CN109337894B - 一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物材料制备领域，涉及一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用。通过处理酵母细胞，制备高分散性功能微球，将金纳米颗粒快速自组装在处理后的酵母表面，用于免疫分析。本发明的要点在于，收集适当培养的酵母细胞，洗涤离心和甲醛处理后，用Decoating处理液处理，得到处理后的酵母微球，用处理后的酵母微球负载金纳米颗粒。本发明制备的功能微球机械刚性结构更加稳定，可快速负载金纳米颗粒且不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠，利用处理后的酵母微球负载胶体金后制备的等离子体金微球，可以显著提高在免疫分析中的灵敏度。本发明还公开了制备的酵母微球在动物免疫生物检材中的应用。

Description

一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫分析中的应用
技术领域
本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种酵母功能微球的制备方法及其在免疫 分析中的应用。
背景技术
基于微球载体的流式分析技术(如液相悬浮式生物芯片)是一种以微球为反应载体的新 型分析技术，可以实现对一种到数百种甚至更多不同的生物分子如蛋白质、多肽、核酸和药 物等目标分析物进行高灵敏度定量检测。与传统的平面分析技术如固态平面阵列式芯片、酶 联免疫(ELISA)分析技术等相比较，流式分析技术具有重复性好、反应速度快、灵活性好、 灵敏度高、可用于非常小体积中单个目标和多目标分子同时分析测定、特异性高、线性范围 宽、以及操作简便等优点，在生物、医学、环境等基础和应用研究领域具有巨大的应用前景， 因而越来越受到人们的广泛关注。可悬浮于水体中微球是流式分析技术的核心元件，因为目 标分子的捕获和检测都是在微球表面实现的。因此，微球的价格、性能是流式分析技术推广 应用的关键之一。
目前，用于流式分析测定的微球主要通过化学合成的方式制备，如聚合物微球1、磁性微 球2、二氧化硅微球3和光子晶体4等。由于流式分析方法检测的是微球表面的荧光分子，提 高微球表面的荧光信号、减少微球表面的非特异性吸附并降低检测噪声是提高流式分析灵敏 度的有效途径。近年来，将金纳米颗粒组装到微球表面形成等离子体金微球(plasmonic gold microsphere,pGM)被证明是提高流式分析检测灵敏度的有效途径之一。这是因为金纳米颗粒 表面的等离子体效应可以有效增强其表面荧光探针的荧光量子产率5-8,进而来有效提高流式 检测方法的灵敏度。pGM的另一个优势是捕获探针可以通过金-硫键的方式直接吸附到微球 表面以用于流式分析测定6,7，相对于传统的化学偶联方法如戊二醛8,9法、N-羟基琥珀酰亚 胺酯(NHS)法和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)10-12法，这种 偶联方式更加环境友好、快速、便于操作。但是，目前使用的化学合成法制备功能微球过程 中会不可避免地使用到一些对人体和环境有害的有机试剂。此外，采用传统的搅拌和挤出等 技术较难制备出尺寸、外形、表面和光学性质均一的功能微球13,14。因此，发展一种环境友 好、操作简单、低成本的方法用以大量制备性能优良、高度均一的pGM具有重要的应用价值 和研究意义。
近年来，申请人提出采用单细胞微生物制备功能微球的设想：因为大多数单细胞微生物 细胞形状具有高度均一性，且在水溶液等介质中具有较好的悬浮性。这一优点是采用化学方 法合成的微球无可比拟的。为此，申请人采用芽胞杆菌的休眠体—芽胞为材料成功地证明了 这一设想：芽胞可以用于制备成高度分散性、均一性好的功能微球；这种基于芽胞的微球表 面带有官能团(无需化学修饰)，因此可以通过化学吸附的方式在其表面吸附纳米颗粒(如金 纳米颗粒)、金属离子制备成具有不同功能的复合功能微球，在流式分析检测生物分子领域具 有巨大的应用潜力15-19。与传统的化学方法合成功能微球相比，采用单细胞微生物制备功能 微球用于流式分析具有如下优点：1)可以通过生物发酵的方式大量生产基于芽胞的功能微球， 因此，能满足价格低廉、环境友好的迫切需要；2)基于芽胞的功能微球具有形态均一、性能 稳定、自带官能团、良好刚性和光学性能等优点，特别适用于流式分析测定。但是，采用芽 胞制备功能微球的方法尚有如下问题需要解决：1)芽胞的形成周期较长(通常需要1周的时 间)，不利于高通量、快速生产功能微球；2)不同的芽胞杆菌的芽胞在形状、大小上是有差 异的，理论上可以采用不同的芽胞形状差异进行编码；但是，大多数芽胞个体大小在1μm 左右，常规流式细胞仪的分辨力不足，难以实现解码。
