CN113499325B - 一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料及包封方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料及包封方法，包括用于包封益生菌的纳米薄膜；纳米薄膜包括两层，第一层为天然生物基高分子与金属离子在益生菌表面通过共价交联或金属螯合作用原位形成；第二层为生物酶与天然生物基高分子相互作用形成；本发明在益生菌细胞壁上原位形成的纳米薄膜，用于益生菌的包封保护；纳米薄膜由天然生物质构成，成本低廉，且无毒副作用；包封后的益生菌无论是在高浓度的抗生素，活性自由基环境中培育，其相对活性都能接近甚至高于90％，而未受保护的益生菌的相对活性则在30％以下，甚至完全无法存活。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料及包封方法。
背景技术
人类的肠道微生物生物群在维持健康的胃肠功能和其他生理过程中起着关键作用，这导致人们对使用口服微生物作为治疗和诊断方法的兴趣越来越大。然而益生菌对外界环境刺激极为敏感，如其对氧气、温度以及外界营养水平极为敏感，对消化道内的低pH值环境的抵抗力差，会被活性自由基抑制，特别是抗生素一类的抗菌药物会对益生菌群造成严重的破坏。临床上益生菌最常见的使用场景，就是通过口服益生菌维持肠道菌群平衡，以避免使用抗生素带来的副作用。但这些服用的益生菌往往难以经受肠道中存在的抗生素的伤害，难以在肠道中定植。此外，益生菌的运输存储过程中，其活性往往也难以维持。
因此，益生菌制剂发展的主要问题是如何在储存和使用中维持益生菌的活性。通过在益生菌制剂中添加保护剂是目前常用的方法。例如，包封技术可为益生菌提供一个相对适宜的微环境，使菌体与相对恶劣的外界环境隔离开，从而使这些非常敏感、难以在常态下保存的菌体得以长期保存。然而，现有的益生菌包封技术仍然存在成本高昂，制备工艺复杂，包封率较低，活性保护能力较差等问题。特别是可用于保护益生菌免受抗生素伤害的包封技术目前尚无报道。
现有的包封技术如CN11081021A提出一种利用改性果胶包埋肠道复合益生菌的方法；CN104856924B提出了一种外用益生菌微胶囊的制备方法；CN111436614A提出了一种基于香菇可溶性膳食纤维的益生菌递送微胶囊及制备方法。这些包封方法虽然在一定程度上可以使益生菌在存储或在胃肠道pH条件下维持一定的活性，但是其制备工艺复杂，而且没有研究其在更苛刻的外界条件下，如抗生素存在条件下对益生菌的活性保护能力。
发明内容
本发明针对现有技术存在的问题提供一种活性保护能力强，能够避免抗生素对益生菌伤害的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料及包封方法。
本发明采用的技术方案是：
一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，包括用于包封益生菌的纳米薄膜；纳米薄膜包括两层，第一层为天然生物基高分子与金属离子在益生菌表面通过共价交联或金属螯合作用原位形成；第二层为生物酶与天然生物基高分子相互作用形成。
进一步的，所述生物酶为β-半乳糖苷酶，胰淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，纤维素酶中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
进一步的，所述金属离子为Al、Fe、Zn、Mn、Ni、Co、V的阳离子中的一种或两种及以上构成的混合物。
进一步的，所述天然生物基高分子为天然多酚、多巴胺及其衍生物、多糖类生物质、蛋白质类生物质中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
进一步的，所述益生菌乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、双歧杆菌、革兰氏阳性球菌、大肠杆菌、光合细菌中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料的包封方法，包括以下步骤：
步骤1：将金属盐水溶液与益生菌液充分混合，加入天然生物基高分子水溶液，调节pH值，充分反应，洗涤，得到第一层薄膜包裹的益生菌；
步骤2：调整步骤1得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，重复步骤1操作0～N次；
步骤3：调整步骤2得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，加入生物酶水溶液，充分反应形成第二层薄膜包裹的益生菌，冷冻干燥后即可得到封装的益生菌。
进一步的，所述步骤1中采用氢氧化钠水溶液或者PBS缓冲液调节pH为7.0。
进一步的，所述步骤1中益生菌液的浓度为1×106～1×109CFU/mL，金属盐水溶液的浓度为1～10mg/mL；天然生物基高分子水溶液的浓度为10～100mg/mL；金属盐水溶液与益生菌液体积比为1:50，天然生物基高分子水溶液与益生菌液体积比为1:50。
进一步的，所述步骤2和步骤3中调整后的第一层薄膜包裹的益生菌浓度为1×106～1×109CFU/mL，步骤3中生物酶水溶液浓度为1～20mg/mL；生物酶水溶液与第一层薄壁包裹的益生菌溶液的体积比为1：50。
进一步的，所述步骤1中洗涤过程如下，向混合溶液中加入PBS缓冲液，充分混合后离心，去上清液；重复操作1～3次；离心采用1000～5000g的离心力离心2～5min。
