CN104928275A

CN104928275A - 一种细菌芽胞功能微球的制备方法与应用

Info

Publication number: CN104928275A
Application number: CN201510260812.4A
Authority: CN
Inventors: 胡涌刚; 项玉强; 曾志明
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2015-05-20
Filing date: 2015-05-20
Publication date: 2015-09-23
Anticipated expiration: 2035-05-20
Also published as: CN104928275B

Abstract

本发明属于生物材料制备领域，涉及一种细菌芽孢功能微球的制备方法与应用。利用新的生化方法处理细菌芽孢，制备高分散性的功能微球，然后将纳米材料固定在处理后的芽孢表面，将其应用于不同的领域。发明的要点在于，收集培养3～10天浓度为10⁸～10¹¹cfu的细菌芽孢，经离心洗涤和超声处理，用胰蛋白酶液和去芽孢衣处理液处理，最后得到除去孢外壁和芽孢衣的表面光滑的细菌芽孢微球，用此微球负载金属纳米颗粒。本发明制备的功能微球机械刚性结构更加稳定，负载的纳米材料不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠。本发明还公开了所制备的芽孢微球在动物免疫检测材料中的应用。

Description

一种细菌芽胞功能微球的制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物材料制备技术领域，具体涉及一种细菌芽胞功能微球的制备方法与应用。

背景技术

功能性单分散微球在微机电系统、光电元件、生物传感器、环境分析和催化剂载体等方面具有极其广泛的应用前景^[1]。聚苯乙烯(polystyrene)是最常用的微球制备材料，通常采用化学法合成，如：乳胶聚合和沉淀聚合法等^[2]。但是，采用传统的搅拌和挤出技术想要制备外型、尺寸、表面和光学性质均一的微球却不是一件容易的事情^[3]。此外，化学合成方法不可避免地使用到对人体和环境有害的有机试剂等。

在微球表面修饰不同的活性基团如–NH2^[4]、–SH^[5]、–COOH^[6]、–CN^[7]及-OH等是制备功能性微球的关键：只有表面接有活性基团的功能性微球才能通过装载不同分子或材料发挥其独特功能，并最终应用到不同领域。目前，聚苯乙烯微球表面的修饰主要是通过化学反应(如嫁接和共聚反应)将特定功能基团键合到微球表面^[8]，其缺点是：往往需要多个复杂的处理步骤；在锚定过程中采用的化学试剂往往会对微粒的表面结构等性质等损伤，对人体和环境也存在潜在的危害等^[3]。。因此，发展一种环境友好、操作简单、低成本的方法，用以大量制备高度均一性功能化单分散微球具有重要的应用价值和研究意义^[9]。

农业微生物中有一类环境友好型芽胞杆菌如枯草芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、球形芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌等，他们被广泛被用于制备饲料、肥料及水处理试剂等^[10]。由于芽胞杆菌产生的芽胞表面有弹性，具有厚、坚硬而含水量低的多层结构，因此对热、干燥、辐射、化学试剂和其他理化因素有较强的抗性，可以保持生命力达数十年之久。研究结果表明芽胞可以看成是天然的具有Coreshell结构的高分子微球，采用“芽胞”微球装载纳米材料有以下优点：(1)其表面富带有内生的各种活性基团(无需要复杂繁琐的表面活化程序和复杂的化学组装程序)；(2)可以采用发酵的方式大量生产，生产方式绿色环保、成本低；生命是一个高度有序的化学反应过程，可确保产生的“微球”的外形、光学特性以及表面性能上能保持高度统一；(3)芽胞坚硬的外壳可以确保微球性质稳定、不容易崩塌。

金属纳米颗粒由于其优良特性成为当前基础科学和应用研究的研究热点。但是，纳米颗粒大的比表面积和高的碰撞频率，使其具有很大的表面能，出现自发聚集倾向，从而影响纳米颗粒的稳定性，并最终失去固有的活性^[11]。此外，纳米颗粒的使用过程会导致意外的泄露和污染，且成本高，不便操作。将纳米材料固定到功能化单分散微球表面形成纳米复合材料不仅可以克服上述局限，并有可能由于协同效应产生新的性质和潜在应用前景。基于芽胞的独有特性，本发明探索出一种基于生物发酵的方法制备功能性单分散微球的新方法，分别在芽胞微球表面装载不同金属纳米材料，并成功用于催化有机化学反应及免疫分析测定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种新的生化方法处理细菌芽胞，制备高分散性的功能微球，然后将纳米材料固定在处理后的芽胞表面，将其应用于不同的研究领域。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

