CN107899017B - 一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用，该复合体材料包括载体及负载在该载体上的活性成分，所述载体与活性成分通过共价键连接成复合体，所述复合体的尺寸为1‑1000纳米，所述载体为细胞壁肽聚糖，尺寸为1‑1000纳米；所述活性成分包括对病灶有特异性治疗作用的含‑NH2或‑OH或‑COOH的药物和对病灶区域有亲和力的含‑NH2或‑OH或‑COOH的靶向物质。本发明收益的材料适用性好，安全性高，其粒径小，且粒径均一，其大小可控，在体内具有长循环效果，生物相容性良好，没有细胞毒性，且具有免疫激活作用，能提高机体免疫力。可负载多种药物和靶向物质，从而达到精准治疗的目的。

Description

一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用材料领域，具体涉及一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用。
背景技术
靶向给药系统(targeted drug delivery system，TDDS)是指能使药物选择性地浓集于靶组织、靶细胞或细胞内特定细胞器的新型给药系统。它是药物剂型发展的第四个阶段，主要治疗肿瘤等疾病。靶向给药的方法有载体介导、受体介导、前药、化学传递系统等。其中，载体介导是最常用的方法，根据载体的不同分为脂质体、纳米粒、微球等。主要通过被动和主动靶向给药方式。靶向给药的优势很明显，可使药物集中在靶区，其他部位较少，从而减少用药剂量，提高药物疗效，达到高效低毒的目的。但是靶向给药各种载体进入体内后，会受到生理屏障的清除，包封药物快速渗漏，易在网状内皮系统沉积等缺点。此外，TDDS还可引起栓塞、中毒等问题。
纳米技术是21世纪世界各国经济发展的驱动力之一。纳米技术在医药领域最引人注目的是纳米递药系统。国内外纳米递药系统产业化技术开发和进军高端制剂品种也取得了一些突破，已有多个药物纳米制剂进入市场或处于临床研究阶段。
目前，纳米靶向递药系统分为合成和天然纳米载药系统。合成的纳米靶向载药系统包括纳米金载体、聚合物纳米颗粒、碳纳米管、纳米石墨烯、介孔二氧化硅、磁性纳米靶向载体材料等。合成纳米材料靶向递药系统存在的主要问题：
1)潜在毒性问题。这是一个基础研究问题，纳米颗粒进入人体后，其与人体器官、组织、细胞、分子的相互作用，特别是与细胞的相互作用规律和效应尚待阐明。
2)缺乏可供血管内使用的功能性纳米载体材料。目前，除了白蛋白、磷脂及其类似物、PEG化聚乳酸可供血管内使用外，尚无其他合成高分子材料能够适合血管内使用，其主要原因是缺乏完整的安全性评价资料。
3)制作成本及工艺问题。目前，如PLGA等性能相对较好、对人体毒副作用小的载体材料，要经过复杂的化学方法处理，生产成本昂贵、产量少，尚无法广泛的应用于临床实践中。
4)纳米递药系统的质量评价体系尚需建立，其产业化工程技术还需发展。
因此，具有更好的生物相容性、生物可降解性以及更好的缓控释速度和靶向性的载体材料的研究与开发，是纳米制剂研究的重中之重。目前发现的天然纳米生物靶向材料有壳聚糖、海藻酸钠、透明质酸、白蛋白、脂蛋白、乳铁蛋白等。由于壳聚糖，海藻酸钠、透明质酸等要经过繁琐的化学工艺加工或使用微生物发酵法，生产成本高，难以实行大规模的工业化生产。而蛋白类制品材料主要来源于人血，因此来源有限，在大规模制备载体方面受到很大约束，生产工艺复杂，生产成本高昂，并且易发生过敏反应。
肽聚糖属于大分子聚合物的一种，它的组成成分是肽和聚糖。肽聚糖分子相互交织成网格状，形成致密的机械性很强的网套结构。结构看似复杂，其组成成分却是肽聚糖单体。肽聚糖是细胞壁中的重要组分，可能参与人体对细菌的多种生物学功能，如免疫增强功能、抗感染、抗肿瘤及抗过敏等。肽聚糖是人类免疫系统识别的激活剂，它是通过诱导非特异性免疫因子或特异性免疫因子的释放或表达来刺激机体免疫系统发挥功能。
肽聚糖作为乳酸菌中含量最丰富的微生物相关保守分子(Microbe-associatedmolecular patterns，MAMPs)之一，在益生菌与宿主的联系中起重要作用，并对宿主免疫反应具有一定的调节作用和抗炎作用。此外，肽聚糖还具有抗新陈代谢活性和粘附作用。现阶段肽聚糖的应用主要包括以下几个方面：
1、免疫增强剂：(口服，肌注)乳酸菌属革兰氏阳性厌氧菌，是人类肠道中的重要益生菌，对机体有多种生理作用。肽聚糖被认为是革兰氏阳性细菌细胞壁中能够引起机体免疫反应的主要成份。真核细胞并不含肽聚糖，因此肽聚糖就成了真核生物免疫系统识别的理想靶位，从而增强人和动物的非特异性免疫，并且对动物体内的肿瘤生长有一定抑制作用。
2、疫苗：乳球乳酸菌经过热酸处理后得到球形肽聚糖基质(Gram-positiveenhancer matrix，GEM)。鼻内给予用GEM颗粒作为佐剂的亚单位疫苗(其与疫苗简单混合)，能够用于初期强化免疫策略以诱导保护水平的高效价。基于GEM的流感疫苗应用就是一个例子。其血清IgG结果表明GEM颗粒增强流感亚单位疫苗的免疫原性。除了重要的血清应答之外，GEM作为佐剂的疫苗引起强烈的粘膜免疫应答，即在呼吸道粘膜中分泌sIgA。
3、动物饲料、兽药(畜牧业、水产养殖业)。