本发明的有益效果是：
(1)本发明在益生菌细胞壁上原位形成的纳米薄膜，用于益生菌的包封保护；纳米薄膜由天然生物质构成，成本低廉，且无毒副作用；
(2)本发明包封后的益生菌无论是在高浓度的抗生素，活性自由基环境中培育，其相对活性都能接近甚至高于90％，而未受保护的益生菌的相对活性则在30％以下，甚至完全无法存活；
(3)本发明提供的包封材料，包裹益生菌的纳米薄膜的第二层是由生物酶原位通过氢键、疏水相互作用，静电相互作用等多重作用与第一层生物质基材料结合形成，其能水解肠道中的蛋白质、纤维素、淀粉脂肪、乳糖等大分子营养物质，转化为更易被益生菌以及人体吸收的小分子营养物质，促进益生菌的定植、繁衍，并促进患者对营养物质的消化吸收；
(4)本发明包封材料，其在益生菌表面原位形成的薄膜，能与附近的水分子结合，在冷冻时能避免冰晶的形成，从而避免了冷冻过程对益生菌的伤害；
(5)本发明包封方法简单，有利于实现低成本的工业生产，包裹所用材料为天然生物基材料，具有很高的安全性，所得到的益生菌制剂能在运输和储层过程中维持很高的活性，适合用于益生菌制剂领域。
附图说明
图1为实施例3得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封乳酸杆菌的TEM图。
图2为实施例5得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封益生菌混合物的TEM图。
图3为实施例1得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封大肠杆菌和未保护的大肠杆菌对6种抗生素的耐受性实验结果。
图4为实施例3得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封乳酸杆菌和未保护的乳酸杆菌对6种抗生素的耐受性实验结果。
图5为实施例5得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封益生菌混合物和为保护的益生菌混合物对6种抗生素的耐受性实验结果。
图6为实施例6得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料的细胞毒性实验结果。
图7为实施例6得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封大肠杆菌和未保护的大肠杆菌对过氧化氢溶液的耐受性实验结果。
图8为实施例8得到的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封大肠杆菌和为保护的大肠杆菌冷冻后复苏活性实验结果。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。
一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，包括用于包封益生菌的纳米薄膜；纳米薄膜包括两层，第一层为天然生物基高分子与金属离子在益生菌表面通过共价交联或金属螯合作用原位形成；第二层为生物酶与天然生物基高分子相互作用形成。
生物酶为β-半乳糖苷酶，胰淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，纤维素酶中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。金属离子为Al、Fe、Zn、Mn、Ni、Co、V的阳离子中的一种或两种及以上构成的混合物。金属离子为生物相容性良好的金属离子。天然生物基高分子为天然多酚、多巴胺及其衍生物、多糖类生物质、蛋白质类生物质中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。天然高分子多酚可以为杨梅单宁、柿子单宁、黑荆树皮单宁、落叶松单宁、单宁酸等。天然小分子多酚可以为鞣花酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、儿茶素没食子酸酯、花青素、儿茶素等。多糖类生物质为壳聚糖、羧甲基壳聚糖、纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸等。蛋白质类生物质如明胶、胶原等。益生菌乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、双歧杆菌、革兰氏阳性球菌、大肠杆菌、光合细菌中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。常见的益生菌包括Bifidobacterium bifidum、Bifidobacterium breve、Bifidobacterium longum、Lactobacillus casei、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus lactis、Streptococcus lactis以及Escherichia coli Nissle1917。被包封的益生菌中，可以包含一种益生菌，也可以包含多种不同的益生菌形成的益生菌群。
一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料的包封方法，包括以下步骤：
步骤1：将金属盐水溶液与益生菌液充分混合，加入天然生物基高分子水溶液，调节pH值，充分反应，洗涤(洗涤去除未反应的原料)，得到第一层薄膜包裹的益生菌；
