CN111714473A - 一种肠靶向的口服益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肠靶向的口服益生菌制剂及其制备方法和应用，所述制剂的核心是含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核，从内核往外，依次交替包裹碱性氨基酸聚合物层和海藻酸钙层，最外层是碱性氨基酸聚合物层；所述的制剂含有至少2层碱性氨基酸聚合物层。本发明微囊采用多层结构，相较于单层微囊，包覆效果更致密，能很好包埋微生物；抗酸性更好，能抵抗胃酸、胆盐的侵袭，显著提高细菌存活率。本发明的多层微囊以碱性氨基酸聚合物为外层包裹层，不会抑制微囊崩解，反而能使微生物快速精准高效地在小肠末端释放，靶向性优良。
Description
技术领域
本发明属于生物材料领域，具体涉及一种肠靶向的口服益生菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
益生菌广泛存在于人体肠道等部位，是人体肠道微生态的重要组成部分。益生菌已被证实与人体的生理作用密切相关，除改善肠道健康、促进营养吸收外，还与糖尿病、心血管疾病、肝病、肿瘤等疾病密切相关。因此，将益生菌精准递送到结肠等部位并定殖，从而调节肠道内的菌群平衡，进而调节宿主黏膜与系统免疫功能，对人类健康有重要意义。
目前人们主动摄取益生菌的主要途径有介入式粪菌移植和口服益生菌制剂(粉、片或流体)。但介入式粪菌移植需临床操作、条件要求高，且受众体验和耐受性差，无法大规模推广。口服益生菌制剂给药方便、耐受性好、易于大规模推广，是人们摄取益生菌的发展方向。但口服益生菌目前面临生物利用度低、难定植等缺陷。
优良的口服益生菌制剂须满足下列条件：第一，制剂须克服胃酸、胃蛋白酶以及胆盐的生理屏障，使益生菌在到达结肠部位时仍有足够的活性且可定殖；第二，制剂须有合适的崩解位点及较高的崩解度，确保在肠道部位靶向释放、且在排出消化道前能将益生菌全部或者大部分放出；第三，制剂必须有较高的黏附强度及足够多的黏附位点，从而提高益生菌在肠道的滞留率；第四，受个体因素限制较小，有利于推广；第五，制备工艺简单、快捷、温和，适宜于大规模工艺生产；第六，所用制剂材料具有良好的生物安全性。然而，现有的口服益生菌递送系统多只针对一个或几个方面展开优化，很难能从真正实现口服益生菌的生物利用度。
中国发明专利ZL201310024931.0公开了一种口服pH响应性肠靶向载体及其制备方法与应用，该载体由海藻酸钙凝胶内核和硫酸鱼精蛋白层组成。该专利虽然在一定程度上实现了益生菌耐酸和耐胆盐活性的提高，但未能很好地解决益生菌在肠道部位的靶向释放问题，且其益生菌存活率仍有待提高。因此，如何较为快速便捷地制备出耐胃酸和胆盐活性高、具有肠道靶向、生物利用度高、定植效果好的口服益生菌制剂，便成为当前生物医学工程领域亟待解决的重要课题。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种肠靶向的口服益生菌制剂，是包裹了多层碱性氨基酸聚合物的益生菌海藻酸钙微球。
本发明的另一目的在于提供上述肠靶向的口服益生菌制剂的制备方法，首先通过静电液滴法制备一定粒径大小海藻酸钙微囊，再先后吸附碱性氨基酸聚合物、海藻酸钠及氯化钙，制备可负载益生菌的多层碱性氨基酸聚合物-海藻酸钙微囊。
本发明的另一目的在于提供上述的口服益生菌制剂在肠道靶向递送益生菌中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种肠靶向的口服益生菌制剂，其核心是含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核，从内核往外，依次交替包裹碱性氨基酸聚合物层和海藻酸钙层，最外层是碱性氨基酸聚合物层；所述的制剂含有至少2层碱性氨基酸聚合物层。
优选地，所述的碱性氨基酸聚合物为2层。
所述的益生菌可以是乳酸链球菌、植物乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种中的一种以上；
所述的碱性氨基酸聚合物是等电点条件下pH值大于7且主要组分为赖氨酸及精氨酸的蛋白质或多肽；
所述的碱性氨基酸聚合物优选鲑精蛋白、鲱精蛋白、鲟精蛋白、溶菌酶、聚赖氨酸、聚精氨酸或大豆碱性多肽中的一种以上；
所述的肠靶向尤其是指结肠靶向。
上述口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将益生菌用海藻酸钠溶液重悬，然后滴加到钙离子溶液中，固化反应生成含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核；
(2)步骤(1)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后加入到碱性氨基酸聚合物溶液中，振荡反应，在海藻酸钙凝胶内核包裹上一层碱性氨基酸聚合物；
(3)步骤(2)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后重复步骤(1)和(2)的操作至少一次，制得至少包裹两层碱性氨基酸聚合物的口服益生菌制剂；
步骤(1)中，所述海藻酸钠的分子量为1～20万，所述海藻酸钠溶液的浓度(W/V)为0.5-2.5％；
步骤(1)所述的滴加优选采用注射泵操作，注射泵流速为8-12mL/h；
步骤(1)所述的钙离子溶液是钙离子的可溶性盐溶液，可以是氯化钙溶液、硝酸钙溶液，等等；其中钙离子的浓度优选0.1-1M；
步骤(1)所述固化反应的时间优选40-60min；
步骤(2)所述碱性氨基酸聚合物溶液的浓度为2-5mg/mL；
步骤(2)所述的振荡反应，转速为80-150rpm，反应时间为10-20min。
上述的口服益生菌制剂可以应用在肠道靶向递送益生菌中。