针对采用芽胞制备功能微球并用于流式分析测定生物靶标分子过程中所遇到的困难和问 题，本研究期望能够采用酵母细胞代替细菌芽胞制备新型功能微球。这一设想主要依据如下： 1)通常只需要1天时间就可收集并获得酵母细胞，这一生长速度比芽胞的形成速率快得多， 因此更加便宜、易得；2)已有关于活酵母细胞用于生物传感分析的研究和报道20,21，也有少 数的工作是在酵母细胞表面展示单链抗体(scFvs)(或抗原)用于流式分析检测相应的抗原 (或抗体)22,23。采用酵母细胞用于流式分析相关报导较少的主要原因包括：1)酵母表面展 示相关单链抗体或抗原蛋白需要高度专业训练，且操作过程复杂；2)不同生物分子的表面展 示效率存在差异，也并非所有捕获分子(即抗体或抗原)都能有效地、规则地展示在酵母细 胞表面上。
为了发挥生物法制备功能微球以及胶体金纳米颗粒表面效应的优势，克服细菌芽胞制备 微球时间长以及酵母表面展示困难等缺点。本研究使用灭活的酵母细胞制备基于酵母的pGM 并用于流式-荧光免疫分析测定，本发明的技术方案如下所述：1)首先使用10％甲醛使酵母 细胞失活，然后使用decoating缓冲液处理失活的酵母细胞以制备基于酵母的微球(yeast-based microspheres,YMs)。2)金纳米颗粒(胶体金)快速自组装到YMs表面，通过化学吸附形成 酵母@胶体金微球。研究decoating缓冲液处理后的酵母微球可以大大提高胶体金组装到其表 面的吸附速率和效率的机理。3)申请人以所构建的酵母@胶体金微球为检测平台，选择检测 分析伪狂犬病病毒(PRV)感染事件作为研究对象，证实酵母@胶体金微球可以用于流式分 析检测目标生物分子；申请人首先将PRV的糖蛋白E(gE)作为捕获蛋白包被在酵母@胶体 金微球的表面上，带有探针的微球悬浮在样品溶液中以捕获血清样品中的目标分子(gE蛋白 的抗体)并诱导初级免疫识别，然后再加入Alexa
Figure BDA0001791761370000031
647标记的山羊抗猪IgG并混合均匀 以启动第二次免疫识别，最后利用流式细胞仪检测标记有荧光报告分子Alexa
Figure BDA0001791761370000032
647的免 疫微球的荧光强度，其荧光强度则与样品中抗体的浓度在一定范围内呈线性关系。因此，利 用本实验所构建的方法可以实现对血清样品中的抗体组分的定性和定量分析。研究结果表明： 酵母@胶体金微球在生物分子检测的应用研究和临床疾病诊断中具有良好的应用前景。
基于酵母的特性，本发明探索出一种基于生物发酵的方法制备功能性单分散微球的新方 法，然后将胶体金纳米颗粒自组装到酵母微球表面，并成功用于免疫分析测定。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的简单快速制备高度单分散的功能 微球的方法。然后将胶体金纳米颗粒自组装在处理后的酵母表面，将其应用于免疫分析测定。
为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：
首先将培养到对数生长期的(培养约12h后，OD600值为1-2)的酵母细胞通过离心(2min，6000g min–1)收集起来，然后用去离子水洗涤菌体三次以除去多余的培养基，最后用10％的甲醛溶液重悬，4℃放置6h；再进行超声处理，然后用去除缓冲液(Decoatingbuffer)24-29处理，最后得到酵母微球，然后用该微球负载金纳米颗粒用于免疫测定分析。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
一种酵母功能微球的制备方法，包括下列步骤：
(1)配制YPD液体培养基(见实施例3)，将所述的培养基在121℃灭菌20min，用 YPD液体培养基活化酵母菌6-8h，连续活化两次，使酵母菌菌种活性处于较高的状态，当 OD600值为0.3-0.9时，按照1％(v/v)的接种比例扩大培养，然后在28℃恒温摇床中(200rpm) 培养，当培养至约10h时，开始取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次， 当培养约12h后且在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞， 并用去离子水洗涤并离心，重复3-5次；
