JP2014026111A

JP2014026111A - 微分干渉熱レンズ顕微鏡

Info

Publication number: JP2014026111A
Application number: JP2012166198A
Authority: JP
Inventors: Hisashi Shimizu; 久史清水; Kazuma Mawatari; 和真馬渡; Takehiko Kitamori; 武彦北森
Original assignee: Institute of Microchemical Technology
Current assignee: Institute of Microchemical Technology
Priority date: 2012-07-26
Filing date: 2012-07-26
Publication date: 2014-02-06

Abstract

【課題】マイクロあるいはナノスケールの微細空間内の試料溶液中の分子をより高精度で定性、定量することを可能にする微分干渉熱レンズ顕微鏡を提供する。
【解決手段】プローブ光Ｐを一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２とに分離する第１プリズム１０と、一方のプローブ光Ｐ１及び励起光Ｓと他方のプローブ光Ｐ２とを所定の分離幅Ｌで平行にしつつ試料溶液３中に絞り込んで出射させる第１レンズ体１１と、試料溶液３を通過して入射した一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２とを所定の光線交差角θ２で交差するように出射させる第２レンズ体１２と、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を合成干渉させる第２プリズム１３とを備え、微細空間６を境に一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系を対称にして構成する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微分干渉熱レンズ顕微鏡に関する。

従来、マイクロスケールの微細空間は、混合・反応時間の短縮化、試料・試薬量の大幅な低減、小型デバイス化などが期待されており、診断・分析などの分野で利用することが期待されている。例えば、数センチメートル角のガラス基板（マイクロチップ）上に、数百μｍ以下の溝からなるマイクロチャネル（マイクロ流路）を形成し、このマイクロチャネルに化学システムを集積化する。

また、近年、ナノスケールの微細空間は、マイクロスケールの微細空間と比べて溶液物性が特異な性質を示すことから、ガラス基板上に、数十〜数百ｎｍのナノチャネル（ナノ流路、拡張ナノ流路）を形成し、このナノチャネルの特異な化学・物理的特性を利用して革新的機能デバイスを実現することがさらに大きな注目を集めている。例えば、大きさが数十μｍの細胞一個のタンパク質などを、それよりも圧倒的に小さな空間である拡張ナノ空間で分析することで、これまでの多数細胞の平均ではわからなかった各細胞固有の機能解析が可能となり、癌診断などへと応用できる。また、極微細空間であることを利用して分子一個で測定でき、超高感度な分析ツールになることも期待される。

ここで、マイクロチャネルやナノチャネルを備えた革新的な機能デバイスを実現するにあたり、その性能（物質量）を正確に捉えるための実験、研究ツールを創作することも非常に重要である。

そして、マイクロチャネル内の試料溶液に対しては、熱レンズ顕微鏡（ＴＬＭ）を用いることにより、試料溶液の分子濃度（多数の分子の個数平均）を高精度で測定することができる（例えば、特許文献１参照）。具体的に、熱レンズ顕微鏡１では、図４に示すように、マイクロチャネル２内の試料溶液３中にビームスポット（ビームウエスト）が生じるように、励起光Ｓとプローブ光Ｐの２種類のレーザー光を試料溶液３に絞り込んで照射すると、励起光Ｓのビームスポットからの熱拡散によってプローブ光Ｐの光路に急勾配の温度分布が生成する。このとき、屈折率が温度変化と比例の関係にあるため、温度分布が光学的な凹レンズ又は凸レンズとして作用する熱レンズ４がマイクロチャネル２内に形成される。そして、試料溶液３の性質（分子３ａ濃度の大小）に応じて異なる屈折率の熱レンズ４が形成されるため、熱レンズ効果によって屈折した後のプローブ光Ｐの強度（シグナル）を捉えることで、試料溶液３の分子濃度を定量することができる。

一方で、ナノチャネル内の試料溶液に対しては、深さが数十〜数百ｎｍのナノチャネル内では形成される熱レンズの大きさが光の波長よりも小さくなり、波長よりも小さいレンズでは原理的に光が屈折しないため、熱レンズ顕微鏡を用いて試料溶液の分子濃度を定量することができない。

これに対し、本願の発明者らは、熱レンズ顕微鏡に微分干渉（ＤＩＣ）観察法の原理を取り入れ、創意工夫を重ねることにより、ナノチャネル内の試料溶液の分子濃度の定量に成功した。