本发明的原理是：本专利采用多层结构益生菌微囊，由于结构更加致密，能可以更好地隔绝胃酸、蛋白酶及胆盐对益生菌的侵蚀，确保高活性的益生菌通过人体消化道屏障；多层微囊进入肠道之后，因为胰蛋白酶能够特异性结合并与外层的碱性氨基酸聚合物层反应，使得碱性氨基酸聚合物层降解，同时消耗内层海藻酸钙中的钙离子，使其快速脱落。
当碱性氨基酸聚合物和海藻酸钙在微囊表面交替形成多层结构时，胰蛋白酶会优先与外层的碱性氨基酸聚合物及海藻酸钙反应，延缓与海藻酸钙母体(即含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核)作用的时间，导致其会在小肠的末端才开始崩解。
同时，由于酶的亲和性，会有越来越多的胰蛋白酶分子结合并参与海藻酸钙母体的崩解反应，使得母体崩解强度更加剧烈，能在短时间内崩解完全，崩解时间的延迟与崩解强度的提高，说明该多层微囊能将益生菌高效地递送至远端消化道，释放位点明确，有良好的结肠靶向效应；当多层微囊崩解后，具有黏性的微囊材料会帮助益生菌黏附在肠道上，由于益生菌已完全放出，在肠道的黏附位点足够多，益生菌滞留率进一步提高；胰蛋白酶是消化液是重要组分之一，本发明多层微囊仅仅依赖胰蛋白酶的触发作用，具有一定普适性。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
1、本发明微囊采用多层结构，相较于单层微囊，包覆效果更致密，能很好包埋微生物；抗酸性更好，能抵抗胃酸、胆盐的侵袭，显著提高细菌存活率。
2、本发明的多层微囊以碱性氨基酸聚合物为外层包裹层，不会抑制微囊崩解，反而能使微生物快速精准高效地在小肠末端释放，靶向性优良。
3、本发明多层微囊能在短时间内从固态崩解成为液态，在结肠处的黏附位点足够多，结肠的滞留率显著提高。
4、相较于其他益生菌口服递送系统，本发明多层微囊仅仅依赖消化道内胰蛋白酶的作用，受个体因素影响较小，有利于推广。
5、本发明采用静电液滴法，制备工艺简单快捷温和，无活性损失，微囊粒径均一，适合工业化生产。
6、本发明的多层微囊使用的原料(海藻酸钠、碱性氨基酸聚合物、氯化钙)具有良好的生物安全性及生物相容性，在食品加工领域已广泛使用，生物安全性有保障。
附图说明
图1是实施例3中多层微囊先后在人工胃液及人工小肠液中崩解度的崩解曲线；其中的小图为AP0.5；
图2是实施例1中Balb/c小鼠用多层微囊灌胃24h后消化道解剖荧光成像图；
其中，plain代表未包埋，AP0.5代表海藻酸钙微囊，AP1.0、AP2.0及AP3.0分别代表包裹1、2、3层碱性氨基酸聚合物的海藻酸钙微囊。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL鲑精蛋白溶液，80rpm振荡一段10min，得到鲑精蛋白为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2mg/mL鲑精蛋白溶液处理后得到鲑精蛋白为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到鲑精蛋白为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例2
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL鲑精蛋白溶液，150rpm振荡一段20min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，依次加入至1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲑精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例3
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL鲑精蛋白溶液，100rpm振荡一段15min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，依次加入至0.5％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲑精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例4
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL鲱精蛋白溶液，80rpm振荡一段10min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，依次加入至0.1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲱精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例5
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL鲱精蛋白溶液，150rpm振荡一段20min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲱精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例6
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL鲱精蛋白溶液，100rpm振荡一段15min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至0.5％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲱精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例7