首先将培养3～10天的浓度在10⁸～10¹¹cfu的细菌芽胞收集起来，经过离心洗涤后再进行超声处理，然后用胰蛋白酶液处理和去芽胞衣缓冲液(Decoating buffer)^[12]处理，最后得到除去胞外壁和芽胞衣的表面光滑的细菌芽胞微球，然后用此微球负载金属纳米颗粒用于实际应用研究。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一种利用细菌芽胞制备功能微球的方法，包括下列步骤：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽胞杆菌4-6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3-10d的芽胞，用去离子水洗涤并离心，重复2-5次；

(2)用去离子水将芽胞重悬，将10⁸-10¹¹个/mL的芽胞分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220W～450W，振幅为0％-70％，超声处理10-30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min；

(3)将上步处理的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0.5-2.0％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；

(4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液(Decoating Buffer)并将芽胞重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5-4h，将处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得到芽胞微球；

(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为10⁸-10¹⁰个/mL的芽胞悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5-2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽胞表面，形成芽胞金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒。

其中：

所述的芽胞杆菌是巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

所述的金属纳米颗粒选自胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯或立方钯。

所述的金属纳米颗粒的粒径分别如下所示：胶体金粒径为15nm，胶体银粒径为10-15nm，胶体铂粒径为5nm，胶体钯粒径为5nm，立方钯粒径为20-30nm。

申请人提供了一种利用细菌芽胞制备的功能微球的应用方法，包括下列步骤：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将配制的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽胞杆菌4-6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3～10d的芽胞，用去离子水洗涤并离心，重复2-5次；

(2)用去离子水将芽胞重悬，将10⁸～10¹¹个/mL的芽胞分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率为220-450W，振幅为0％-70％，超声处理10～30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min；

(3)将超声处理结束的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽胞在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0.5-2.0％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3-5次；

(4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液(Decoating Buffer)并将芽胞重悬，在37-80℃水浴中搅拌处理0.5h-4h，将上述处理后的芽胞用适量的去离子水重悬，得到芽胞微球；(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为10⁸-10¹⁰个/mL的芽胞悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5-2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽胞表面，形成芽胞金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒。