具体的に、本願の発明者らによる微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａは、図５に示すように、プローブ光Ｐをプリズム５で２本に分離し、一方のプローブ光Ｐ１を励起光Ｓとともにナノチャネル１６の試料溶液３に絞り込んで照射する。これにより、励起光Ｓによる熱レンズ効果で、一方のプローブ光Ｐ１の光路の屈折率が試料溶液３の分子３ａ濃度の大小に応じて変化し、一方のプローブ光Ｐ１と、単に試料溶液３を透過した他方のプローブ光Ｐ２との間に、屈折率の違いに応じて位相差が生じる。そして、ナノチャネル１６から出射した一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２をコンデンサレンズ６及びプリズム７で干渉させて合成し、この一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の位相差に応じた合成干渉波の強度（シグナル）を検出器８で検出する。このとき、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の位相差は試料溶液３の分子３ａ濃度に相関するため、ナノチャネル１６内の試料溶液３に対しても、上記のように一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を干渉合成したプローブ光の合成干渉波Ｐ３の強度を捉えることで、その分子３ａ濃度を定量することが可能になる（例えば、非特許文献１参照）。

特開２００２−２９６２０７号公報

H.Shimizu，K.Mawatari，T.Kitamori、「Development of a Differential Interference Contrast Thermal Lens Microscope for Sensitive Individual Nanoparticle Detection in Liquid」、Analytical Chemistry、ACS Publication、８１、ｐ．９８０２−９８０６、２００９

ここで、上記従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいては、図５に示すように、微分干渉（ＤＩＣ）観察顕微鏡の構成を用い、ナノチャネル（微細空間）１６内の試料溶液３を境に、上側の一方の側Ｔ１にプローブ光Ｐを２本に分離するとともに試料溶液３に絞り込んで照射させるための第１プリズム５と対物レンズ９を配置し、下側の他方の側Ｔ２に、２本のプローブ光Ｐ１、Ｐ２を干渉させて合成するためのコンデンサレンズ６と第２プリズム７を配置している。すなわち、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいては、一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系（レンズ同士やプリズム同士）が異なる非対称光学型で構成されている。

また、この微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａでは、図６に示すように、励起光Ｓの熱レンズ効果に他方のプローブ光Ｐ２が影響されないように、光学顕微鏡用の微分干渉プリズムよりもはるかに分離幅Ｌ（一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の間隔）を大きくするプリズム５を用いる必要がある。すなわち、光線分離角θ１の大きなプリズム５を専用に設計・製作する必要がある。また、このようなプリズム５を製作する際には、方解石などのより複屈折の大きな素材が必要になる場合がある。さらに、このようなプリズム５を用い、光線分離角θ１が拡大することで、その公差も大きくなってしまう。

また、微分干渉の原理では、図７（ａ）に示すように、対物レンズ９を通した後に２本の光線Ｐ１、Ｐ２が互いに平行になることが重要であり、このためにプリズム５の光線交差面５ａと対物レンズ９の後方焦点面９ａが一致していることが必要になる。そして、これを満たすために、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａでは、まず、上側の第１プリズム５について、光線交差面５ａが対物レンズ９の後方焦点面９ａに一致するようにその高さ及び挿入角を調整する。また、下側の第２プリズム７についても、光線交差面７ａとコンデンサレンズ６の後方焦点面６ａが一致するようにその高さ及び挿入角を調整する。

しかしながら、非対称光学型の従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいては、上側の第１プリズム５の公差と下側の第２プリズム７の公差が異なるため、図７（ｂ）に示すように、通常、上下のプリズム５、７で分離幅Ｌ１、Ｌ２も異なっている。特に、方解石を用いた場合、天然素材であるために品質が安定せず、例えば５．３±０．３μｍなど、分離幅Ｌの公差及び上下の分離幅Ｌ１、Ｌ２の差は顕著に大きくなってしまう。

このようなことから、非対称光学型の従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいては、図７（ｃ）に示すように、下側の第２プリズム７の高さ及び挿入角を調整するだけでは一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の光路を再び一致させることができず、精度のよい干渉を得ることができない。このため、精度のよい干渉を得るためには、上下どちらかのプリズム５、７の公差を測定し、それに合わせるようにもう一方のプリズム５、７を設計・製作することが不可欠となる。さらに、公差を正確に測定することは非常に困難であるため、実際には数回にわたって繰り返しプリズム５、７の設計・製作を行なうことが必要になってしまう。