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL鲟精蛋白溶液，80rpm振荡一段10min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至0.1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲟精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例8
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL鲟精蛋白溶液，150rpm振荡一段20min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲟精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例9
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL鲟精蛋白溶液，100rpm振荡一段15min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至0.5％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到鲟精蛋白为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例10
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL溶菌酶溶液，80rpm振荡一段10min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至0.1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到溶菌酶为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例11
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL溶菌酶溶液，150rpm振荡一段20min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至1％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到溶菌酶为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例12
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL溶菌酶溶液，100rpm振荡一段15min；
4.吸取上清，用去离子水洗涤2次，；依次加入至0.5％海藻酸钠与0.1M氯化钙溶液中；
5.分别重复步骤1-2次，分别得到溶菌酶为1，2，3层的海藻酸钙微球；
6.将所得的海藻酸钙微球置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例13
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL聚赖氨酸溶液，80rpm振荡一段10min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚赖氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2mg/mL聚赖氨酸溶液处理后得到聚赖氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚赖氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例14
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL聚赖氨酸溶液，150rpm振荡一段20min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚赖氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为5mg/mL聚赖氨酸溶液处理后得到聚赖氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚赖氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例15
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL聚赖氨酸溶液，100rpm振荡一段15min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚赖氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2.5mg/mL聚赖氨酸溶液处理后得到聚赖氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚赖氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例16
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL聚精氨酸溶液，80rpm振荡一段10min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚精氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2mg/mL聚精氨酸溶液处理后得到聚精氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚精氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例17
