CN110856714A - 氧化魔芋微球在食品或药品递送系统中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了微球载体、制备微球载体的方法、包埋物、药物、食品、包埋物在制备药物或食品中的用途。所述微球载体包括具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。

Description

氧化魔芋微球在食品或药品递送系统中的应用
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及氧化魔芋微球在食品或药品递送系统中的应用。更具体地，本发明涉及微球载体、制备微球载体的方法、包埋物、药物、食品、包埋物在制备药物或食品中的用途。
背景技术
多糖是地球上种类最多的、重要的生物聚合物，基于不同种类多糖已建立起多种包埋体系，如基于淀粉、壳聚糖、海藻酸钠这些材料所制备的微球载体。其中，魔芋葡甘露聚糖(Konjac Glucomannan,KGM)作为一种天然益生葡甘露聚糖，可从多年生的草本植物魔芋中提取。它是一种通过β-1,4-或β-1,3-糖苷键连接β-D-甘露糖和β-D-葡萄糖而形成的杂葡甘露聚糖。由于人体内不存在消化这种魔芋葡甘露聚糖的酶，只有大肠中存在的部分微生物可以分解并利用这种葡甘露聚糖，因而可以将其作为一种稳定的运输载体并有效抵挡胃肠道中的环境屏障。
然而，目前由魔芋葡甘露聚糖形成的微球载体仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
通常而言，微球载体中包埋的功能因子最好能够在肠道内释放，使其达到较高的生物利用率。但是，氧化魔芋葡甘露聚糖微球载体大多是通过铁离子交联而形成的凝胶微球，在氢离子浓度极高的条件下(如胃液中)，氢离子会和铁离子竞争性结合羧基而使得微球结构被破坏，释放其中的功能因子，造成其生物利用率低。
有鉴于此，发明人将氧化魔芋葡甘露聚糖(简称OKGM)通过酰胺反应引入半胱氨酸(简称Cys)，即得到巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。进一步通过交联反应制备巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖微球载体。同时，在交联反应过程中，OKGM-Cys的半胱氨酸上的部分巯基之间被氧化成二硫键，使得微球载体的结构更加稳定，从而提高微球载体在胃液中的稳定性。由此，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微球载体。根据本发明的实施例，该微球载体包括具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。发明人通过将氧化魔芋葡甘露聚糖上引入半胱氨酸，巯基之间可以形成二硫键，使得微球的结构更加稳定，在胃液中不易被降解。在肠道中，相互交联的氧化魔芋葡甘露聚糖之间的交联键断开，使得微球降解，释放其中的功能因子。并且，氧化魔芋葡甘露聚糖上的二硫键打开，形成的巯基可以与肠粘液层上的巯基氧化形成二硫键，以增强氧化魔芋葡甘露聚糖与肠粘液层的相互作用，粘附性能高，具有缓释效果，可充分释放其中的功能因子，持效性好，使得功能因子具有较高的生物利用率。
根据本发明的实施例，上述微球载体还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，部分所述巯基之间形成二硫键。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述微球载体包括多个通过交联剂交联的所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，优选地，所述交联剂包括铁离子。由此，使得微球载体具有一定的pH响应特性，可以在肠液内降解，释放其中的功能因子。
根据本发明的实施例，所述巯基修饰是通过使氧化魔芋葡甘露聚糖与半胱氨酸发生反应而获得的。由此，以便引入巯基，提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠液中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述氧化魔芋葡甘露聚糖中巯基含量为50～500μmol/g，优选250～350μmol/g。由此，以便提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述微球载体中铁离子含量为0.1～1mmol/g。由此，以便提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述微球载体的粒径为10～20μm。由此，以便提高微球载体的稳定性。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述微球载体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖与含铁化合物在水中进行混合，以便获得水相溶液；将所述水相溶液加入到油相溶液中，以便形成油包水乳液；以及向所述油包水乳液中通入空气，以便获得所述微球载体。由此，利用根据本发明实施例的方法所得到的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。并且，操作简便，成本低，适于规模化生产。