(2)用10％浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6h，之后离心去除甲醛溶液，并 用去离子水洗涤/离心，重复3次；然后用30mL去离子水重悬湿重等于1g酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％-80％，超声处理5-30min，超 声处理为间歇操作，即在冰浴中超声3s停3s；
(3)将上步处理的酵母用去离子水离心/洗涤，重复3次；
(4)按每1g酵母菌菌体(以湿重计)需要30mL去除缓冲液(Decoating Buffer)的要求配制去除缓冲液并将酵母重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5-2h，将处理后的酵母用去 离子水离心/洗涤，重复6-10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；
(5)将制备好的胶体金纳米颗粒与制备好的浓度范围为106-108个/mL的酵母悬液混合 后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育5-60min，使胶体金颗粒均匀吸附在酵母表 面，形成酵母@胶体金的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的胶体 金纳米颗粒。
其中：
所述的酵母菌是毕赤酵母(Pichia pastoris)。但实施本发明不限于该微生物。
所述的胶体金粒径优选为8-20nm(其粒径分布范围见图4中的A图的插图)。
申请人提供了一种利用酵母菌制备的功能微球的应用方法，包括下列步骤：
(1)配制YPD液体培养基(见实施例3)，将所述的培养基在121℃灭菌20min，用 YPD液体培养基活化酵母菌6-8h，连续活化两次，使酵母菌菌种活性处于较高的状态，当 OD600值为0.3-0.9时，按照1％(v/v)的接种比例扩大培养，然后在28℃恒温摇床中(200rpm) 培养，当培养至约10h时，开始取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次， 当培养约12h后且在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞， 并用去离子水洗涤并离心，重复3-5次；
(2)用10％浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6h，之后离心去除甲醛溶液，并 用去离子水洗涤/离心，重复3次；然后用30mL去离子水重悬湿重等于1g酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％-80％，超声处理5-30min，所 述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3s停3s；
(3)将上步处理的酵母用去离子水离心/洗涤，重复3次；
(4)按照每1g酵母菌菌体(按湿重计)需要30mL去除缓冲液(Decoating Buffer)的要求配制去除缓冲液并将酵母重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5-2h，将处理后的酵母用 去离子水离心/洗涤，重复6-10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；
(5)将制备好的胶体金纳米颗粒与制备好的浓度范围为106-108个/mL的酵母悬液混合 后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育5-60min，使胶体金颗粒均匀吸附在酵母表 面，形成酵母@胶体金的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的胶体 金纳米颗粒。
其中：
所述的酵母菌是毕赤酵母(Pichia pastoris)。但实施本发明不限于该微生物。