また、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、ナノチャネル内の試料溶液の分子濃度の測定を可能にしたことで、革新的機能デバイスの実現に多大な貢献を果しうるものであるが、上記のように非対称光学型であるが故に、例えば、試料溶液の分子を１００分子単位で捉えることが限界で、試料溶液の分子を単一分子で捉えるほどに、干渉精度の向上を図ることが非常に難しい。

このため、化学、バイオ、エネルギー分野などでは、ナノチャネルの化学・物理的特性を利用する革新的機能デバイスを早期に実現するために、試料溶液の分子を単一分子で捉えることを可能にするほどの顕微鏡の開発が非常に強く望まれている。

本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡は、マイクロあるいはナノスケールの微細空間内の試料溶液中の分子を定性あるいは定量するための微分干渉熱レンズ顕微鏡であって、入射したレーザー光の励起光及びプローブ光を複屈折させ、前記プローブ光を前記励起光と同光路の一方のプローブ光と、他光路の他方のプローブ光とに分離するとともに、所定の光線分離角となるように前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブとを出射させる第１プリズムと、複数のレンズを組み合わせてなり、前記第１プリズムから入射した前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブ光とを、所定の分離幅で平行にしつつ前記試料溶液中に絞り込んで出射させる第１レンズ体と、複数のレンズを組み合わせてなり、前記試料溶液を通過して入射した前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブ光とを前記光線分離角と同角の光線交差角で交差するように出射させる第２レンズ体と、前記第２レンズ体から入射した前記一方のプローブ光と前記他方のプローブ光を複屈折させるとともに合成干渉させる第２プリズムと、前記第２プリズムから出射した前記一方のプローブ光と前記他方のプローブの光合成干渉波を検出する検出器とを備えており、前記微細空間を境に一方の側に設けられた前記第１プリズムと前記第１レンズ体と、他方の側に設けられた前記第２プリズムと前記第２レンズ体とのプリズム同士、レンズ体同士が同じ光学特性を備え、前記微細空間を境に一方の側と他方の側の光学系を対称にして構成されていることを特徴とする。

また、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、前記第１レンズ体及び前記第２レンズ体が対物レンズであることが望ましい。

さらに、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、前記所定の分解幅が１．０μｍ以上となるように構成されていることが望ましい。

また、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡において、前記第１レンズ体及び前記第２レンズ体は、開口数ＮＡがＮＡ≧０．５３となるように構成されていることが望ましい。

本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡と同様に、プローブ光を第１プリズムで２本に分離し、一方のプローブ光を励起光とともに微細空間内の試料溶液に絞り込んで照射する。これにより、励起光による熱レンズ効果で、一方のプローブ光の光路の屈折率が試料溶液の分子濃度の大小に応じて変化し、一方のプローブ光と、単に試料溶液を透過した他方のプローブ光との間に、屈折率の違いに応じて位相差が生じる。そして、第２レンズ体と第２プリズムで一方のプローブ光と他方のプローブ光を合成干渉させ、この一方のプローブ光と他方のプローブ光の位相差に応じた合成干渉波の強度（シグナル）を検出器で検出することによって、試料溶液の分子濃度を定量することが可能になる。

そして、このとき、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、微細空間を境に一方の側に設けられた第１プリズムと第１レンズ体と、他方の側に設けられた第２プリズムと第２レンズ体とのプリズム同士、レンズ体同士が同じ光学特性を備え、微細空間を境に一方の側と他方の側の光学系を対称にした対称光学型で構成されている。

このため、例えば、第１プリズムと第２プリズムの２個の同じプリズムを同時に製作することで、これらプリズムの公差を等しくすることができ、一方の側と他方の側（上下）のプリズムの分離幅を等しくすることが可能となる。これにより、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡と比較し、プリズムの公差の測定やプリズムの再設計・製作が不要となり、光学系の調整のみで精度の良い干渉を確実に得ることが可能になる。

また、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、非対称光学型であるが故にバックグラウンド（試料溶液に分子が存在しない場合における合成干渉波と入射させた初期のプローブ光の強度の比）が１／１００程度であり、試料溶液の分子を１００分子単位で捉えることが限界であったが、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、高精度の干渉が得られることにより、バックグラウンドを１／１０００程度にすることが可能になる。そして、このバックグラウンドの低減効果が１／１０００程度に向上することで、微弱な合成干渉波も正確に捉えることができ、これにより、試料溶液の分子を精度よく定量できるとともに、試料溶液の分子を単一分子で捉え、分子の定性にも十分に対応できうる。

また、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、第１レンズ体及び第２レンズ体を対物レンズにすることで、容易に位置合わせを行なって、より確実且つ簡便に精度の良い干渉を得ることが可能になる。

