、種を、隣接するＭｒＣＯマイクロフィルタへ横方向に移動させた。その後、処理したタンパク質種をチャンバに亘ってブロッティング領域に電気泳動させた（図１３のＢ）。図１３のＢは、ガラクトース欠損ＩｇＡ１骨髄腫タンパク質のＨＡＡレクチンブロットの時間展開の蛍光顕微鏡写真図を示す。図１３のＢの下は、ブロッティングアレイにおける強度分布（１６４秒における黒色の破線）と比較した、分離軸上での蛍光強度分布（灰色の線）のグラフを示す。矢印は、電気泳動の方向を示す。アレイのチャネルの間隔は約５０μｍであった。画像化領域を挿入図に示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ軸から最終ブロッティング軸までの分子量情報の損失は約７ｋＤａであり、ＳＲの損失は５％未満であった。
未変性ＩｇＡ１（ＳＤＳの存在なし）のオンチップレクチンのブロッティングと、ＳＤＳで処理し、その後に再生したＩｇＡ１のブロッティングとを比較することによって（図１３のＣ）、サイジングしたタンパク質のレクチン認識を復元するためのオンチップ再生及びＳＤＳ除去の役割を評価した。ＨＡＡブロッティング領域に保持されたタンパク質の蛍光シグナルは、ＭｒＣＯマイクロフィルタ手法を使用して、ＳＤＳで処理したタンパク質のレクチン結合能力の約７５％の回復を示した（図１３のＣ）。この結合能力の性能は、総血清ＩｇＡの優勢なサブクラス（＞２ｍｇ／ｍＬ）である血清ＩｇＡ１のアッセイに十分であった。
レクチン結合親和性の復元におけるＳＤＳの希釈の役割を評価するために、オンチップ再生及びＳＤＳ希釈なしで、ＳＤＳ処理したＩｇＡ１のレクチンブロッティングを行った（図１３のＤ）。５％ＳＤＳの骨髄腫ＩｇＡ１を、オンチップＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に、ＭｒＣＯマイクロフィルタでの処理なしでブロッティング試薬に直接移動させた。検出可能な結合は観察されなかった。同様に、ＨＡＡブロッティング領域への分子量ラダー（６８〜２００ｋＤａ）の移動は、感知可能な結合を示さず、無視できる程度の非特異的な吸着及びサイズ排除効果を示した（図１３のＤ）。マイクロ流体ＨＡＡレクチンブロット法は、ＩｇＡＮを有する患者由来の血清ＩｇＡ１に似たＩｇＡ１のＯ−結合ガラクトース欠損の迅速な（約６分）評価を可能にした。
上記の実験は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その場所での再生及びＳＤＳ希釈、ステージ間の電気泳動移動、並びにその後の親和性ブロッティングを単一のマイクロ流体デバイスに統合した迅速な自動化されたアッセイを実証した。ＭｒＣＯマイクロフィルタのアレイは、サイジングステップ及びブロッティングステップ間でＳＤＳを除去し、ＳＤＳのサイジング後にタンパク質の結合親和性を復元した。続くレクチン捕捉グリコシル化タンパク質（標識付与又は未標識付与）の抗体プロービングは、タンパク質のサイズ、グリコシル化状態、及び免疫応答性を判定するために検出されたレクチン−糖タンパク質−抗体のサンドイッチ体をもたらした。上記の実験に記載されている標的プロテオームアッセイをＩｇＡ１の分析に使用しているが、アッセイ操作パラメータ（例えば、分離電界強度、緩衝液構成要素）並びにデバイスパラメータ（例えば、分離強度、分離ゲルの孔径分布、隣接するアレイの幾何学形状及び長さスケール）は、他の対象とされる分析物のアッセイを行うために調整されてもよい。精製し、蛍光標識が付された標的の分析を使用して、アッセイの性能特性（例えば、総アッセイ損失及びオンチップ再生プロセス）を判定した。
スラブＰＡＧＥレクチンブロッティング及びニワマイマイ（ＨＡＡ）の親和性
スラブゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロッティングを、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ＆ＸＣｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社，Ｎｏｖｅｘ）と共にｐＨ８．３のトリス−グリシン、４〜１２％プレキャストポリアクリルアミドスラブミニゲルを使用して行った。非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、タンパク質を、１２５ｍＭトリス、ｐＨ８．３、０．００５％ブロモフェノールブルー、２０％グリセロール、１２％ＳＤＳ（ゲル充填体積約２５μＬ）を含有する１５μＬの試料緩衝液に添加した。相対分子量を、タンパク質標準物質ラダー（Ａｌｌ ｂｌｕｅ，ＢｉｏＲａｄ社）を使用して推定した。スラブゲルＰＡＧＥは、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）での後染色によって可視化した。１２５Ｖで２．５時間の電気泳動後、スラブゲルを２５Ｖで２．５時間、ＰＶＤＦ膜（０．２μｍ）へ電気移動させた。洗浄緩衝液（１倍ＰＢＳ、０．５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で２回洗浄した後、ＰＶＤＦ膜を４℃で一晩、振動させながら１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）でブロッキング処理した。ビオチン化ＨＡＡレクチン（１μｇ／ｍＬ）の溶液を、ブロッキング緩衝液に添加し、室温で２時間、振動させながらインキュベートした。インキュベーション後、膜を３回夫々１０分間洗浄した。ブロッキング溶液中、１：２０００に希釈したＥｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＥＬＩＳＡグレード、１．１ｍｇ／ｍＬ）を添加して、室温で攪拌しながら１時間インキュベートした。続いて、洗浄ステップを３回繰り返し、その後に膜を水で１分間すすいだ。続いて、所望のバンド強度が達成されるまでＮｏｖｅｘ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて膜を成長させた。専用フィルタを有するＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ（ＢｉｏＲａｄ社）を使用して画像化を行った。