其中：

本发明制备的细菌芽胞功能微球可应用于制备动物免疫检测或分析的生物材料上。例如制备试纸条或试剂盒中相关载体的制备中

与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：

1、相对于化学合成等方法制备功能微球的方法，本发明具有操作简单、成本低、更环保、可成批次大量制备。

2、相对于未处理的细菌芽胞，本发明处理后的芽胞的机械刚性结构更加稳定，负载的纳米材料也不易脱落，作为载体的性能更加稳定可靠。

3、芽胞作为天然的生物材料，表面含有丰富的功能基团，不需要复杂的活化程序即可与金属纳米颗粒稳定结合，因此本发明制备的功能微球不会破坏纳米材料的各种活性。

附图说明

图1：是未处理的原始芽胞。

图2：是处理不完全的芽胞。

图3：是本发明获得的光滑的芽胞。

图4：是对照即未处理的芽胞固体切片。

图5：是本发明处理后的芽胞固体切片。

图6：是天然芽胞、处理后芽胞、纳米颗粒、芽胞纳米颗粒复合微球的各种表征。附图标记说明：图6中的A1图是天然芽胞的TEM照片；图6中的A2图是处理后的芽胞的TEM照片；图6中的A3图是天然芽胞SEM照片；图6中的A4图是处理后的芽胞SEM照片；图6中的A5图是芽胞胶体金的SEM照片；图6中的B1图是胶体金的粒径分布图；图6中的B2图是负载有胶体金纳米颗粒的复合微球的TEM照片；图6中的B3图是负载有胶体金纳米颗粒的复合微球的HAABF–STEM照片；图6中的B4图是负载有胶体金纳米颗粒的复合微球的HAADF–STEM照片；图6中的B5图是负载有胶体金纳米颗粒的复合微球的EDS照片；图6中的B6图是负载有胶体金纳米颗粒的复合微球的HRTEM照片；图6中的C1图是胶体银的粒径分布图；图6中的C2图是负载有胶体银纳米颗粒的复合微球的TEM照片；图6中的C3图是负载有胶体银纳米颗粒的复合微球的HAABF–STEM照片；图6中的C4图是负载有胶体银纳米颗粒的复合微球的HAADF–STEM照片；图6中的C5图是负载有胶体银纳米颗粒的复合微球的EDS照片；图6中的C6图是负载有胶体银纳米颗粒的复合微球的HRTEM照片；图6中的D1图是胶体铂的粒径分布图；图6中的D2图是负载有胶体铂纳米颗粒的复合微球的TEM照片；图6中的D3图是负载有胶体铂纳米颗粒的复合微球的HAABF–STEM照片；图6中的D4图是负载有胶体铂纳米颗粒的复合微球的HAADF–STEM照片；图6中的D5图是负载有胶体铂纳米颗粒的复合微球的EDS照片；图6中的D6图是负载有胶体铂纳米颗粒的复合微球的HRTEM照片；图6中的E1图是胶体钯的粒径分布图；图6中的E2图是负载有胶体钯纳米颗粒的复合微球的TEM照片；图6中的E3图是负载有胶体钯纳米颗粒的复合微球的HAABF–STEM照片；图6中的E4图是负载有胶体钯纳米颗粒的复合微球的HAADF–STEM照片；图6中的E5图是负载有胶体钯纳米颗粒的复合微球的EDS照片；图6中的E6图是负载有胶体钯纳米颗粒的复合微球的HRTEM照片；图6中的F1图是立方钯的粒径分布图；图6中的F2图是负载有立方钯纳米颗粒的复合微球的TEM照片；图6中的F3图是负载有立方钯纳米颗粒的复合微球的HAABF–STEM照片；图6中的F4图是负载有立方钯纳米颗粒的复合微球的HAADF–STEM照片；图6中的F5图是负载有立方钯纳米颗粒的复合微球的EDS照片；图6中的F6图是负载有立方钯纳米颗粒的复合微球的HRTEM照片。

图7：是芽胞胶体金复合微球作为固相载体在免疫检测中的应用。附图标记说明：图7中的A图是阴性血请的检测信号强度；图7中的B图是阳性血请的检测信号强度；图7中的C图是标准阳性血清在160-10240倍稀释范围内的检测线性；图7中的D图是对猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪圆环2型病毒(PCV2)、猪乙脑病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.s2)和猪副嗜血杆菌(H.ps)七种致病原感染的阳性血清和APP阴性血清对照的检测结果图。

图8：是本发明制备的芽胞胶体金复合微球作为催化剂的催化效率研究。附图标记说明：图8中的A图是芽胞胶体金复合微球的催化速率图；图8中的B图是为不同用量的芽胞金纳米颗粒复合微球催化硼氢化钠还原4-硝基苯酚的反应动力学图；图8中的C图是芽胞胶体金复合微球的回复反映图；图8中的D图是芽胞胶体金复合微球的重复使用情况图，其中：编号1、2、3表示复合微球中金纳米颗粒的质量分别为1.6μg、3.1μg、6.2μg，编号4表示将复合微球从反应溶液中分离，编号5表示将复合微球重新加入反应溶液。

图9：是本发明制备的芽胞胶体金复合微球作为催化剂的稳定性研究结果。附图标记说明：图9中的A0图是第1次反应后的芽胞胶体金复合微球的普通TEM图；图9中A1图是第1次反应后的芽胞胶体金复合微球的HRTEM图；图9中的A2图是第1次反应后的芽胞胶体金复合微球悬液的光谱吸收图；图9中的B0图是第3次反应后的芽胞胶体金复合微球的普通TEM图；图9中B1图是第3次反应后的芽胞胶体金复合微球的HRTEM图；图9中的B2图是第3次反应后的芽胞胶体金复合微球悬液的光谱吸收图；图9中的C0图是第8次反应后的芽胞胶体金复合微球的普通TEM图；图9中C1图是第8次反应后的芽胞胶体金复合微球的HRTEM图；图9中的C2图是第8次反应后的芽胞胶体金复合微球悬液的光谱吸收图；图9中的D0图是第9次反应后的芽胞胶体金复合微球的普通TEM图；图9中D1图是第9次反应后的芽胞胶体金复合微球的HRTEM图；图9中的D2图是第9次反应后的芽胞胶体金复合微球悬液的光谱吸收图。

具体实施方式

实施例1(制备实施例)

本实施例以巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的芽胞作为制备功能微球的起始材料(但不限于上述材料)。