4、体外检测等。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种天然生物纳米靶向药物复合体材料及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种天然生物纳米靶向药物复合体材料，包括载体及负载在该载体上的活性成分，所述载体与活性成分通过共价键连接成复合体，所述复合体的尺寸为1-1000纳米，所述载体为细胞壁肽聚糖，尺寸为1-1000纳米；所述活性成分包括对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物和对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质。
所述载体尺寸为100-200纳米，所述载体为完整的芽孢细胞壁肽聚糖，为解淀粉酶芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等对人体无害或为益生菌中的一种，优选的，为解淀粉芽孢杆菌的芽孢细胞壁肽聚糖，所述共价键为碳二亚胺法形成的。
本发明还提供了一种天然生物纳米靶向药物复合体材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、取用50％甘油保存在-20℃的解淀粉芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180rpm培养过夜，完成菌种活化；
S2、吸取200μL活化好的菌液加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7天，解淀粉芽胞杆菌开始生长并转变为芽胞；收集平板上长出的解淀粉芽胞杆菌的芽胞，用双蒸水清洗芽胞悬液3次后，在冰浴条件下超声处理5次，每次3分钟，每次超声间隔6分钟，防止悬液过热对芽胞产生影响；
S3、完成悬液超声处理后，离心，清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用一定体积的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80rpm振荡过夜，离心去除胰蛋白酶溶液，加入一定量Decoating Buffer，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h后，将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，再将芽胞重悬后，取少量用于芽胞计数，剩余的在121℃高压灭活30min，使芽胞失去活性，得载体；
S4、采用碳二亚胺法将制得的600万单位的解淀粉酶芽孢杆菌芽孢载体复溶于0.1mol/mL的pH＝5.5的1mL MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液中，先后向其中加入过量的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)及NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，直至饱和；将其置于摇床上，4℃下活化60分钟，活化游离的羧基，用双蒸水洗涤，12000rpm离心3min，重复3-5次，得活化芽孢；
S5、将活化芽孢复溶于0.1mol/L的pH＝7.2的1ml PBS缓冲液中，向其加入2万单位UK(尿激酶)，将其置于摇床上，室温下反应20分钟，再加入0.05mg RGD，室温下活化100分钟，使伯氨基与活化的羧基反应，生成酰胺键，将UK、RGD与BA连接，用双蒸水洗涤、离心3次以去除未反应的UK和RGD，收集微球冷冻干燥，得纯净活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖；
S6、取上述活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖、对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物和对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质加入缓冲液中充分反应，将所得产物采用去离子水，12000rpm离心3min，重复3-5次，冷冻干燥后，得纯净多功能靶向天然生物纳米药物复合体。
优选地，所述催化剂EDC和NHS物质的量之比为1.5∶1。
优选地，所述步骤S6中纯净活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖和对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物同时投放至缓冲液中，对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质稍后投放至缓冲液中，时间差为15-30min。
优选地，所述步骤S6中的缓冲液为pH＝7.2的PBS溶液。
上述天然生物纳米靶向药物复合体材料可用于测试药物靶向物质的活性。
本发明具有以下有益效果：
本发明的靶向天然生物纳米药物复合体对药物载药量大，适用性好，安全性高，其粒径小，且粒径均一，其大小可控，在体内具有长循环效果，生物相容性良好，没有细胞毒性，且具有免疫激活作用，能提高机体免疫力。可负载多种药物和靶向物质，从而达到精准治疗的目的。制备方法简单，条件温和，成本较低，易于推广和应用等特征。
附图说明
图1为本发明实施例中S2444(尿激酶发色底物)的标准曲线。
图2为本发明实施例中的RGDs的连接率；
图中：A为空白对照组；B为600万BA：1mgRGDs；C为1000万BA：1mgRGDs；D为1500万BA：1mg RGDs。