所述的胶体金粒径优选为8-20nm。
本发明制备的酵母功能微球可应用于制备动物免疫检测或分析的生物材料上。例如制备 试纸条或试剂盒中相关载体的制备中。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
1、相对于化学合成等方法制备功能微球的方法，本发明具有操作简单，成本低，更环保， 可成批次大量制备。
2、相对于未处理的酵母细胞，本发明处理后的酵母的机械强度是原始酵母细胞的1.5倍、 刚性结构更加稳定，负载的纳米材料也不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠。
3、酵母作为天然的生物材料，表面含有丰富的功能基团，不需要复杂的活化程序即可与 金属纳米颗粒稳定结合，因此本发明制备的功能微球不会破坏纳米材料的各种活性。
4、利用本发明制备的酵母@胶体金微球用于免疫分析测定时的信噪比比基于化学偶联的 方法(EDC/NHS)提高了约49.4倍。
附图说明
图1：是未处理的原始酵母。
图2：是原始酵母、甲醛处理后的酵母、去除缓冲液处理后的酵母的各种表征。附图标记说 明：图2中的A1图、B1图和C1图分别是原始酵母细胞、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处 理后的酵母的切片TEM图像；图2中的A2图、B2图和C2图分别是原始酵母细胞、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的SEM图像；图2中的D1图和D2图分别是经 ConA-FITC染色后的甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的荧光显微镜图像；E是 从甲醛处理后的酵母中提取的蛋白的SDS-PAGE胶图；图2中的F图是甲醛处理后的酵母(·) 和去除缓冲液处理后的酵母(▲)的自动电位滴定曲线；图2中的G1图和G2图分别是甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的氮气吸附-脱附曲线，插图是相对应利用吸附分支根据 BJH模型得到的孔径分布曲线。
图3：是原始酵母细胞、甲醛处理后的酵母、处理后的酵母的原子力显微镜表征。附图标记 说明：图3中的A1、B1和C1分别是原始酵母、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵 母的表面形态的偏转图像；A2、B2和C2分别是原始酵母、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处 理后的酵母的力曲线；图3中的A3、B3和C3分别是原始酵母、甲醛处理后的酵母和去除缓 冲液处理后的酵母的杨氏模量(E)值分布的直方图。杨氏模量中位值是根据高斯模型拟合计 算得到的(以黑线表示)。
图4：是胶体金纳米颗粒、酵母@胶体金复合微球的各种表征。附图标记说明：图4中的A 图是胶体金的TEM图像，图4中的A图中的插图是胶体金的粒径分布；图4中的B是胶体金被去除缓冲液处理后的酵母吸附前后的紫外-可见光谱；图4中的C图是酵母@胶体金纳米复合材料的切片TEM图像；图4中的D图是固定在去除缓冲液处理后的酵母表面的胶体金(红色方框)HRTEM图像，图4中的D图中的插图是酵母@胶体金纳米复合材料的TEM图 像；图4中的E是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶体金纳米复合材料(红线)的 XRD图谱；单个酵母@胶体金纳米复合材料FE-SEM图像(F1)及图4中的C(F2)，N(F3)， O(F4)，S(F5)和Au(F6)元素EDS元素分析图像；图4中的G图是酵母@胶体金纳米复 合材料的SEM图像。
图5：是本发明处理后的酵母微球和酵母@胶体金微球的FT-IR、Raman和XPS表征。附图 标记说明：图5中的A图是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶体金纳米复合材料(红 线)的FT-IR光谱；图5中的B是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶体金纳米复合 材料(红线)的拉曼光谱；去除缓冲液处理后的酵母和酵母@胶体金纳米复合材料的XPS电 子射线能谱，其中；图5中的C图是去除缓冲液处理后的酵母和酵母@胶体金纳米复合材料 的扫描调查图谱，图5中的D-H图分别是Au 4f、C 1s、O 1s、N 1s和S 2p的高分辨扫描图 谱。