具体步骤如下所述：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将配制的LB液体培养基和LB固体培养基在121℃灭菌30min。用LB液体培养基活化上述三种芽胞杆菌菌种4～6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养。将培养3～10d的芽胞杆菌芽胞收集起来，用去离子水洗涤并离心，重复2～5次。

(2)用去离子水将芽胞重悬，并将适量浓度(优选范围为10⁸～10¹¹个/mL)的芽胞分装在离心管中，用超声破碎仪超声处理，调整超声破碎仪输出功率为220～450W，振幅为0％～70％，超声时间为10～30min，间歇操作(即在冰浴中超声3min停3min)。

(3)将超声处理结束的芽胞用去离子水反复离心洗涤，之后用0.5～2.0％的胰蛋白酶(用pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制)溶液处理。胰蛋白酶处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次。

(4)配制与芽胞悬液等体积的去芽胞衣处理液(Decoating Buffer，配方：0.1M NaOH，0.1M NaCl，1％SDS，0.1M DTT。)并将芽胞重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5～4h，将上述处理后的芽胞用适量的去离子水重悬。至此芽胞微球处理完毕，可以保存备用。

实施例2(应用实施例1)

制备芽胞微球的方法参见实施例1。在实施例1的基础上，对所得生物芽胞微球做进一步处理，具体步骤如下所述：

(1)在实验室制备下述金属纳米颗粒(材料)：胶体金(粒径15nm)，胶体银(粒径10～15nm)，胶体铂(粒径5nm)，胶体钯(粒径5nm)，立方钯(粒径20～30nm)。

(2)将制备好的金属纳米颗粒与实施例1制备好的芽胞悬液混合后(优选浓度范围为10⁸～10¹⁰个/mL)，置于恒温摇床中振荡孵育，使金属纳米颗粒吸附在芽胞表面，形成芽胞金属纳米颗粒的复合微球。

(3)将实施例所述的三种天然芽胞(包含但不限于上述芽胞)、处理后的芽胞、金属纳米颗粒以及制备好的复合微球分别用透射电子显微镜镜(TEM)，扫描电子显微镜电镜(SEM)，高角度环形亮场扫描透射电子显微镜(HAABF–STEM)，高角度环形暗场扫描透射电子显微镜(HAADF–STEM)，能量离散光谱测定法(EDS)和高分辨率透射电子显微镜(HRTEM)进行表征，观察复合微球的制备情况(上述仪器设备为通用商购产品)。

本实施例的结果如图6所示：附图标记中A1和A2分别为天然芽胞、处理后的芽胞的TEM照片。A3、A4和A5分别是天然芽胞，处理后的芽胞、芽胞胶体金的SEM照片。B1–F1分别为胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯、立方钯的TEM照片和粒径分布图。B2–F2、B3–F3、B4–F4、B5–F5、B6–F6分别为负载有上述金属纳米颗粒的复合微球的TEM、HAABF–STEM、HAADF–STEM、EDS和HRTEM照片。以上结果表明本实施例制备的金属纳米颗粒能很好的结合在处理好的芽胞微球表面，形成芽胞金属纳米颗粒复合微球。

实施例3(应用实施例2)

将实施例2制备的芽胞胶体金复合微球作为载体用于猪胸膜肺炎放线杆菌感染血清中ApxIVA抗体的检测，具体应用步骤如下：

(1).取100μL微球与200μL ApxIVA抗原蛋白进行反应，以将ApxIVA抗原蛋白固定在微球表面。

(2)用牛血清白蛋白(BSA)溶液作为封闭剂，对标记有ApxIVA抗原蛋白的微球进行封闭，占据微球表面上没有被抗原蛋白吸附的活性位点，以减少非特异性反应。

(3)加入200μL待检测血清，如果血清中含有相应的抗体，就能与抗原蛋白发生特异性免疫反应，形成微球-抗原-抗体复合体。

(4)加入200μL生物素标记的羊抗猪IgG，进行第二次免疫反应，反应完成后进行充分的洗涤，以使未结合到微球表面的Bio-IgG被充分洗脱下来。

(5)加入200μL Cy^TM5标记的链霉亲和素(SA-Cy5)，通过生物素和链霉亲和素的特异性结合反应将荧光素Cy5标记到微球表面，反应完成后同样进行充分的洗涤，以使未结合的SA-Cy5被洗脱下来。