さらに、本発明の微分干渉熱レンズ顕微鏡においては、一方のプローブ光と他方のプローブ光の分解幅を１．０μｍ以上にすることで、また、第１レンズ体及び第２レンズ体の開口数ＮＡをＮＡ≧０．５３にすることで、さら確実に精度の良い干渉を得ることが可能になり、試料溶液の分子を単一分子で捉えることも可能になる。

本発明の一実施形態に係る微分干渉熱レンズ顕微鏡を示す図である。熱レンズ効果の温度分布を示すシミュレーション結果である。励起光スポット中心に対する距離と温度差の関係を示すシミュレーション結果である。熱レンズ顕微鏡を示す図である。従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡を示す図である。微分干渉熱レンズ顕微鏡の第１プリズムと第１レンズ体を示す図である。従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡の問題点の説明に用いた図である。

以下、図１から図３（及び図４から図７）を参照し、本発明の一実施形態に係る微分干渉熱レンズ顕微鏡について説明する。

ここで、本実施形態は、例えば、ガラス基板（マイクロチップ）上に形成されたチャネル（ナノスケールの微細空間）の化学・物理的特性を利用する機能デバイスを実現するにあたり、チャネル内の分子の物質量を捉えるための実験、研究ツールとして利用可能な微分干渉熱レンズ顕微鏡に関し、特に、ナノチャネル内の試料溶液中の分子を単一分子レベルで捉え、分子数の定量を精度よく行なうことが可能な微分干渉熱レンズ顕微鏡に関するものである。なお、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡は、勿論、ナノチャネルに限らず、マイクロチャネル（マイクロスケールの微細空間）内の試料溶液の分子の定量、定性にも利用可能である。

図１に示すように、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂは、レーザー光発生手段である光源（不図示）と、第１プリズム１０と、第１レンズ体１１と、第２レンズ体１２と、第２プリズム１３と、カラーフィルタ１４と、偏光フィルタ１５と、検出器８とを備えて構成されている。

レーザー光発生手段の光源は、加熱用の励起光Ｓと検出用のプローブ光Ｐの２種類のレーザー光を互いの光軸を一致させて第１プリズム１０に照射する。また、本実施形態では、励起光Ｓとして、波長が４８８ｎｍ（あるいは４７６．５ｎｍ）のＡｒ^＋レーザー光を用い、プローブ光Ｐとして、波長が６３３ｎｍのＨｅ−Ｎｅレーザー光を用いる。

第１プリズム１０は、ナノチャネル１６を境に上側の一方の側Ｔ１に設けられている。また、本実施形態の第１プリズム１０は、ノマルスキ型の複屈折性プリズムであり、例えば、方解石を用い、厚さを１．６ｍｍとし、その複屈折率が０．１７２となるように形成されている。
そして、この第１プリズム１０は、図１及び図６に示すように、光源から入射した励起光Ｓ及びプローブ光Ｐを複屈折させ、プローブ光Ｐを一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の２つに分離し、これら一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２が所定の光線分離角θ１で交差するように出射させる。また、入射した励起光Ｓを一方のプローブ光Ｐ１と互いの光軸が一致するようにして、すなわち、励起光Ｓの進路が一方のプローブ光Ｐ１と同光路となるようにし、他方のプローブ光Ｐ２と他光路となるようにして出射させる。

第１レンズ体１１は、複数のレンズを組み合わせて構成したものであり、本実施形態では、対物レンズが用いられている。また、第１レンズ体１１は、ナノチャネル１６を境に上側の一方の側Ｔ１に設けられるとともに、一方のプローブ光Ｐ１（及び励起光Ｓ）と他方のプローブ光Ｐ２が交差する第１プリズム１０の光線交差面１０ａと、後方焦点面１１ａの位置が一致するように設けられている。さらに、第１レンズ体１１は、前方焦点面（ビームスポット、ビームウエスト）１１ｂがナノチャネル１６内の所定位置、例えば幅方向略中央に位置するように設けられている。
そして、この第１レンズ体１１は、第１プリズム１０からそれぞれ光線分離角θ１に応じた入射角で入射した一方のプローブ光Ｐ１及び励起光Ｓと他方のプローブ光Ｐ２とを、所定の分離幅Ｌで平行にしつつ試料溶液３中に絞り込むように出射させる。