图6：是酵母@胶体金复合微球作为固相载体在免疫检测中的应用。附图标记说明：图6中 的A图是用于在单个酵母@胶体金-gE和去除缓冲液处理后的酵母@gE微球上检测抗gE蛋 白抗体的免疫测定方案；图6中的B1图是利用酵母@胶体金纳米复合材料检测阴性血清的散 点图；图6中的B2图是利用酵母@胶体金纳米复合材料检测阳性血清的散点图，标准阳性和 阴性血清分别通过流式细胞仪以1：1,000稀释度测量；图6中的C1图是酵母@胶体金纳米复 合材料和酵母@gE检测阴性和阳性血清的直方图；图6中的C2图是从图6中的C1图获得的 免疫分析的信噪比；图6中的D图为含有PRV gE抗体阳性血清稀释倍数的负对数值和相应 的平均荧光强度的标准曲线(稀释范围为1：320-1：23，040)；图6中的E图是对PRV等八种致病因子免疫分析的特异性实验。分别是是伪狂犬病病毒(PRV)野生型病毒，gE/gI基因缺失的伪狂犬病病毒疫苗，猪圆环病毒2型(PCV2)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)，猪细小病毒(PPV)，流行性乙型脑炎病毒(JEV)，猪瘟病毒(CSFV)和大肠杆菌(E.coli) BL21八种致病因子感染的阳性血清和PRV阴性血清对照的检测结果。
具体实施方式
实施例1(制备实施例)
本实施例以生物材料酵母菌是毕赤酵母(Pichia pastoris)作为制备功能微球的起始材料 (但不限于上述材料，酵母的具体菌株不限定)。
具体步骤如下所述：
(1)配制YPD液体培养基(见实施例3)，将该培养基在121℃灭菌20min，用YPD 液体培养基活化酵母菌6-8h，连续活化两次，使酵母菌菌种活性处于较高的状态，当OD600值为0.3-0.9时，按照1％(v/v)的接种比例扩大培养，然后在28℃恒温摇床中(200rpm)培 养，当培养至约10h时，开始取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次，当 培养约12h后且在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞，并 用去离子水洗涤并离心，重复3-5次；
(2)用10％浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6h，之后离心去除甲醛溶液，并 用去离子水洗涤/离心，重复3次；然后用30mL去离子水重悬湿重等于1g酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％-80％，超声处理5-30min，所 述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3s停3s；
(3)将上步处理的酵母用去离子水离心/洗涤，重复3次；
(4)按照每1g酵母菌菌体(以湿重计)需要30mL去除缓冲液(Decoating Buffer)的要求配制去除缓冲液并将酵母重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5-2h，将处理后的酵母用 去离子水离心/洗涤，重复6-10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；至此酵母 微球处理完毕，可以保存备用。
实施例2(应用实施例1)
制备酵母微球的方法参见实施例1。在实施例1的基础上，对本实施例所得生物酵母微 球做进一步处理，具体步骤如下：
(1)在实验室制备的胶体金(粒径优选为8-20nm)。
(2)将制备好的胶体金与实施例1制备好的酵母悬液混合后(优选浓度范围为106～108个 /mL)，置于恒温摇床中振荡孵育，使金属纳米颗粒吸附在酵母表面，形成酵母@胶体金的复 合微球。