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL聚精氨酸溶液，150rpm振荡一段20min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚精氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，150rpm振荡一段20min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为5mg/mL聚精氨酸溶液处理后得到聚精氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚精氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例18
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1mol/L氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL聚精氨酸溶液，100rpm振荡一段15min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到聚精氨酸为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，100rpm振荡一段15min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2.5mg/mL聚精氨酸溶液处理后得到聚精氨酸为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到聚精氨酸为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例19
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的乳酸链球菌培养至OD值0.4后，离心弃上清，用体积比为1：10的0.5％海藻酸钠(分子量为20万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压6000V，注射泵流速为10ml/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤2次，加入浓度为2mg/mL大豆碱性多肽溶液，80rpm振荡一段10min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到大豆碱性多肽为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，80rpm振荡一段10min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于0.1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为2mg/mL大豆碱性多肽溶液处理后得到大豆碱性多肽为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到大豆碱性多肽为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例20
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的植物乳酸杆菌培养至OD值0.6后，离心弃上清，用体积比为1：20的2.5％海藻酸钠(分子量为1万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压4500V，注射泵流速为12ml/h，滴加到1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为5mg/mL大豆碱性多肽溶液，150rpm振荡一段20min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到大豆碱性多肽为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，150rpm振荡一段20min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为5mg/mL大豆碱性多肽溶液处理后得到大豆碱性多肽为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到大豆碱性多肽为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例21
一种口服益生菌制剂的制备方法，包括以下步骤：
1.将已活化的双歧杆菌培养至OD值0.5后，离心弃上清，用体积比为1：15的2％海藻酸钠(分子量为10万)溶液重悬；
2.搭建静电液滴装置，设定高压电源电压5000V，注射泵流速为10mL/h，滴加到0.1M氯化钙溶液中；
3.固化一段时间后，弃上清，用去离子水洗涤3次，加入浓度为2.5mg/mL大豆碱性多肽溶液，100rpm振荡一段15min，吸去上清，用去离子水洗涤2次，得到大豆碱性多肽为1层的海藻酸钙微囊；