第２レンズ体１２は、第１レンズ体１１と同じ光学特性を備えたものであり、本実施形態では対物レンズが用いられている。また、第２レンズ体１２は、ナノチャネル１６を境に下側の他方の側Ｔ２に設けられるとともに、前方焦点面１２ａが第１レンズ体１１の前方焦点面１１ｂとナノチャネル１６内の所定位置で一致するように設けられている。
そして、この第２レンズ体１２は、ナノチャネル１６を通過し、互いの光路が平行な状態の一方のプローブ光Ｐ１及び励起光Ｓと他方のプローブ光Ｐ２を受光するとともに、後方焦点面１２ｂにおいて、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を前記光線分離角θ１と同角の光線交差角θ２で交差するように出射させる。

第２プリズム１３は、ナノチャネル１６を境に下側の他方の側Ｔ２に設けられている。また、本実施形態の第２プリズム１３は、ノマルスキ型の複屈折性プリズムであり、第１プリズム１０と同じ光学特性を備えたプリズムである。
この第２プリズム１３は、第２レンズ体１２から所定の光線交差角θ２で交差するように出射した一方のプローブ光Ｐ１及び励起光Ｓと他方のプローブ光Ｐ２とを受光し、一方のプローブ光Ｐ１（及び励起光Ｓ）と他方のプローブ光Ｐ２の光軸が一致するように複屈折させつつ、これら一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を合成干渉させる。これにより、第２プリズム１３から一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を合成干渉させたレーザー光の合成干渉波Ｐ３がシグナルとして出射される。

カラーフィルタ１４は、ナノチャネル１６を境に他方の側Ｔ２に設けられ、第２プリズム１３を出射した合成干渉波Ｐ３と励起光Ｓを受光し、励起光Ｓを除去して合成干渉波Ｐ３のみを通過させる。

偏光フィルタ１５は、ナノチャネル１６を境に他方の側Ｔ２に設けられ、カラーフィルタ１４を通過した合成干渉波Ｐ３から入射偏光に相当する偏光成分を除去し、干渉に伴う変化のみを抽出する。そして、この偏光フィルタ１５を通過した合成干渉波Ｐ３の強度を検出器８が検出する。

ここで、上記のように、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいては、ナノチャネル１６を境に一方の側Ｔ１に第１プリズム１０と第１レンズ体１１、他方の側Ｔ２に第２プリズム１３と第２レンズ体１２が設けられ、第１プリズム１０と第２プリズム１３のプリズム同士、第１レンズ体１１と第２レンズ体１２のレンズ体同士がそれぞれ、同じ光学特性を備えて構成されている。言い換えれば、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂは、ナノチャネル１６を境に一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系を対称にした対称光学型として構成されている。
なお、本発明における「同じ光学特性」は、厳密に全く同じ光学特性であるだけでなく、当然、後述する本発明の作用効果を得ることが可能な範囲の誤差を含んでもよいことを意味する。

次に、上記構成からなる本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂを用いて、ナノチャネル１６内の試料溶液３の分子３ａ濃度を測定する際には、レーザー光発生手段の光源から励起光Ｓとプローブ光Ｐの２種類のレーザー光を第１プリズム１０に照射する。すると、第１プリズム１０によってプローブ光Ｐが一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２に分離し、第１レンズ体１１に入射する。また、励起光Ｓは一方のプローブ光Ｐ１と重なって第１レンズ体１１に入射する。

このように対物レンズの第１レンズ体１１に入射した一方のプローブ光Ｐ１及び励起光Ｓと他方のプローブ光Ｐ２とは、それぞれ、所定の分離幅Ｌを確保して光路を平行にした状態で、ナノチャネル１６内の試料溶液３に出射される。そして、まず、励起光Ｓが試料溶液３のビームスポット（ビームウエスト）１１ｂに集中すると熱が放出され、この励起光Ｓによって発熱した領域を一方のプローブ光Ｐ１が通過する。このとき、試料溶液３中に分子３ａが存在すると、励起光Ｓによる発熱で熱レンズ効果が発現し、分子３ａの量の大小に応じた屈折率の変化が起きる。これにより、発熱領域を通過する一方のプローブ光Ｐ１は、分子３ａが存在しなければ位相が変化することなく試料溶液３中を透過し、分子３ａが存在している場合には、その分子３ａの量に応じた位相シフトを生じて試料溶液３を透過することになる。