(6)洗脱完成后，将免疫反应完成后的微球用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，利用流式细胞仪检测标记到微球表面的Cy5的荧光信号强度。

用复合微球分别检测猪的标准阴、阳性血清，并测试了不同稀释倍数的标准阳性血清的线性范围和对其它致病因子的特异性，结果如图7所示。附图标记中的图7中的A图、B图分别为阴性和阳性血清的检测信号强度。可见阳性血清信号强度明显高于阴性血清，有很好的区分性。图7中的C图为标准阳性血清在160-10240倍稀释范围内的检测线性，R²＝0.9956，表明线性良好，且有很好的灵敏度。图7中的D图为对猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)、猪圆环2型病毒(PCV2)、猪乙脑病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、大肠杆菌(E.coli)、猪链球菌(S.s2)和猪副嗜血杆菌(H.ps)七种致病原感染的阳性血清进行检测结果，可知这六种异源致病因子感染的血清的荧光信号明显低于APP感染的信号，而与APP阴性对照的信号相近，由此表明该复合微球用于免疫检测时不会发生交叉反应，有良好的特异性。用本发明的功能微球构建的检测方法和商业ApxIVA---ELISA试剂盒分别对当地猪场的54份猪临床血清进行诊断检测，结果如表1所示，其敏感度为92.6％，符合率为88.9％，特异性为85.2％。

表1 芽胞胶体金复合微球和ApxIVA-ELISA检测猪临床血清结果的比较

以上结果表明，芽胞胶体金复合微球在免疫诊断中有极好的灵敏性、线性和特异性，且与商业试剂盒在猪临床血清检测中结果一致，表明其具有巨大的实际应用潜力。

实施例4(应用实施例3)

在一种申请人建立的一个反应系统利用过量的硼氢化钠还原4-硝基苯酚生成的4-氨基苯酚来检测金属纳米复合物的催化性能。具体步骤为：

将3.0mL 4-硝基苯酚(浅黄色)与3.0mL配制成硼氢化钠混合后在冰浴条件下反应生成4-硝基苯酚钠(深黄色)，随后向溶液中加入200μL的芽胞胶体金复合微球。在还原剂硼氢化钠和催化剂芽胞金属纳米颗粒复合微球的双重作用下，4-硝基苯酚被还原为4-氨基苯酚，溶液的深黄色逐渐变浅，最终成为无色。分次取不同催化反应时间后的混合液离心，用分光光度计测量上清液的吸光值，观察复合微球的催化速率。此外，对芽胞胶体金复合微球作为催化剂的循环利用效果进行了研究。每一次催化反应完成后，便将复合微球通过离心的方法从溶液中分离出来，去掉上清，将沉淀物用去离子水洗涤3次后，重新加入新鲜的反应液，进行新一轮的催化反应。

芽胞胶体金复合微球对4-硝基苯酚的催化性能如图8所示，图8中的A图为催化速率图，其中400nm处为4-硝基苯酚的吸收峰，295nm处为生成的4-氨基苯酚的吸收峰，随着反应时间的延长，4-硝基苯酚的浓度不断下降，而4-氨基苯酚的不断上升，表明了纳米金属复合微球良好的催化活性。图8中的B图为不同用量的芽胞金纳米颗粒复合微球催化硼氢化钠还原4-硝基苯酚的反应动力学图，表明此反应遵循假一级动力学反应规律，且催化剂的用量对常数k的影响明显，催化剂的量越多，k值越大。图8中的C图所示为将复合微球从混合液中分离后，催化反应即停止，当重新加入后，又继续开始，说明负载在芽胞载体上的金属纳米颗粒在催化反应过程中是可控制的。图8中的D图为复合微球的重复使用情况，经过9次循环利用后，4-硝基苯酚的转化率仍超过80％，说明本发明制备的复合微球在多次循环后依然具有很好的催化活性。图9为本发明制备的复合微球在多次循环利用后的结构表征，检测其作为催化剂的稳定性。附图标记：A0–D0分别为第1、3、8、9次反应后的普通TEM图，表明多次循环后芽胞微球的结构没有被破坏，且胶体金颗粒没有从芽胞表面脱落；A1–D1分别为相应的高分辨率TEM图，发现胶体金的晶格结构在多次催化反应后依然清晰，说明胶体金负载在芽胞表面后稳定性有明显提升；A2–D2分别为各次催化反应后微球悬液的光谱吸收图，胶体金在521nm处的吸收峰没有发生红移，证明在多次循环后，芽胞表面的胶体金未出现团聚的现象。