益生菌液的优选浓度为1×106～1×109CFU/mL，金属盐溶液的浓度优选为1～10mg/mL，天然生物基高分子浓度为10～100mg/mL；金属盐水溶液与益生菌液体积比1:50，按照与益生菌液体积比1:50加入天然生物基高分子水溶液。
当使用金属螯合作为纳米薄膜形成的主要作用时，将金属盐水溶液与益生菌液充分混合，金属盐水溶液与益生菌液体积比1:50，按照与益生菌液体积比1:50加入天然生物基高分子水溶液充分混合，加入氢氧化钠水溶液调节溶液的pH值。金属离子与天然生物基高分子的邻苯二酚或者羧基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。当使用共价结合作为纳米薄膜形成的主要作用时，将益生菌液与天然生物基高分子水溶液充分混合，加入PBS缓冲液调节pH值，充分混合。邻苯二酚在益生菌细胞壁表面交联，形成纳米薄膜。
洗涤过程如下：
向反应后的混合液中加入PBS缓冲液，充分混合后离心、去上清液，然后重复操作1～3次。离心采用1000～5000g的离心力离心2～5min。其中缓冲液的浓度为0.05～0.5mol/L。
步骤2：调整步骤1得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，重复步骤1操作0～N次；N为3。重复操作对步骤1得到的包裹了超分子纳米薄膜的益生菌进行继续包裹。
步骤3：调整步骤2得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，加入生物酶水溶液，生物酶水溶液与益生菌液体积比为1:50，充分反应形成第二层薄膜包裹的益生菌，冷冻干燥后即可得到封装的益生菌。生物酶水溶液的浓度为1-20mg/mL。生物酶与步骤2中在益生菌上形成的纳米薄膜通过疏水相互作用，氢键、静电相互作用等多重相互作用结合，形成第二层纳米薄膜。
实施例1
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的E coli Niss1e(Escherichia coli Nissle)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/LPBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合。Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合。以3000g的离心力离心3min，去上清液。然后重复加入PBS缓冲液，混合、离心和去上清操作1次；洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整前一步骤得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌的浓度，使E coliNissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液，涡旋振荡10s使二者充分混合。然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合。Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜对包裹了超分子纳米薄膜的益生菌继续包裹。
向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，重复加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清液操作1次，以洗涤去除未反应的原料。
步骤3：调整步骤2得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使E coli Nissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为5mg/mL的β-半乳糖苷酶溶液。涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封E coliNissle。
测试不同抗生素对本实施例包封的Escherichia coli Nissle和未包封Escherichia coli Nissle活性的影响。
(1)将本发明包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液，共配制6份溶液，依次记作1#～6#溶液。向1#溶液中加入环丙沙星溶液终浓度达到抗生素的最小杀菌浓度，充分混合，然后在温度37℃、转速150rpm的条件下反应24h，取100μL菌液等梯度稀释，用平板涂布法评估细胞活性。用同样的方法，配制妥布霉素，新霉素，诺氟沙星，左氧氟沙星，庆大霉素溶液，测定各自的相对细胞活性。
(2)将未包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液，共配制6份溶液，依次记作7#～12#溶液。按照本实施例步骤(1)中的抗生素浓度，分别向7#～12#溶液中加入妥布霉素，新霉素，诺氟沙星，左氧氟沙星，庆大霉素，环丙沙星，然后按照本实施例步骤(1)的操作测定各组的相对细胞活性。
测试结果如图3所示。通过图3可以看到，在抗生素存在时，未经保护的益生菌完全无法存活，而经过本发明包封的Escherichia coli Nissle在各类抗生素的作用下均能保持80％以上的活性。
实施例2