图3为本发明实施例中的相同剂量的靶向天然生物纳米溶栓药物复合体和市售UK的不同溶栓对比结果。
图4为本发明实施例中的天然生物纳米溶栓药物复合体靶向聚集于血栓表面的荧光情况。
图5为图4的明场情况。
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供了一种天然生物纳米靶向药物复合体材料，包括载体及负载在该载体上的活性成分，所述载体与活性成分通过共价键连接成复合体，所述共价键为碳二亚胺法形成的；所述复合体的尺寸为1-1000纳米，所述载体为细胞壁肽聚糖，尺寸为1-1000纳米；优选地，所述载体尺寸为100-200纳米；所述活性成分包括对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物和对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质。所述载体为完整的芽孢细胞壁肽聚糖，为解淀粉酶芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌等对人体无害或为益生菌中的一种，优选的，为解淀粉芽孢杆菌的芽孢细胞壁肽聚糖。所述载体可进一步修饰，优选的为，如磷酸化，羟基化，氨基化，脂质化，亲水性物质，疏水性物质，修饰细胞穿胞肽等各种修饰。
本发明实施例还提供了一种天然生物纳米靶向药物复合体材料的制备方法，包括如下步骤：
S1、取用50％甘油保存在-20℃的解淀粉芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180rpm培养过夜，完成菌种活化；
S2、吸取200μL活化好的菌液加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7天，解淀粉芽胞杆菌开始生长并转变为芽胞；收集平板上长出的解淀粉芽胞杆菌的芽胞，用双蒸水清洗芽胞悬液3次后，在冰浴条件下超声处理5次，每次3分钟，每次超声间隔6分钟，防止悬液过热对芽胞产生影响；
S3、完成悬液超声处理后，离心，清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用一定体积的1％胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80rpm振荡过夜，离心去除胰蛋白酶溶液，加入一定量Decoating Buffer，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h后，将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，再将芽胞重悬后，取少量用于芽胞计数，剩余的在121℃高压灭活30min，使芽胞失去活性，得载体；
S4、采用碳二亚胺法将制得的600万单位的解淀粉酶芽孢杆菌芽孢载体复溶于0.1mol/mL的pH-5.5的1mL MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液中，先后向其中加入过量的EDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)及NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)直至饱和，所述催化剂EDC和NHS物质的量之比为1.5∶1，催化剂应过量投放；将其置于摇床上，4℃下活化60分钟，活化游离的羧基，用双蒸水洗涤，12000rpm离心3min，重复3-5次，得活化芽孢；
S5、将活化芽孢复溶于0.1mol/L的pH＝7.2的1ml PBS缓冲液中，向其加入2万单位UK(尿激酶)，将其置于摇床上，室温下反应20分钟，再加入0.05mg RGD，室温下活化100分钟，使伯氨基与活化的羧基反应，生成酰胺键，将UK、RGD与BA连接，用双蒸水洗涤、离心3次以去除未反应的UK和RGD，收集微球冷冻干燥，得纯净活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖；
S6、取上述活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖、对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物和对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质加入缓冲液(pH＝7.2的PBS溶液)中充分反应，将所得产物采用去离子水，12000rpm离心3min，重复3-5次，冷冻干燥后，得纯净多功能靶向天然生物纳米药物复合体。其中，纯净活化细菌芽孢细胞壁肽聚糖和对病灶有特异性治疗作用的含-NH2或-OH或-COOH的药物同时投放至缓冲液中，对病灶区域有亲和力的含-NH2或-OH或-COOH的靶向物质稍后投放至缓冲液中，时间差为15-30min。
以下实施例中所得到的多功能靶向天然生物纳米药物复合体和载体进行透射电镜，酶标仪等测定。
实施例1
在本实施例中，多功能靶向天然生物纳米药物复合体由以下方法制备，具体包括以下步骤：
步骤1、采用碳二亚胺法，将制得的BA(解淀粉酶芽孢杆菌细胞壁肽聚糖)(600万单位)复溶于1mL MES缓冲液(0.1mol/mL，pH＝5.5)中，先后向其中加入过量的EDC及NHS(物质的量比为1.5∶1)；将其置于摇床上，4℃下活化90分钟，活化游离的羧基。