以上结果表明，芽胞胶体金复合微球作为催化剂可以重复使用，有很好的稳定性，并且可以通过离心将其从反应体系中分离，随时控制催化反应的进程。说明本发明的芽胞微球作为负载型催化剂载体在催化方面具有良好的潜在应用前景，为构建新型的催化剂载体提供了新思路。

备注：实施例中所用到实验材料、试剂和仪器：

细菌芽胞：来自于培养3～10天的芽胞杆菌，包括取自：巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium) AB92052，枯草芽胞杆菌168(Bacillus subtilis)，解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)AB2013062)，这三种菌株均保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，属于公开发放的生物材料，但是实施本发明不限于此生物材料。

金属纳米材料：均由本实验室合成，具体制备方法如下所述。

(1)金纳米材料的制备方法：在一个三角圆底烧瓶中加入0.01％氯金酸的水溶液100mL，在一个比较适合的转速150r/min下，放置于集热式磁力搅拌器上油浴加热至沸腾，然后再加入5mL的1％柠檬酸三钠水溶液，继续加热煮沸15min，至溶液颜色呈透明酒红色。室温冷却，4℃保存备用。

(2)银纳米材料的制备方法：在冰浴和适当转速(150～200rpm)搅拌的条件下将配制好的硝酸银溶液5mmol/L(100mL)加入到300mL的2mmol/L硼氢化钠溶液中，在反应的过程当中再加入1％聚乙烯醇(PVA)(50mL).反应结束后，再将溶液煮沸1h以除去过量的硼氢化钠，并将最终的体积调整到500mL，4℃保存备用。

(3)纳米铂的制备方法：将预先配制好的3mL的10mmol/L六氯铂酸钾(K₂PtCl₆)与21mL的双蒸水混合均匀后，再向200mL的三角烧瓶中加入溴化钾(KBr)0.0357g至充分溶解后，再在油浴的条件下加热煮沸并磁力搅拌1h，整个反应过程需冷凝回流，然后再向容器中加入6mL的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)水溶液，继续加热煮沸3h，直到溶液呈棕黑色，自然冷却到室温。保存在4℃冰箱备用。

(4)立方钯颗粒的制备方法：取十六烷基三甲溴化铵(CTAB)(0.1mol/L,2.5mL)，去离子水(17.5mL)和四氯钯酸钾(K₂PdCl₄)(0.01mol/L,1mL)均匀混合在圆底烧瓶中，置于80℃油浴条件下，保持5min，直到温度达到了平衡并冷凝回流，然后再向其中加入抗坏血酸(0.1mol/L,0.16mL)，反应混合溶液再继续保持反应2h，反应结束后，自然冷却到室温，装瓶4℃备用。

(5)小粒径钯纳米颗粒的制备方法：称取2.5g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)加入到150mL的无水乙醇当中直至完全溶解，随后向三角圆底烧瓶容器中加入50mg的醋酸钯，油浴加热煮沸并且冷凝回流2h后，冷却至室温后，再用0.2μm的滤膜过滤，置4℃备用。

试剂：胰蛋白酶、牛血清白蛋白(BSA)、4-硝基苯酚购买于SIGMA公司，氢氧化钠，氯化钠，十二烷基磺酸钠(SDS)，1,4-二硫代苏糖醇(DTT)，硼氢化钠，柠檬酸三钠，氯金酸，氯铂酸钾，氯钯酸钾，醋酸钯，硝酸银，聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮,均购买于中国国药集团，生物素标记的羊抗猪IgG和Cy^TM5标记的链霉亲和素由艾美捷科技有限公司代购，由Jackson Immuno Research公司生产，ApxIVA---ELISA试剂盒购自武汉科前动物生物制品有限责任公司。

Luria-Bertani(LB)固体培养基配方为常用培养基：称取10.0g胰蛋白胨，5.0g酵母浸粉，10.0g氯化钠，琼脂15.0～20.0g，溶于双蒸水中后，用1mol/L NaOH溶液调节pH值到7.2～7.4，定容到1L，分装至500mL的锥形瓶中，121℃高压灭菌30min，室温保存。

磷酸盐缓冲液(PBS)配方：磷酸二氢钾0.24g，十二水合磷酸氢二钠3.58g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g。