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的B bifidum(益生菌Bifidobacteriumbifidum)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整步骤1得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使B bifidum的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为6mg/mL的胰脂肪酶溶液，涡旋振荡10s以充分混合，静置120min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液；洗涤去除未反应的原料。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封B bifidum。
实施例3
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的L casei(益生菌Lactobacillus casei)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整步骤1得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使L casei的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为10mg/mL的胰蛋白酶溶液，涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液；洗涤去除未反应的原料。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封L casei。
将冷冻干燥得到的包封L casei进行透射电镜测试，结果如图1所示。在图中可以明显观察到细菌表面的一层封装材料。
(1)将包封的Lactobacillus casei，用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液。共配制6份溶液，依次记作1#～6#溶液。向1#溶液中加入环丙沙星溶液终浓度达到抗生素的最小杀菌浓度，充分混合。在37℃、转速为150rpm的条件下反应24h。取100μL菌液等梯度稀释，用平板涂布法评估细胞活性。用同样的方法，配制妥布霉素、新霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、庆大霉素溶液，测定各自的相对细胞活性。
(2)将未包封的Lactobacillus casei，用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液。共配制6份溶液，依次记作7#～12#溶液。按照上述(1)中的抗生素浓度，分别向7#～12#溶液中加入妥布霉素、新霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、庆大霉素、环丙沙星溶液。按照步骤(1)测定各组的相对细胞活性。
结果如图4所示。通过图4可以看到，在抗生素存在时，未经保护的益生菌完全无法存活，而经过本发明包封的Lactobacillus casei在各类抗生素的作用下均能保持80％以上的活性。
实施例4
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的S lactis(益生菌Streptococcus lactis)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整步骤1得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使S lactis的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为5mg/mL的β-半乳糖酶溶液，涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液；洗涤去除未反应的原料。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封S lactis。
实施例5
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的益生菌群(包括Lactobacillus casei、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus helveticus、Lactobacillus rhamnosus、Lactobacillus plantarum、Lactobacillus lactis、Escherichia coli Nissle；上述益生菌以任意比例混合构成)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合。然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整步骤1得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌群(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使益生菌群的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为5mg/mL的酶混合溶液(包括β-半乳糖苷酶，胰淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，纤维素酶，上述酶以任意比例混合构成)，涡旋振荡10s以充分混合，静置120min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液；洗涤去除未反应的原料。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封益生菌群。