また、他方のプローブ光Ｐ２は、第１プリズム１０の作用によって、励起光Ｓ（及び一方のプローブ光Ｐ１）から所定の分離幅Ｌで離間した試料溶液３中を通過する。このため、励起光Ｓによる熱レンズ効果の影響を受けないように分離幅Ｌ（第１プリズム１０）を設定しておくことで、他方のプローブ光Ｐ２は屈折することなく試料溶液３を通過してゆく。

そして、ナノチャネル１６の試料溶液３を通過した一方のプローブ光Ｐ１（及び励起光Ｓ）と他方のプローブ光Ｐ２は、第２レンズ体１２に入射し、所定の光線分離角θ２に応じた屈折率で屈折して第２レンズ体１２から出射する。

また、第２レンズ体１２から出射した一方のプローブ光Ｐ１（及び励起光Ｓ）と他方のプローブ光Ｐ２は、第２プリズム１３に入射し、この第２プリズム１３によって一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を干渉させて合成する。

このとき、熱レンズ効果による影響がない場合には、すなわち、試料溶液３に分子３ａが存在していない場合には、一方のプローブ光Ｐ１に屈折が生じないため、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２が合成によって打ち消され、バックグラウンドの値が検出器８による合成干渉波Ｐ３の検出強度として検出される。

一方、熱レンズ効果による影響がある場合、すなわち、試料溶液３に分子３ａが存在している場合には、一方のプローブ光Ｐ１に分子３ａの量に応じて屈折が生じ、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２との間に位相差が生じる。このため、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を合成干渉させると、位相差に応じた合成干渉波Ｐ３が残り、検出器８によってこの合成干渉波Ｐ３の強度が検出される。これにより、合成干渉波Ｐ３の強度の大小を捉えることで、ナノチャネル１６内の試料溶液３の分子３ａ濃度の測定が行なえる。

ここで、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいては、図５に示すように、第１プリズム５と第２プリズム７、第１レンズ体９と第２レンズ体６の光学特性が異なり、一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系が異なる非対称光学型である。このため、プローブ光Ｐを分離し、他方のプローブ光Ｐ２が熱レンズ効果の影響を受けないように一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の分離幅Ｌを大きく確保するほど、光学的公差が増大してしまい、第１プリズム５に入射するプローブ光Ｐに対し、バックグラウンドを１／１００程度にすることが限度であった。また、このようにバックグラウンドの低減効果が１／１００である場合には、例えば、試料溶液３中の分子を１００分子単位で捉えることが限界であり、これに応じた分子３ａ濃度の測定精度となる。

これに対し、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいては、図１に示すように、第１プリズム１０と第２プリズム１３、第１レンズ体１１と第２レンズ体１２の光学特性を同じにし、ナノチャネル１６を境に一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系を同じにした対称光学型である。このため、各光学系の公差を相殺するように容易に各光学系の位置合わせが行なえ、結果として、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａと比較し、分離した２本のプローブ光Ｐ１、Ｐ２の干渉精度が高まる。

また、例えば、第１プリズム１０と第２プリズム１３の２個の同じプリズムを同時に製作することで、これらプリズム１０、１３の公差を等しくすることができ、一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２のプリズム１０、１３の分離幅Ｌを容易に等しくすることができる。これにより、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａのように、プリズムの公差の測定やプリズムの再設計・製作が不要となり、光学系の調整のみで精度の良い干渉が得られることになる。

例えば、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａでは、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２を合成干渉させた際の光出力の計測値が１．４μWであったのに対し、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂでは、光出力の計測値が１４０ｎWとなり、この光出力の計測によっても、分離した２本のプローブ光Ｐ１、Ｐ２の干渉精度が大幅に高まることが確認されている。

このようなことから、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいては、第１プリズム１０に入射するプローブ光Ｐに対するバックグラウンドの低減効果が、微分干渉の実験的限界である１／１０００程度になる。そして、このバックグラウンドの低減効果が１／１０００程度に向上することで、微弱な合成干渉波Ｐ３も正確に捉え、例えば、試料溶液３中の分子３ａを１分子単位で捉えることも可能になりうる。

ここで、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａを用い、分離幅Ｌを５．３μｍとし、モル吸光係数が１０^７（Ｍ^−１・ｃｍ^−１）のナノ粒子を含む水溶液に熱レンズ効果を発現させた際には、ナノ粒子のシグナルとノイズの比（Ｓ／Ｎ比）が７０と実測された。
そして、この結果に基に、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａを用いて、モル吸光係数が１０^５（Ｍ^−１・ｃｍ^−１）の分子３ａのクロロホルム溶液に対し、単一分子検出が可能であるかを検討した。