步骤2、用双蒸水洗涤、离心(12000rpm，3min)，重复3次。将活化芽孢复溶于1mlPBS缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.2)，向其加入2万单位UK，将其置于摇床上，室温下反应20分钟，再加入0.05mg RGD，室温下活化100分钟，使伯氨基与活化的羧基反应，生成酰胺键，将UK、RGD与BA连接。
步骤3、用双蒸水洗涤、离心3次以去除未反应的UK和RGD。收集微球冷冻干燥以备用。
步骤4、取部分所得UK-BA-RGDs产物，采用S2444(尿激酶发色底物)，通过自动酶标仪测UK连接率，连接率在50％左右，结果见图1。
步骤5、取部分所得UK-BA-RGDs产物，通过流式细胞仪测RGD连接率。连接率在90％左右，结果见图2。
实施例2
在本实施例中，评价多功能靶向天然生物纳米药物复合体(靶向溶栓药物)体外溶栓能力，具体包括以下步骤：
步骤1、选取300-350g健康Wistar大鼠心脏取血，37℃水浴2h，灭活纤溶酶原，形成纤维素血栓。
步骤2、将形成的纤维素血栓分割成，重约0.1g，形状均匀的血栓，随机分位五组：PBS组、大剂量UK组、小剂量UK组，大剂量UK-BA-RGDs组，小剂量UK-BA-RGDs组。每组10个，滤纸吸干表面水分，标记1到10号，称重并记录。
步骤3、按相应组别分别加入1ml PBS、2000IU UK、5000IU UK，2000IU UK-BA-RGDs，5000IU UK-BA-RGDs 37℃水浴孵育2h，充分反应。
步骤4、取出孵育后的栓子，滤纸吸干表面水分，称重，记录，并拍照。结果数据处理分析后，结果为同等UK的60％溶栓率，结果见图3。
实施例3
在本实施例中，评价多功能靶向天然生物纳米药物复合体(靶向溶栓药物)体外靶向能力，具体包括以下步骤：
步骤1、将PE50导管(聚乙烯导管，型号50)浸润于纤维蛋白原溶液中，12h后，将血液通过处理后的PE50导管，形成附壁血栓。
步骤2、将形成附壁血栓的PE50导管一端连接于蠕动泵，使UK-BA-RGD溶液通过蠕动泵注入导管中，10min后取下血栓，置于PBS溶液中清洗3遍后，于荧光显微镜下观察靶向结果，结果见图4和图5。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的纳米药物复合体及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。应用范围除医学外，在其它生物中应用也属于本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (3)

1.一种天然生物纳米靶向药物复合体材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、取用50%甘油保存在-20℃的解淀粉芽胞杆菌菌种200μL，加入已灭菌5mL LB液体培养基中，置于37℃控温摇床中180rpm培养过夜，完成菌种活化；
S2、吸取200μL活化好的菌液加入到已冷却的LB固体培养基平板上，用玻璃棒涂布均匀后，将培养皿倒置于37℃恒温培养箱中培养7天，解淀粉芽胞杆菌开始生长并转变为芽胞；收集平板上长出的解淀粉芽胞杆菌的芽胞，用双蒸水清洗芽胞悬液3次后，在冰浴条件下超声处理5次，每次3分钟，每次超声间隔6分钟，防止悬液过热对芽胞产生影响；
S3、完成悬液超声处理后，离心，清洗3次后，收集沉淀下来的芽胞，用一定体积的1%胰蛋白酶溶液重悬，在37℃摇床中80rpm 振荡过夜，离心去除胰蛋白酶溶液，加入一定量Decoating Buffer，在70℃的条件下磁力搅拌反应2h后，将处理好的芽胞离心去除上清液，用双蒸水清洗芽胞5次，再将芽胞重悬后，取少量用于芽胞计数，剩余的在121℃高压灭活30min，使芽胞失去活性，得载体；
S4、采用碳二亚胺法将制得的600万单位的解淀粉酶芽孢杆菌芽孢载体，即解淀粉酶芽孢杆菌细胞壁肽聚糖（BA）复溶于0.1mol/mL的pH=5.5的1mL 2-(N-吗啡啉)乙磺酸（MES）缓冲液中，先后向其中加入过量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺（EDC）及N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），直至饱和；将其置于摇床上，4℃下活化60分钟，活化游离的羧基，用双蒸水洗涤，12000rpm离心3min，重复3-5次，得活化芽孢；
S5、将活化芽孢复溶于0.1mol/L的pH = 7.2的1ml PBS缓冲液中，向其加入2万单位尿激酶（UK），将其置于摇床上，室温下反应20分钟，再加入0.05mg RGD，室温下活化100分钟，使伯氨基与活化的羧基反应，生成酰胺键，将UK、RGD与BA连接，用双蒸水洗涤、离心3次以去除未反应的UK和RGD，收集微球冷冻干燥，得纯净多功能靶向天然生物纳米药物复合体。
2.如权利要求1所述的一种天然生物纳米靶向药物复合体材料的制备方法，其特征在于，所述EDC和NHS物质的量之比为1.5：1。
3.如权利要求1所述的一种天然生物纳米靶向药物复合体材料的制备方法，其特征在于，所述步骤S5中活化芽孢和UK同时投放至缓冲液中，RGD稍后投放至缓冲液中，时间差为15-30min。
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