4.加入浓度为0.2％海藻酸钠溶液，150rpm振荡一段20min，用去离子水洗去表面多于的海藻酸钠后，再次置于1mol/L氯化钙溶液中固化10min后洗净，用浓度为5mg/mL大豆碱性多肽溶液处理后得到大豆碱性多肽为2层的海藻酸钙微囊；
5.重复步骤4，得到大豆碱性多肽为3层的海藻酸钙微囊；
6.将所得的海藻酸钙微囊置于用生理盐水重悬，置于4℃备用。
实施例22存活率及靶向性检测
为了易于表征，采用红色荧光大肠杆菌MG1655(替代各实施例中的益生菌)进行检测。
用1mL无菌生理盐水重悬本发明所得的海藻酸钙微囊(即口服益生菌制剂)，加入到9mL pH值为2.5的人工胃液中，置于37℃水浴摇床中震荡培养，在120min时取样，梯度稀释，涂布平板计数(平板含有终浓度为60μg/L的氨苄西林霉素)，测其活菌率。
未被碱性氨基酸聚合物处理过的海藻酸钙微囊及大肠杆菌蒸馏水水悬液作为对照组。
结果见表1：
表1本发明的口服益生菌制剂在pH值＝2.5的人工胃液2h存活率
注：plain代表未包埋(即大肠杆菌蒸馏水水悬液)，AP0.5代表未被碱性氨基酸聚合物处理过的海藻酸钙微囊，AP1.0、AP2.0及AP3.0分别代表碱性氨基酸聚合物为1、2、3层的多层结构的海藻酸钙微囊。
表1中可知，随着层数的增加，实施例4、7、10的红色荧光大肠杆菌存活率逐渐提高，碱性氨基酸聚合物为2层时存活率最高。
将实施例3中分别包裹1层、2层、3层鲑精蛋白的海藻酸钙微囊(口服益生菌制剂)先置于pH＝2.5的人工胃液中2h、再置于pH＝6.8的人工小肠液中2h，定时定量取样，于595nm波长下测定其吸光度，取样后补充相同体积的模拟小肠液。
由图1可知，未包裹的海藻酸钙在24小时内显示较低的崩解强度，未出现明显的波峰，证明单纯的海藻酸钙微囊在小肠环境中崩解性能不佳。
而当鲑精蛋白层数为1，2，3层时，多层微囊(口服益生菌制剂)在小肠液中2小时内皆出现波峰，证明，鲑精蛋白层有显著的促崩解作用。在转入小肠液后的1小时后，AP2.0与AP3.0崩解度一度低于AP1.0(箭头所示)，但之后迅速出现波峰。这说明多层结构相较于单层，能在前期抑制崩解，后期促进崩解，有一定的靶向性能。如图，AP2.0的靶向性略强于AP3.0，这可能与前期AP3.0的过早崩解释放(箭头所示)有关。
将实施例1得到的分别包裹1层、2层、3层鲑精蛋白的海藻酸钙微球(口服益生菌制剂)、未包裹鲑精蛋白的海藻酸钙微球、乳酸链球菌，分别对12周龄Balb/c小鼠灌胃，在24h解剖小鼠，取消化道进行活体成像检测。
由图2可知，24小时后，plain组(乳酸链球菌)由于缺乏材料的保护，细菌大量死亡，很快被胃肠道清除。
AP0.5(未包裹鲑精蛋白的海藻酸钙微球)虽然在海藻酸钙的保护下，存活有所改善，但单纯的海藻酸钙微囊不能够在肠道内有效崩解释放出细菌，导致含细菌的微囊被排出体外，因此也显示较少的荧光信号。
AP1.0、AP2.0及AP3.0均在结肠处留有明显的荧光信号，但AP1.0由于靶向性较弱，结肠荧光信号并不明显，AP3.0由于外围的鲑精蛋白含量较高，酶解反应剧烈，导致在前期就有大量的崩解及释放信号，因此在小肠中段有较多的荧光信号，反之在结肠的荧光信号略弱于AP2.0。相对而言，AP2.0鲑精蛋白含量适中，释放位点明确，能将大部分细菌运载至结肠部位定殖。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种肠靶向的口服益生菌制剂，其特征在于：所述制剂的核心是含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核，从内核往外，依次交替包裹碱性氨基酸聚合物层和海藻酸钙层，最外层是碱性氨基酸聚合物层；所述的制剂含有至少2层碱性氨基酸聚合物层；
所述的碱性氨基酸聚合物是等电点条件下pH值大于7且主要组分为赖氨酸及精氨酸的蛋白质或多肽。
2.根据权利要求1所述的口服益生菌制剂，其特征在于：所述的碱性氨基酸聚合物层为2层。
3.根据权利要求1所述的口服益生菌制剂，其特征在于：所述的碱性氨基酸聚合物为鲑精蛋白、鲱精蛋白、鲟精蛋白、溶菌酶、聚赖氨酸、聚精氨酸或大豆碱性多肽中的一种以上。
4.根据权利要求1所述的口服益生菌制剂，其特征在于：所述的益生菌是乳酸链球菌、植物乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、德式乳杆菌保加利亚亚种中的一种以上。
5.根据权利要求1所述的口服益生菌制剂，其特征在于：所述的肠靶向是指结肠靶向。
6.权利要求1-5任一项所述的口服益生菌制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将益生菌用海藻酸钠溶液重悬，然后滴加到钙离子溶液中，固化反应生成含有益生菌的海藻酸钙凝胶内核；
(2)步骤(1)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后加入到碱性氨基酸聚合物溶液中，振荡反应，在海藻酸钙凝胶内核包裹上一层碱性氨基酸聚合物；
(3)步骤(2)反应得到的溶液弃上清，余下溶液用去离子水洗涤，然后重复步骤(1)和(2)的操作至少一次，制得至少包裹两层碱性氨基酸聚合物的口服益生菌制剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述海藻酸钠的分子量为1～20万，所述海藻酸钠溶液的浓度(W/V)为0.5-2.5％。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述的钙离子溶液是氯化钙溶液或硝酸钙溶液，其中钙离子的浓度为0.1-1M。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述碱性氨基酸聚合物溶液的浓度为2-5mg/mL。
10.权利要求1-5任一项所述的口服益生菌制剂在肠道靶向递送益生菌中的应用。
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