(3)将实施例1所述的原始酵母细胞(包含但不限于上述酵母)，甲醛处理的酵母，去除缓 冲液(Decoating Buffer，配制方法参见实施例3)处理后的酵母，胶体金以及制备好的复合 微球分别用相差和荧光显微镜，透射电子显微镜镜(TEM)，扫描电子显微镜电镜(SEM)， 原子力显微镜(AFM)场发射扫描透射电子显微镜(FE-SEM)，能量色散光谱仪(EDS)和 高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)，自动电位滴定仪，Micromeritics ASAP 2020 M型分析 仪，UV-vis分光光度计，傅立叶变换红外(FT-IR)光谱仪，X射线衍射仪(XRD)，X射线 电子能谱仪(XPS)和拉曼光谱仪进行表征，观察复合微球的制备情况(上述仪器设备均为 通用商购产品)。
本实施例的实施结果见图1和图2所示。其中图1为未处理的原始酵母。图2为原始酵 母、甲醛处理后的酵母、去除缓冲液处理后的酵母的各种表征。具体来说：图2中的A1图、B1图和C1图分别是原始酵母细胞、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的切片TEM图像；图2中的A2图、B2图和C2图分别是原始酵母细胞、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液 处理后的酵母的SEM图像。图2中的D1图和D2图分别是经ConA-FITC染色后的甲醛处理 后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的荧光显微镜图像。图2中的E图是从甲醛处理后的酵 母中提取的蛋白的SDS-PAGE胶图。图2中的F图是甲醛处理后的酵母(·)和去除缓冲液处理 后的酵母(▲)的自动电位滴定曲线。图2中G1图和G2图分别是甲醛处理后的酵母和去除缓 冲液处理后的酵母的氮气吸附-脱附曲线，插图是相对应利用吸附分支根据BJH模型得到的孔径分布曲线。图3是原始酵母、甲醛处理后的酵母、处理后的酵母的原子力显微镜表征。其中：图3中的A1图、B1图和C1图分别是原始酵母、甲醛处理后的酵母和去除缓冲液处理后 的酵母的形貌图。图3中的A2图、B2图和C2图分别是原始酵母、甲醛处理后的酵母和去除 缓冲液处理后的酵母的力曲线。图3中的A3图、B3图和C3图分别是天然原始酵母、甲醛处 理后的酵母和去除缓冲液处理后的酵母的杨氏模量(E)值分布的直方图。杨氏模量中位值是 根据高斯模型拟合计算得到的(以黑线表示)。图4是胶体金纳米颗粒、酵母@胶体金复合 微球的各种表征。其中图4中的A图是胶体金的TEM图像，图4中的A图中的插图是胶体 金的粒径分布。图4中的B图是胶体金紫外-可见光谱。图4中的C图是酵母@胶体金纳米 复合材料的切片TEM图像。图4中的D图是固定在去除缓冲液处理后的酵母表面的胶体金 (红色方框)HRTEM图像。图4中的D图的插图是酵母@胶体金纳米复合材料的TEM图 像。图4中的E图是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶体金纳米复合材料(红线) 的XRD图谱；单个酵母@胶体金纳米复合材料FE-SEM图像(F1)及C(F2)，N(F3)，O (F4)，S(F5)和Au(F6)元素EDS元素分析图像。图4中的G图是酵母@胶体金纳米复 合材料的SEM图像。图5是本发明处理后的酵母微球和酵胶体金微球的FT-IR、Raman和 XPS表征。其中：图5中的A图是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶体金纳米复 合材料(红线)的FT-IR光谱。图5中的B图是去除缓冲液处理后的酵母(黑线)和酵母@胶 体金纳米复合材料(红线)的拉曼光谱。去除缓冲液处理后的酵母和酵母@胶体金纳米复 合材料的XPS电子射线能谱，其中图5中的C图是去除缓冲液处理后的酵母和酵母@胶体金 纳米复合材料的扫描调查图谱，图5中的D图-H图分别是Au 4f、C1s、O 1s、N 1s和S 2p 的高分辨扫描图谱。
以上结果表明本实施例制备的胶体金能很好的结合在处理好的酵母微球表面，形成酵母 @胶体金复合微球。
实施例3(应用实施例2)
将实施例2制备的酵母@胶体金复合微球作为载体用于伪狂犬病毒感染血清中gE抗体的 检测，具体应用步骤如下：
(1)取250μL 5×108个/mL微球与10μg mL-1gE抗原蛋白进行反应，以将gE抗原蛋白固 定在微球表面。
(2)取出反应离心管，离心后向每管加入500μL PBST缓冲液(8g NaCl、2.9gNa2HPO4·12H2O、0.2g KCl、0.24g KH2PO4和500μL Tween-20,去离子水溶解后，用1mol L–1的NaOH调节pH值至7.4,定容至1L)对免疫微球进行洗涤，离心去除洗涤液，重复洗涤 3次；