血清試料のレクチン応答性をそのＩｇＡ１分子同一性と相関させるために、抗ＩｇＡ抗体（α鎖特異性）を用いたウエスタンブロット法を、上記のプロトコルに従って行った。ビオチン抱合型ヤギ（Ｆａｂ’）2 抗ヒトＩｇＡ（α鎖特異性、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）を、ＩｇＡバンドを特定するための一次抗体として使用した。この検証は、レクチン親和性が、ＩｇＡ１タンパク質にのみ与えられていたことを示した。抗体プローブの場合、１％脱脂粉乳ブロッキング溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）をブロッキング処理に使用した。Ｅｘｔｒａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ＥＬＩＳＡグレード、１．１ｍｇ／ｍＬ）をブロッキング溶液に添加して室温で１時間インキュベートすることによって、二次抗体として使用した。続いて、Ｎｏｖｅｘ Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて膜を成長させ、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ（ＢｉｏＲａｄ）によって画像化した。
架橋ＰＡブロッティングゲルにおけるオンチップのレクチン結合効果との比較のために、活性なアミン表面機能を有する９６ウェルプレート（丸プレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ社）を使用して解離定数を測定した。標準的な直接ＥＬＩＳＡプロトコルに従って、ビオチン抱合型ＨＡＡをウェルの表面に固定した。ＰＢＳ緩衝液及びＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ Ｔ２０（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を、洗浄ステップ及びブロッキングステップに使用した。４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒで標識が付され連続希釈したＩｇＡ１（ガラクトース欠損）溶液を、室温で２時間ウェルでインキュベートした。放出蛍光を、ＴＥＣＡＮプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｖ２００ Ｐｒｏ）を使用して読み取った。
オンチップの解離定数を測定するために、ブロッティングゲルを、５％Ｔ、３．３％Ｃの前駆体溶液（０．４ｍｇ／ｍＬストレプトアビジン−アクリルアミド及び１ｍｇ／ｍＬビオチン化ＨＡＡを含有する１倍トリス−グリシン未変性電気泳動緩衝液で希釈）を充填した領域を紫外線励起（約１２．５ｍＷ／ｃｍ2 ）に３３０秒間露光することによって生成した。４８８ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒで標識が付され連続希釈したＩｇＡ１（ガラクトース欠損）溶液をマイクロ流体チップに電気泳動させ、ブロッティングゲルプラグに結合させた。ブロッティングゲル上で結合した蛍光を測定した。解離定数を、以下の結合式に反応曲線をフィッティングさせることによって得た。
Ｂ＝Ｂmax *Ｃ／（Ｋd ＋Ｃ）
式中、Ｂは結合複合体からのシグナルであり、Ｃは抗原濃度である。スラブゲルＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びレクチンブロッティングを示す図２４と比較すると、マイクロ流体チップの多孔性ポリマーネットワークは不均一相を生成して、高い表面積体積比の構造をもたらし、より効果的な結合を可能にした。レクチン結合ポリマー材料と併せて、電気泳動移送を使用して、ＨＡＡ結合部位に近接した試料中のタンパク質を移動させ、結合プロセスを促進した。
上記の実施形態は、理解し易くするために例証及び例示としてある程度詳細に記載されているが、当業者には、本開示の教示に鑑みて、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲から逸脱することなく、特定の変更及び修正が行われてもよいことは容易に明らかである。本明細書に使用されている専門用語は、具体的な実施形態について説明するためだけのものであり、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本発明に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本発明に包含される。
ある範囲は、数値の前に「約」という用語が付いて本明細書に提示されている。「約」という用語は、「約」が先行する正確な数字、並びにその用語が先行する数字に近い数字又はその用語が先行する数字に近似した数字を文言的に支持するために本明細書に使用されている。数字が、具体的に述べられた数字に近いか又は近似しているかどうかを判定する際に、近いか又は近似している述べられていない数字は、数字が示されているという点において、具体的に述べられた数字の実質的な同等物を与える数字であり得る。
特に定義されていない限り、本明細書に使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等である全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料を本明細書に記載している。
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本発明がそのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要がある。
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び請求項で用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、請求項がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（ｓｏｌｅｌｙ）」、「のみの（ｏｎｌｙ）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（ｎｅｇａｔｉｖｅ）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されてもよく、又はいずれかの特徴と容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
従って、前述の内容は本発明の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることは明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者により与えられた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含むことを意図するものである。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に限定されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲により具体化される。