Decoating Buffer的配方是0.1M NaOH，0.1M Nacl，1％SDS，0.1M DTT。

仪器：Sonifier 450超声波破碎仪(购自美国必能信公司)，3K15离心机(购自SIGMA公司)，ZWY-240摇床(购自上海智诚公司)，DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器(购自郑州长城科工贸有限公司)，流式细胞仪(购自美国BD公司)，DU-800紫外分光光度计(购自美国贝克曼集团有限公司)，透射电镜/扫描投射电镜(购自日本电子株式会社)。

主要参考文献：

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Claims

1.一种利用细菌芽孢制备功能微球的方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将所述的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽孢杆菌4～6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3～10d的芽孢，用去离子水洗涤并离心，重复2～5次；

(2)用去离子水将芽孢重悬，将10⁸～10¹¹个/mL的芽孢分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率至220～450W，振幅为00％～70％，超声处理10～30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min；

(3)将上步处理的芽孢用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽孢在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0.5～2.0％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；

(4)配制与芽孢悬液等体积的去芽孢衣处理液(Decoating Buffer)并将芽孢重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5～4h，将处理后的芽孢用适量的去离子水重悬，得到芽孢微球；

(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为10⁸～10¹⁰个/mL的芽孢悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5～2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽孢表面，形成芽孢金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒。

2.如权利要求1所述的一种利用细菌芽孢制备功能微球的方法，其特征在于：所述的细菌芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

3.如权利要求1所述的一种利用细菌芽孢制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒选自胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯或立方钯。

4.如权利要求1或3所述的一种利用细菌芽孢制备功能微球的方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒的粒径分别如下所述：胶体金粒径为15nm，胶体银粒径为10～15nm，胶体铂粒径为5nm，胶体钯粒径为5nm，立方钯粒径为20～30nm。

5.一种利用细菌芽孢制备的功能微球的应用方法，其特征在于，包括下列步骤：

(1)配制LB液体培养基和LB固体培养基，将配制的培养基在121℃灭菌30min，用LB液体培养基活化细菌芽孢杆菌4～6h，当OD₆₀₀＝0.6时，向每个培养皿加入200uL活化好的菌液并涂布均匀，然后在37℃培养箱中培养，收集培养3～10d的芽孢，用去离子水洗涤并离心，重复2～5次；

(2)用去离子水将芽孢重悬，将10⁸～10¹¹个/mL的芽孢分装在离心管中，调整超声波细胞破碎仪的输出功率为220～450W，振幅为00％～70％，超声处理10～30min，所述的超声处理为间歇操作即在冰浴中超声3min停3min；

(3)将超声处理结束的芽孢用去离子水反复离心洗涤，之后将所得的芽孢在以pH 3的盐酸溶液或pH 7.4的0.01M的磷酸盐缓冲液即PBS溶液配制的含0.5～2.0％的胰蛋白酶溶液中，胰蛋白酶溶液处理完成后，离心去除酶液，并反复洗涤3～5次；

(4)配制与芽孢悬液等体积的去芽孢衣处理液(Decoating Buffer)并将芽孢重悬，在37～80℃水浴中搅拌处理0.5h～4h，将上述处理后的芽孢用适量的去离子水重悬，得到芽孢微球；(5)将制备好的金属纳米颗粒与制备好的浓度范围为10⁸～10¹⁰个/mL的芽孢悬液混合后于120～140rpm，37℃，恒温摇床中振荡孵育0.5～2h，使金属纳米颗粒均匀吸附在芽孢表面，形成芽孢金属纳米颗粒的复合微球，然后用去离子水反复离心洗涤3次，去除未吸附的金属纳米颗粒。

6.如权利要求5所述的一种利用细菌芽孢制备的功能微球的应用方法，其特征在于：所述的芽孢杆菌是巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

7.如权利要求5所述的一种利用细菌芽孢制备的功能微球的应用方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒选自胶体金、胶体银、胶体铂、胶体钯或立方钯。

8.如权利要求5或6所述的一种利用细菌芽孢制备的功能微球的应用方法，其特征在于：所述的金属纳米颗粒的粒径分别如下所示：胶体金粒径为15nm，胶体银粒径为10～15nm，胶体铂粒径为5nm，胶体钯粒径为5nm，立方钯粒径为20～30nm。

9.一种细菌芽孢功能微球在制备检测动物疫病载体中的应用，其特征在于，所述的载体采用权利要求1-4任一项所述的方法制备得到。