この結果、表１に示すように、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａを用いると、Ｓ／Ｎ比＝２の信号が観察されることで単一分子を検出できることが期待できることが分かった。しかしながら、一般に、分析化学の分野では、Ｓ／Ｎ＞３であることが検出結果の信頼性を確保する条件として規定されているため、やはり、従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａでは、単一分子を捉えることが困難であると判断された。

これに対し、本実施形態の対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂを用いれば、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａよりも干渉の精度が大幅に改善し、プローブ光Ｐのバックグラウンドが大幅に低減するため、単一分子の検出が可能になりうる。このため、本実施形態の対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂで、単一分子を検出できるか否かの検討を行なった。

はじめに、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおいて、シグナルの値が１／２以下になるとＳ／Ｎ＜１となってしまう。これは、シグナルよりもノイズが大きくなることを意味するので、事実上、シグナルの観察が困難となる。このため、本実施形態の対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂで、単一分子を検出できるか否かを検討するにあたり、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａにおけるシグナルの１／２より小さくならないことが条件となる。

これを踏まえた上で、まず、有限要素法を用いて熱レンズ効果のシミュレーションを行なった。強度Ｐ（ＭＷ／ｃｍ^２）、変調周波数ｆ（Ｈｚ）の励起光Ｓをレンズ体１１で集光することによって発生する熱量Ｑは次の式（１）〜式（４）で表される。
式（１）〜式（４）において、α（１／ｍ）は試料溶液３の吸光係数、ω_０，ｅｘは励起光Ｓのビームウエストの半径、ｚ_ｒ，ｅｘは励起光Ｓのレイリー長、λは励起光Ｓの波長、ＮＡはレンズ体（対物レンズ）１１の開口数である。また、座標系として円筒座標を用いている。

そして、本シミュレーションでは、まず、深さ１００（μｍ）、幅と長さが無限大のマイクロスケールの微細空間２内に試料溶液３の水溶液を満たし、変調周波数ｆ＝２．５ｋＨｚとして熱伝導方程式を解析し、熱レンズ効果の温度分布を得た。図２は、励起光スポットの中心からの距離に対する温度上昇の関係をプロットしたものである。

この図２の結果に基づき、励起スポット中心と、励起スポット中心からｄ（μｍ）だけ離れた地点の温度差を計算した結果を図３に示す。この図３では、励起光スポット中心からの距離に対する励起光スポット中心との温度差の相対値の関係をプロットしており、ｄは分離幅Ｌ、△Ｔ／Ｔは信号値と読み替えることができる。

上記の表１及び図３から、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａでは、分離幅Ｌが５．３μｍで、発生した熱量の７０％をシグナルとして変換していることになる。ここで、上述した通り、単一分子を検出するためには、シグナルがこの１／２以上でなければならないので、発生した熱量の３５％以上を検出できることが必要になる。

そして、図３から、発生した熱量の３５％以上を検出するためには、分離幅Ｌを１．０μｍ以上に設定することが必要になることが分かる。
すなわち、本実施形態の対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいて、分離幅Ｌを１．０μｍ以上にすることにより、単一分子を検出することが可能になると言える。

次に、単一分子を検出するためには、レンズ体１１によって励起光Ｓを十分に小さな領域に集光することも必要になる。上記の式（１）から、発生する熱量は１／ω_０，ｅｘ ^２に比例するため、シグナルの値も１／ω_０，ｅｘ ^２に比例することが分かる。このことから、シグナルが従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａに対して１／２以上になる条件は、次の式（５）で表すことができる。

これにより、本実施形態の対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいて、ＮＡ≧０．５３のレンズ体１１（１２）を用いることにより、単一分子を検出することが可能になると言える。

したがって、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいては、ナノチャネル１６などの微細空間を境に一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２の光学系を対称にした対称光学型で構成されているため、例えば、第１プリズム１０と第２プリズム１３の２個の同じプリズムを同時に製作することで、これらプリズム１０、１３の公差を等しくすることができ、一方の側Ｔ１と他方の側Ｔ２（上下）のプリズム１０、１３の分離幅Ｌを確実に等しくすることが可能となる。これにより、従来の非対称光学型の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ａと比較し、プリズムの公差の測定やプリズムの再設計・製作が不要となり、光学系の調整のみで精度の良い干渉を確実に得ることが可能になる。