(3)用2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)溶液作为封闭剂，对标记有gE抗原蛋白(购自武汉 科前生物股份有限公司)的微球进行封闭，封闭微球表面上没有被抗原蛋白吸附的活性位点， 以减少非特异性反应。
(4)加入1.0mL待检测血清，如果血清中含有相应的抗体，就能与抗原蛋白发生特异性免 疫反应，形成微球-抗原-抗体复合体。
(5)加入1.0mL Alexa Fluor 647标记的山羊抗猪IgG(购自美国Jackson ImmunoResearch公 司)，进行第二次免疫反应，反应完成后进行充分的洗涤，以使未结合到微球表面的Alexa Fluor 647被充分洗脱下来。
(6)洗脱完成后，将免疫反应完成后的微球用200μL磷酸盐缓冲液(PBS，配方为8gNaCl、 2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2g KCl和0.24g KH2PO4,去离子水溶解后，用1mol L–1的NaOH 调节pH值至7.4,定容至1L)重悬，利用流式细胞仪检测标记到微球表面的AlexaFluor 647 的荧光信号强度。
用复合微球分别检测猪的标准阴、阳性血清，并测试了不同稀释倍数的标准阳性血清的 线性范围和对其它致病因子的特异性，结果如图6所示。图6中的B1图、B2图分别为阴性和 阳性血清的检测信号强度。可见阳性血清信号强度明显高于阴性血清，有很好的区分性。图 6中的图C1图是酵母@胶体金纳米复合材料和酵母@gE微球检测阴性和阳性血清的直方图。 图6中C2图是从图6中的C1图获得的免疫分析的信噪比。图6中的D图为标准阳性血清在 320-23040倍稀释范围内的检测线性，R2＝0.9928，表明线性良好，且有很好的灵敏度。图6 中的E图是PRV免疫分析的特异性实验。图6中的E图分别为伪狂犬病病毒(PRV)野生 型病毒，gE/gI缺失的伪狂犬病病毒疫苗，猪圆环病毒2型(PCV2)，猪繁殖与呼吸综合征病 毒(PRRSV)，猪细小病毒(PPV)，流行性乙型脑炎病毒(JEV)，猪瘟病毒(CSFV)和大 肠杆菌(E.coli)BL21(见图6中的E图的标记说明，每种致病因子对应一个柱状图)八种 致病因子感染的阳性血清进行检测结果，可知这八种异源致病因子感染的血清的荧光信号明 显低于PRV感染的信号，而与PRV阴性对照的信号相近，由此表明该复合微球用于免疫检 测时不会发生交叉反应，有良好的特异性。用本发明的功能微球构建的检测方法和商业PRV gE---ELISA试剂盒分别对当地猪场的81份猪临床血清进行诊断检测，结果如表1所示，其 符合率为88.89％，敏感度为92.31％，特异性为88.24％。
表1酵母@胶体金复合微球和PRV gE-ELISA检测猪临床血清结果的比较
Figure BDA0001791761370000101
以上结果表明，酵母@胶体金复合微球在免疫诊断中有极好的灵敏性、线性和特异性， 且与商业试剂盒在猪临床血清检测中结果一致，表明其具有巨大的实际应用潜力。
备注：实施例中所用到实验材料、试剂和仪器：
酵母菌：来自于培养10～12h的酵母菌，包括取自：毕赤酵母(Pichia pastoris)保存于 中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，属于公开发放的生物材料，但是实施本发明不限于此 生物材料。
胶体金由本申请人所在的华中农业大学农业微生物学国家重点实验室微生物传感器室合 成，具体制备方法如下：
(1)胶体金的制备方法：在一个三角圆底烧瓶中加入100mL 0.01％氯金酸的水溶液，在一 个比较适合的转速180r/min下，放置于集热式磁力搅拌器上油浴加热至沸腾，然后再加入5 mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，至溶液颜色呈透明酒红色。室温冷却， 4℃保存备用。