将冷冻干燥得到的包封益生菌群进行透射电镜测试，结果如图2所示。在图二中可以明显观察到细菌表面的包封材料。
(1)将本实施例得到的包封的益生菌混合物用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液，共配制6份溶液，依次记作1#～6#溶液。向1#溶液中加入环丙沙星溶液终浓度达到抗生素的最小杀菌浓度，充分混合，然后在温度37℃、转速150rpm的条件下反应24h，取100μL菌液等梯度稀释，用平板涂布法评估细胞活性。用同样的方法，配制妥布霉素，新霉素，诺氟沙星，左氧氟沙星，庆大霉素溶液，测定各自的相对细胞活性。
(2)将未包封的益生菌混合物用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液，共配制6份溶液，依次记作7#～12#溶液。按照本实施例步骤(1)中的抗生素浓度，分别向7#～12#溶液中加入妥布霉素，新霉素，诺氟沙星，左氧氟沙星，庆大霉素，环丙沙星，然后按照本实施例步骤(1)的操作测定各组的相对细胞活性。
结果如图5所示，通过图5可以看到，在抗生素存在时，未经保护的益生菌完全无法存活，而经过本发明包封的益生菌混合物在各类抗生素的作用下均能保持80％以上的活性。
实施例6
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的E coli Nissle(益生菌Escherichia coliNissle)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整前一步骤得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌的浓度，使E coliNissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液，涡旋振荡10s使二者充分混合。然后加入5μL浓度为40mg/mL的单宁酸水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合。Fe3+与单宁酸的羟基络合形成超分子纳米薄膜对包裹了超分子纳米薄膜的益生菌继续包裹。
向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，重复加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清液操作1次，以洗涤去除未反应的原料。
步骤3：调整步骤2得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使E coli Nissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入50μL浓度为10mg/mL的胰淀粉酶溶液和50μL浓度为10mg/mL的α-葡糖苷酶溶液。涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封E coli Nissle。
测试活性氧自由基对本实施例包封的Lactobacillus casei和未包封的Lactobacillus casei活性的影响。
(1)将本发明包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液。向溶液中加入过氧化氢溶液，使终浓度达到3％，充分混合，然后在温度37℃、转速150rpm的条件下反应24h，取100μL菌液等梯度稀释，用平板涂布法评估细胞活性。
(2)将未包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液。按照本实施例步骤(1)中的过氧化氢浓度加入过氧化氢，然后按照本实施例步骤(1)的操作测定各组的相对细胞活性。
测试结果如图6所示，通过图6可以看到，未经保护的益生菌在经过过氧化氢处理后，其活性几乎完全丧失，而本发明包封的益生菌能够抵御过氧化氢的伤害，活性保持在80％以上。
测试冷冻对本实施例包封的Escherichia coli Nissle和未包封的Lactobacillus casei活性的影响。
(1)将本发明包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液，随后迅速放置到-80℃冰箱中冷冻7天。随后，在37℃放置解冻，取100μL菌液等梯度稀释，用平板涂布法评估细胞活性。
(2)将未包封的Escherichia coli Nissle用去离子水配制成浓度为1×106CFU/mL的溶液。按照本实施例步骤(1)的方法冷冻7天，然后按照本实施例步骤(1)的操作测定各组的相对细胞活性。
测试结果如图7所示。通过图7可以看到，未经保护的益生菌在经过冷冻处理后，其活性有很大的下降，而本发明包封的益生菌能够在冷冻处理后，其活性能够完全维持。
实施例7