本出願は、米国特許法１１９条に基づいて、２０１０年１２月３日に出願された米国仮特許出願第６１／４１９，７６１号明細書及び２０１１年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／５６０，１６７号明細書の優先権を主張しており、夫々の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

Claims (15)

  1. マイクロ流体デバイスであって、
    第１の流路を有する分離媒体と、
    該分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素と
    を備えていることを特徴とするマイクロ流体デバイス。
  2. 前記第１の流路は第１の方向軸を有し、前記第２の流路は第２の方向軸を有することを特徴とする請求項１に記載のマイクロ流体デバイス。
  3. 前記タンパク質再生要素は、サブナノ細孔のゲル膜を含んでいることを特徴とする請求項１又は２に記載のマイクロ流体デバイス。
  4. 前記分離媒体と流体連通し、第３の流路を有する結合媒体を更に備えていることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  5. 前記結合媒体は、支持体と安定して会合している結合メンバーを含んでいることを特徴とする請求項４に記載のマイクロ流体デバイス。
  6. 前記分離媒体と流体連通する充填媒体を更に備えていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  7. 前記タンパク質再生要素が、前記分離媒体の第１の側と隣接し、結合媒体が、前記第１の側の反対側の前記分離媒体の第２の側と隣接し、前記充填媒体が、前記第１の側と第２の側との間の前記分離媒体の第３の側と隣接するように構成されていることを特徴とする請求項６に記載のマイクロ流体デバイス。
  8. 前記分離媒体に、方向が異なる第１及び第２の電場を印加するように構成されていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  9. 緩衝液を更に備えており、該緩衝液は、任意には界面活性剤を含んでいることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイス。
  10. （ａ）マイクロ流体デバイスに流体試料を導入することであって、前記マイクロ流体デバイスは、
    （ｉ） 第１の流路を有する分離媒体と、
    （ｉｉ）該分離媒体と流体連通し、第２の流路を有するタンパク質再生要素と
    を備えていることと、
    （ｂ）前記流体試料に前記分離媒体を通過させ、分離した試料を生成することと、
    （ｃ）前記分離した試料を再生条件に供して、再生した試料を生成することと
    を有することを特徴とする方法。
  11. 前記再生した試料を結合媒体に移動させることを更に有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
  12. 前記試料中の１以上の分析物の有無を検出することを更に有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. 前記移動させることは、前記結合媒体に結合したタンパク質性結合メンバーに前記試料を接触させることを含むことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
  14. （ａ）請求項１乃至９のいずれか一項に記載のマイクロ流体デバイスと、
    （ｂ）該マイクロ流体デバイスに電場を印加するように構成されている電場発生器と
    を備えていることを特徴とするシステム。
  15. 試料中の検出可能な標識を検出するように構成されている検出器を更に備えていることを特徴とする請求項１４に記載のシステム。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2851433B1 (en) * 2008-08-01 2017-10-11 Brown University System and methods for determining molecules using mass spectrometry and related techniques
AU2010249678B2 (en) 2009-05-19 2014-08-28 The Regents Of The University Of California Multi-directional microfluidic devices and methods
US8921123B2 (en) 2010-11-23 2014-12-30 The Regents Of The University Of California Multi-directional microfluidic devices comprising a pan-capture binding region
CA2819237A1 (en) 2010-12-03 2012-06-07 The Regents Of The University Of California Protein renaturation microfluidic devices and methods of making and using the same
US9108195B2 (en) 2011-06-24 2015-08-18 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices and methods for separating and detecting constituents in a fluid sample
US9841417B2 (en) 2011-09-30 2017-12-12 The Regents Of The University Of California Microfluidic devices and methods for assaying a fluid sample using the same
WO2014043143A1 (en) 2012-09-11 2014-03-20 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
EP3257952B1 (en) 2012-09-11 2020-02-12 Life Technologies Corporation Nucleic acid amplification