试剂：蛋白质marker购买自北京全式金生物技术有限公司，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙 基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)、十二烷基磺酸钠(SDS)、FITC标记的伴刀豆蛋白A(ConA-FITC)、Amplex Red(AR)以及牛 血清白蛋白(BSA)购买于SIGMA公司，氢氧化钠，氯化钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，1,4- 二硫代苏糖醇(DTT)，柠檬酸三钠，氯金酸，均购买于中国国药集团，Alexa Fluor 647标记 的山羊抗猪IgG购自美国Jackson Immuno Research公司，HRP标记的山羊抗猪二抗购买自 美国Abbkine公司，伪狂犬病毒标准阳性、阴性血清，PRV gE抗体检测试剂盒以及重组gE 蛋白购买自武汉科前生物股份有限公司。
YPD固体培养基配方为常用培养基，配制方法为：称取20.0g蛋白胨，10.0g酵母浸粉，20.0g葡萄糖，溶于去离子水中后，定容至1L，分装至500mL的锥形瓶中，在121℃ 高压蒸汽灭菌20min，室温下保存。
磷酸盐缓冲液(PBS)配方：磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠2.9g，氯化钠8.0 g，氯化钾0.2g，溶于去离子水中后，调节pH至7.4，然后定容至1L。
去除缓冲液(Decoating Buffer)的配方是0.1M NaOH，0.1M NaCl，1％SDS，0.1MDTT。
仪器：Sonifier 450超声波破碎仪(购自美国必能信公司)，3K15离心机(购自SIGMA公 司)，ZWY-240摇床(购自上海智诚公司)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(购自郑州 长城科工贸有限公司)，FACS Verse流式细胞仪(购自美国BD公司)，DU-800紫外分光光 度计(购自美国贝克曼集团有限公司)，透射电镜/扫描投射电镜(购自日本电子株式会社)， Cascada I纯水仪购自美国Pall公司,Metrohm滴定仪836自动电位滴定仪购自瑞士， D/MAX-RBX射线衍射仪购自日本，Micromeritics ASAP 2020 M型分析仪购自美国，Multimode 8原子力显微镜购自德国，傅立叶变换红外(光谱仪购自德国，IN VIA激光拉曼光谱仪购自英国，VG Multilab 2000 X射线光电子能谱仪购自美国。
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Claims (1)

1.一种利用酵母菌制备功能微球的方法，其特征在于下列步骤：
（1）配制YPD液体培养基，灭菌后用该培养基活化酵母菌6-8 h，连续活化两次，当OD600值为0.3-0.9时，按1%体积的量接种后进行扩大培养，然后在28 ℃，200 rpm的恒温摇床中培养，培养至10 h时，取样并在显微镜下观察，此后，每隔半小时取样观察一次，培养12 h后在显微镜下观察到的酵母细胞形态大小一致时，立即离心收集酵母细胞，并用去离子水洗涤并离心，重复3-5次；其中所述的酵母菌菌种为毕赤酵母(Pichia pastoris)；
（2）利用10%浓度的甲醛溶液将酵母细胞重悬，4℃放置6 h，离心去除甲醛溶液，用去离子水洗涤或离心，重复3次；然后用30 mL去离子水重悬湿重为1 g的酵母菌菌体，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220 W~450 W，振幅为0%-80%，超声处理5-30 min，超声处理为间歇操作，即在冰浴中超声3 s停3 s；
（3）将上步处理的酵母用去离子水离心和洗涤，重复3次；
（4）按每1 g湿重的酵母菌菌体配制30 mL去除缓冲液（Decoating Buffer）的要求配置去除缓冲液并将酵母重悬，在37 ~80 ℃水浴中搅拌处理0.5-2 h，将处理后的酵母用去离子水离心和洗涤，重复6-10次，最后用适量的去离子水重悬，得到酵母微球；
（5）将制备好的胶体金纳米颗粒与制备好的浓度范围为106-108个/mL的酵母悬液混合后于120~140 rpm，37 ℃，恒温摇床中振荡孵育5-60 min ，使胶体金颗粒均匀吸附在酵母表面，形成酵母@胶体金的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的胶体金纳米颗粒；其中所述的胶体金粒径为8-20 nm。
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