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的E coli Nissle(益生菌Escherichia coliNissle)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为40mg/mL的黑荆树单宁水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与黑荆树单宁的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整前一步骤得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌的浓度，使E coliNissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液，涡旋振荡10s使二者充分混合。然后加入5μL浓度为40mg/mL的黑荆树单宁水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合。Fe3+与黑荆树单宁的羟基络合形成超分子纳米薄膜对包裹了超分子纳米薄膜的益生菌继续包裹。
向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，重复加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清液操作1次，以洗涤去除未反应的原料。
步骤3：调整步骤2得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使E coli Nissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入100μL浓度为6mg/mL的纤维素酶溶液。涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封E coliNissle。
实施例8
按照以下步骤制备用于益生菌活性保护的生物质基包封材料：
步骤1：取1mL浓度为1×108CFU/mL的E coli Nissle(益生菌Escherichia coliNissle)悬液，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复前述离心和去上清液的操作3次，再加入0.05mol/L PBS调整总体积至500μL，混合均匀，得到益生菌液。将5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液加入益生菌液中，涡旋振荡10s使二者充分混合，然后加入5μL浓度为4mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合，Fe3+与表没食子儿茶素没食子酸酯的羟基络合形成超分子纳米薄膜将益生菌包裹。
然后向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，然后重复该加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清的操作1次，洗涤去除未反应的原料。
步骤2：调整前一步骤得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌的浓度，使E coliNissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入5μL浓度为10mg/mL的FeCl3水溶液，涡旋振荡10s使二者充分混合。然后加入5μL浓度为4mg/mL的表没食子儿茶素没食子酸酯水溶液，涡旋振荡10s使它们充分混合。Fe3+与表没食子儿茶素没食子酸酯的羟基络合形成超分子纳米薄膜对包裹了超分子纳米薄膜的益生菌继续包裹。
向充分混合形成的混合液中加入500μL浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液，涡旋振荡10s以充分混合，以3000g的离心力离心3min，去上清液，重复加入PBS缓冲液、混合、离心和去上清液操作1次，以洗涤去除未反应的原料。
步骤3：调整步骤2得到的超分子纳米薄膜包裹的益生菌(即第一层薄膜包裹的益生菌)的浓度，使E coli Nissle的浓度为1×108CFU/mL，取该溶液1mL并向其中加入50μL浓度为10mg/mL的α-葡糖苷酶溶液。涡旋振荡10s以充分混合，静置60min后，以3000g的离心力离心3min，去上清液。将超分子纳米薄膜包裹的益生菌冷冻干燥，即可得到包封E coliNissle。
采用本实施例制备得到的包封材料测试其细胞毒性
将小鼠成纤维细胞接种于6孔板，3×105cell/well，培养24h后，用100μg/mL的本包封材料共培养处理24h。然后使用FITC Annexin V凋亡检测试剂盒(BD Biosciences,SanJose,CA,USA)，按照制造商说明书检测细胞凋亡。使用流式细胞仪测量荧光强度。
测试结果如图8所示，由图8可以看出，本发明提供的包封材料具有良好的生物相容性。
本发明通过共价结合或金属螯合作用在益生菌细胞壁表面原位形成一层纳米薄膜，可实现对益生菌或者益生菌群的单细胞修饰。随后在这层纳米薄膜的基础上，通过生物酶与第一层生物质基材料的多重相互作用，再包裹一层基于酶的纳米薄膜。所形成的益生菌纳米薄膜能够维持生理活性，并提供一层保护以实现对外界刺激如抗生素、活性自由基的屏蔽。同时不影响益生菌的活性，可以使营养物质穿过，保护益生菌在此类环境中不被杀灭，以确保益生菌在此类外界灭菌物质代谢后能够正常生长。该纳米薄膜能够在益生菌急冻过程中，避免其表面冰晶的形成，从而在制备益生菌冻干粉末的过程中避免其失活。