EP2917742B1 (en) 2012-11-12 2018-11-07 The Regents of The University of California Electrophoretic bar code assay devices and methods for making and using the same
JP5951527B2 (ja) * 2013-03-07 2016-07-13 株式会社東芝 検体検出装置及び検出方法
EP2965083B1 (en) * 2013-03-07 2019-07-03 The Regents of The University of California Electrophoretic separation devices and methods for using the same
JP6151128B2 (ja) 2013-08-12 2017-06-21 株式会社東芝 半導体マイクロ分析チップ及びその製造方法
CN105849563B (zh) * 2013-10-22 2018-07-27 加利福尼亚大学董事会 微流体测定装置及其制造和使用方法
EP2986359A4 (en) 2014-03-11 2017-02-15 Bio-rad Laboratories, Inc. Dip-stick western blot

Family Cites Families (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5314804A (en) 1992-03-24 1994-05-24 Serim Research Corporation Test for Helicobacter pylori
US5637469A (en) 1992-05-01 1997-06-10 Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and apparatus for the detection of an analyte utilizing mesoscale flow systems
DE4244082C2 (de) 1992-12-24 1994-11-03 Etc Elektrophorese Technik Wes Verfahren zur hochauflösenden Zweidimensional-Elektrophorese und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens
US6001229A (en) 1994-08-01 1999-12-14 Lockheed Martin Energy Systems, Inc. Apparatus and method for performing microfluidic manipulations for chemical analysis
DE19856064C2 (de) 1998-12-04 2000-11-30 Invitek Gmbh Universelles Verfahren zur Isolierung von DNA aus beliebigen Ausgangsmaterialien
US6818112B2 (en) 1999-04-20 2004-11-16 Target Discovery, Inc. Protein separation via multidimensional electrophoresis
WO2000073799A1 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Caliper Technologies Corp. Microscale assays and microfluidic devices for transporter, gradient induced, and binding activities
US6613581B1 (en) 1999-08-26 2003-09-02 Caliper Technologies Corp. Microfluidic analytic detection assays, devices, and integrated systems
US7390675B2 (en) 1999-10-15 2008-06-24 Christopher Feistel Multi-functional and configurable assay
US6784982B1 (en) 1999-11-04 2004-08-31 Regents Of The University Of Minnesota Direct mapping of DNA chips to detector arrays
US7329388B2 (en) 1999-11-08 2008-02-12 Princeton Biochemicals, Inc. Electrophoresis apparatus having staggered passage configuration
US6974527B2 (en) 2000-06-06 2005-12-13 Spectrumedix Llc Multidimensional separations employing an array of electrophoresis channels
US6737260B1 (en) 2000-09-29 2004-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Sequences encoding PhzO and methods
US6649419B1 (en) * 2000-11-28 2003-11-18 Large Scale Proteomics Corp. Method and apparatus for protein manipulation
US6418968B1 (en) 2001-04-20 2002-07-16 Nanostream, Inc. Porous microfluidic valves
CN1325658C (zh) 2001-04-23 2007-07-11 三星电子株式会社 包含mosfet分子检测芯片和采用该芯片的分子检测装置以及使用该装置的分子检测方法
US7641780B2 (en) 2001-05-01 2010-01-05 Calibrant Biosystems, Inc. Two-dimensional microfluidics for protein separations and gene analysis
US6974526B2 (en) 2001-05-01 2005-12-13 Calibrant Biosystems, Inc. Plastic microfluidics enabling two-dimensional protein separations in proteome analysis