また、本実施形態の微分干渉熱レンズ顕微鏡Ｂにおいては、高精度の干渉が得られることにより、バックグラウンドを１／１０００程度にすることが可能になる。そして、このバックグラウンドの低減効果が１／１０００程度に向上することで、微弱な合成干渉波Ｐ３も正確に捉えることができ、これにより、試料溶液３の分子３ａを精度よく定量できるとともに、試料溶液３の分子３ａを単一分子で捉え、分子３ａの定性にも十分に対応できうる。

また、第１レンズ体１１及び第２レンズ体１２を対物レンズにすることで、容易に位置合わせを行なって、より確実且つ簡便に精度の良い干渉を得ることが可能になる。

さらに、一方のプローブ光Ｐ１と他方のプローブ光Ｐ２の分解幅Ｌを１．０μｍ以上にすることで、また、第１レンズ体１１及び第２レンズ体１２の開口数ＮＡをＮＡ≧０．５３にすることで、さらに確実に精度の良い干渉を得ることが可能になり、試料溶液３の分子３ａを単一分子で捉えることも可能になる。

以上、本発明に係る微分干渉熱レンズ顕微鏡の一実施形態について説明したが、本発明は上記の実施形態に限定されるものではなく、その趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更可能である。

１熱レンズ顕微鏡
２マイクロチャネル（マイクロスケールの微細空間）
３試料溶液
３ａ分子
４熱レンズ
５従来の第１プリズム
５ａ光線交差面
６コンデンサレンズ（従来の第２レンズ体）
７従来の第２プリズム
７ａ光線交差面
８検出器
９対物レンズ（従来の第１レンズ体）
９ａ後方焦点面
１０第１プリズム
１０ａ光線交差面
１１第１レンズ体
１１ａ後方焦点面
１１ｂ前方焦点面（ビームスポット、ビームウエスト）
１２第２レンズ体
１２ａ前方焦点面
１２ｂ後方焦点面
１３第２プリズム
１４カラーフィルタ
１５偏光フィルタ
１６ナノチャネル（ナノスケールの微細空間）
Ａ従来の微分干渉熱レンズ顕微鏡
Ｂ微分干渉熱レンズ顕微鏡
Ｌ分離幅
Ｐプローブ光
Ｐ１一方のプローブ光
Ｐ２他方のプローブ光
Ｐ３合成干渉波
Ｓ励起光
Ｔ１一方の側
Ｔ２他方の側
θ１光線分離角
θ２光線交差角

Claims

マイクロあるいはナノスケールの微細空間内の試料溶液中の分子を定性あるいは定量するための微分干渉熱レンズ顕微鏡であって、
入射したレーザー光の励起光及びプローブ光を複屈折させ、前記プローブ光を前記励起光と同光路の一方のプローブ光と、他光路の他方のプローブ光とに分離するとともに、所定の光線分離角となるように前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブとを出射させる第１プリズムと、
複数のレンズを組み合わせてなり、前記第１プリズムから入射した前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブ光とを、所定の分離幅で平行にしつつ前記試料溶液中に絞り込んで出射させる第１レンズ体と、
複数のレンズを組み合わせてなり、前記試料溶液を通過して入射した前記一方のプローブ光及び前記励起光と前記他方のプローブ光とを前記光線分離角と同角の光線交差角で交差するように出射させる第２レンズ体と、
前記第２レンズ体から入射した前記一方のプローブ光と前記他方のプローブ光を複屈折させるとともに合成干渉させる第２プリズムと、
前記第２プリズムから出射した前記一方のプローブ光と前記他方のプローブの光合成干渉波を検出する検出器とを備えており、
前記微細空間を境に一方の側に設けられた前記第１プリズムと前記第１レンズ体と、他方の側に設けられた前記第２プリズムと前記第２レンズ体とのプリズム同士、レンズ体同士が同じ光学特性を備え、前記微細空間を境に一方の側と他方の側の光学系を対称にして構成されていることを特徴とする微分干渉熱レンズ顕微鏡。
請求項１記載の微分干渉熱レンズ顕微鏡において、
前記第１レンズ体及び前記第２レンズ体が対物レンズであることを特徴とする微分干渉熱レンズ顕微鏡。
請求項１または請求項２に記載の微分干渉熱レンズ顕微鏡において、
前記所定の分解幅が１．０μｍ以上となるように構成されていることを特徴とする微分干渉熱レンズ顕微鏡。
請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の微分干渉熱レンズ顕微鏡において、
前記第１レンズ体及び前記第２レンズ体は、開口数ＮＡがＮＡ≧０．５３となるように構成されていることを特徴とする微分干渉熱レンズ顕微鏡。