而第二层由生物酶与第一层的天然高分子通过多重分子间相互作用(由生物酶原位通过氢键、疏水相互作用，静电相互作用等多重相互作用)结合形成的纳米薄膜，纳米薄膜上生物酶能水解肠道中的蛋白质、纤维素、淀粉脂肪、乳糖等大分子营养物质，转化为更易被益生菌以及人体吸收的小分子营养物质，促进益生菌的定植、繁衍，并促进患者对营养物质的消化吸收。
本发明提供的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料包封的益生菌在无论是在高浓度的抗生素，活性自由基环境中培育，其相对活性都能接近甚至高于90％，而未受保护的益生菌的相对活性则在30％以下，甚至完全无法存活。活性自由基，抗生素均为相对分子质量极小的分子，传统包封技术难以实现对这类物质的拦截，因此难以在抗生素存在环境下实验对益生菌活性的保护，本发明提供的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，其基于多酚基团可产生多重相互作用能力，能与各类抗生素产生较强的相互作用，吸附包封材料附近的小分子药物，从而避免了其对益生菌的伤害。
本发明所使用的生物质基包封材料使用了对酶活性具有促进作用的生物质，例如使用多酚类生物质基材料能够与消化酶联协作用，提升酶活性。通过联协作用，我们在这层“盔甲”(第一层薄膜)外再包封了一层消化酶。这些酶作为蛋白质外壳，能够提升包封益生菌在肠道的生物相容性，并且在第一层包封材料的促进作用下能保持很高的酶活性，能够通过快速水解大分子的营养物质，促进肠道功能紊乱的患者对营养的吸收，并同时为益生菌提供营养，促进益生菌在肠道的定植，加速恢复患者肠道菌群平衡。在遇到复杂的外界环境，如存在活性氧自由基时，内部的生物质基“盔甲”能够通过吸附消耗掉附近的有害物质，在维持益生菌的活性的同时，并进一步的维持酶活性。所用的两层包封材料相互之间通过π-π堆叠，氢键，亲疏水相互作用，静电相互作用等多重相互作用结合，结合能力较强，不易解离，能在较长的时间内保护益生菌。同时这两层材料都具有亲疏水两亲性质，水分会在材料表面形成一层水膜，在冷冻的时候能够避免锋利的冰晶的形成。用本发明包封的益生菌，在生成益生菌制剂经过冷冻干燥处理的时候，无需额外添加保护剂，即可极大的避免益生菌在冷冻过程中受损，维持其活性。
本发明提供的用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，其在细菌表面原位形成的薄膜，能与附件的水分子结合，在冷冻时能避免冰晶的形成，从而避免了冷冻过程对细菌的伤害。提供了用于益生菌活性保护的生物质基包封材料的包封方法，该方法的操作非常简单，快速，有利于实现低成本的工业生产，包裹所用材料为天然生物质基材料，具有很高的安全性，所得到的益生菌制剂能在运输和储存过程中维持很高的活性，适合用于益生菌制剂领域。
Claims (4)
1.一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，其特征在于，包括用于包封益生菌的纳米薄膜；纳米薄膜包括两层，第一层为天然生物基高分子与金属离子在益生菌表面通过共价交联或金属螯合作用原位形成；第二层为生物酶与天然生物基高分子相互作用形成；生物酶为β-半乳糖苷酶，胰淀粉酶，α-葡糖苷酶，β-葡糖苷酶，胰脂肪酶，胰蛋白酶，纤维素酶中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物；金属离子为Fe3+；天然生物基高分子为单宁酸、表没食子儿茶素没食子酸酯、黑荆树单宁中的一种；
包封方法，包括以下步骤：
步骤1：将金属盐水溶液与益生菌液充分混合，加入天然生物基高分子水溶液，调节pH值，充分反应，洗涤，得到第一层薄膜包裹的益生菌；
步骤2：调整步骤1得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，重复步骤1操作0～N次；
步骤3：调整步骤2得到的第一层薄膜包裹的益生菌浓度，加入生物酶水溶液，充分反应形成第二层薄膜包裹的益生菌，冷冻干燥后即可得到封装的益生菌；
步骤1中益生菌液的浓度为1×106～1×109CFU/mL，金属盐水溶液的浓度为1～10mg/mL；天然生物基高分子水溶液的浓度为10～100mg/mL；金属盐水溶液与益生菌液体积比为1:50，天然生物基高分子水溶液与益生菌液体积比为1:50；
步骤2和步骤3中调整后的第一层薄膜包裹的益生菌浓度为1×106～1×109CFU/mL，步骤3中生物酶水溶液浓度为1～20mg/mL；生物酶水溶液与第一层薄壁包裹的益生菌溶液的体积比为1：50。
2.根据权利要求1所述的一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，其特征在于，所述益生菌为乳酸杆菌、芽孢杆菌、酵母菌、双歧杆菌中的一种或两种及以上以任意比例构成的混合物。
3.根据权利要求1所述的一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材，其特征在于，所述步骤1中采用氢氧化钠水溶液或者PBS缓冲液调节pH为7.0。
4.根据权利要求1所述的一种用于益生菌活性保护的生物质基包封材料，其特征在于，所述步骤1中洗涤过程如下，向混合溶液中加入PBS缓冲液，充分混合后离心，去上清液；重复操作1～3次；离心采用1000～5000g的离心力离心2～5min。
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