US20030089605A1 (en) 2001-10-19 2003-05-15 West Virginia University Research Corporation Microfluidic system for proteome analysis
DE10161577B4 (de) * 2001-12-14 2008-01-10 Scil Proteins Gmbh Verfahren zur Renaturierung von Proteinen
US20030127331A1 (en) 2002-01-10 2003-07-10 Leka George T. Two-dimensional electrophoresis method and cassette
US7112444B2 (en) 2002-04-24 2006-09-26 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of performing gradient-based assays in a microfluidic device
JP2004061319A (ja) 2002-07-29 2004-02-26 Kawamura Inst Of Chem Res マイクロ流体デバイス及びその使用方法
US20040112751A1 (en) * 2002-08-26 2004-06-17 Jongyoon Han Multidimensional electrophoresis and methods of making and using thereof
JP4047118B2 (ja) * 2002-09-20 2008-02-13 アボットジャパン株式会社 免疫学的構造を回復したウイルス抗原を使用した抗ウイルス抗体測定方法並びに測定キット
TW590982B (en) 2002-09-27 2004-06-11 Agnitio Science & Technology I Micro-fluid driving device
US20060211055A1 (en) 2002-11-12 2006-09-21 Caliper Life Sciences, Inc. Capture and release assay system and method
WO2004061085A2 (en) 2002-12-30 2004-07-22 The Regents Of The University Of California Methods and apparatus for pathogen detection and analysis
US6969452B2 (en) 2003-02-28 2005-11-29 Combisep, Inc. Two-dimensional protein separations using chromatofocusing and multiplexed capillary gel electrophoresis
US20060191792A1 (en) 2003-08-25 2006-08-31 Herr Amy E Method and apparatus for gel electrophoretic immunoassay
US20050106740A1 (en) 2003-11-13 2005-05-19 Boyes Barry E. Methods, systems and devices for performing analytical protocols
WO2005068993A1 (en) 2003-12-23 2005-07-28 Caliper Life Sciences, Inc. Analyte injection system
EP1740284A4 (en) 2004-03-19 2011-04-06 Perkinelmer Las Inc SEPARATION PLATFORM BASED ON ELECTRO-OSMOSIS SURFACE CHROMATOGRAPHY
JP2006010529A (ja) 2004-06-25 2006-01-12 Canon Inc 磁性粒子分離装置および分離方法
WO2006102516A2 (en) 2005-03-23 2006-09-28 California Institute Of Technology Devices exhibiting differential resistance to flow and methods of their use
US7828948B1 (en) * 2005-10-06 2010-11-09 Sandia Corporation Preconcentration and separation of analytes in microchannels
US7828949B2 (en) 2005-12-08 2010-11-09 Electronics And Telecommunications Research Institute Biomolecule detection device, mobile phone for biomolecule detection, and biomolecule detection method
US9718676B2 (en) 2006-09-14 2017-08-01 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Polymeric nanopillars and nanotubes, their manufacture and uses
US8329016B1 (en) 2007-07-30 2012-12-11 Sandia Corporation Microfluidic device having an immobilized pH gradient and PAGE gels for protein separation and analysis
US20090194483A1 (en) 2008-01-31 2009-08-06 Robotti Karla M Microfluidic device having monolithic separation medium and method of use
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US20130078663A1 (en) 2009-12-02 2013-03-28 Amy E. Herr Pore-Limit Electrophoresis (PLE) Microchannel Assays
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