根据本发明的实施例，所述含铁化合物选自硫酸亚铁、七水合硫酸亚铁和四水合氯化亚铁的至少之一。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述油相溶液选自含有span 80的石蜡油。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，基于1mg所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，所述含铁化合物的用量为0.1～0.2mg。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖是通过下列方式获得的：将氧化魔芋葡甘露聚糖溶解于水中，以便获得水溶液；将所述水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化处理，以便获得活化液；将所述活化液与半胱氨酸盐酸盐进行第一混合处理，以便获得第一混合液；将所述第一混合液与乙醇进行第二混合处理，过滤，收集沉淀，以便获得所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，基于1g所述氧化魔芋葡甘露聚糖，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为0.5～2g，所述半胱氨酸盐酸盐的用量为0.2～1g。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
根据本发明的实施例，所述活化时间为0.5～1.5小时，所述第一混合处理时间为12～36小时。由此，以进一步提高微球载体在胃液中的稳定性以及在肠道中的粘附性。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种包埋物。根据本发明的实施例，所述包埋物包括：前面所述的微球载体；以及功能因子，所述功能因子包埋于所述微球载体上。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
根据本发明的实施例，所述微球载体上功能因子的包埋率为10～20％。
根据本发明的实施例，所述功能因子呈亲水性。由此，能够稳定地包埋于亲水性的微球载体上。
根据本发明的实施例，所述功能因子包括药物。
根据本发明的实施例，所述药物包括微生物、核酸和蛋白质的至少之一
根据本发明的实施例，所述核酸选自micro RNA，优选miRNA-27a。由此，包埋有该核酸的微球载体能够起到抑制脂肪形成的效果。
根据本发明的实施例，所述蛋白质选自携带有miRNA-31的α-乳清蛋白。由此，包埋有该蛋白质的微球载体能够起到治疗结肠炎或结肠癌的效果。
根据本发明的实施例，所述微生物为益生菌，优选乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和酪酸梭菌的至少之一。由此，包埋有上述微生物的微球载体在肠道内具有较好的定植效果，起到维持肠道菌群平衡作用。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物含有前面所述的包埋物。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，所述食品含有前面所述的包埋物。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述包埋物在制备药物或食品中的用途。根据本发明的实施例，所述功能因子为miRNA-27a，所述药物或食品用于抑制脂肪形成。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，可充分释放其中的miRNA-27a，使其具有较高的生物利用率，抑制脂肪形成的效果好。
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述包埋物在制备药物或食品中的用途。根据本发明的实施例，所述功能因子为携带有miRNA-31的α-乳清蛋白，所述药物或食品用于治疗结肠炎或结肠癌。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，可充分释放其中携带有miRNA-31的α-乳清蛋白，使其具有较高的生物利用率，治疗结肠炎或结肠癌的效果好。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的制备微球载体方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的制备具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖方法的流程示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的微球载体的肠胃液稳定性分析示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的未经包埋的miR-27a-Cy3/经包埋的miR-27a-Cy3灌胃后的肠道切片图；
图5显示了根据本发明一个实施例的包埋miR-27a-Cy3微球载体的肠胃液稳定性分析示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的miR-27a-Cy3在模拟胃肠液中的释放率随消化时间变化图；
图7显示了根据本发明一个实施例的显微镜观察体外模拟胃肠液消化微球载体的菌体示意图，其中，A、B是体外模拟胃液消化30min后的明场、Cy3荧光场的结果；C、D是体外模拟肠液消化60min后明场、Cy3荧光场的结果；
图8显示了根据本发明一个实施例的模拟肠胃液消化后用生长曲线测定仪测量菌泥的生长曲线浊度图；
图9显示了根据本发明一个实施例的灌胃后的小鼠肠道各部位的乳酸乳球菌数目随时间的变化示意图；
图10显示了根据本发明一个实施例的灌胃68h后空肠(中段)冰冻切片图(切片厚度：10微米)，其中，A、B表示未经包埋的菌液组在明场、Cy3荧光场的结果；C、D表示包菌微球组在明场、Cy3荧光场的结果；
图11显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球与载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC阴性对照组分别施加于DSS处理5天后的miR-31敲除小鼠的结肠的实物图及长度分析示意图；
图12显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球与空载的OKGM-PS-NC对照组分别施加于DSS处理5天后的miR-31敲除小鼠的结肠切片的显微观察图；
图13显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球、空载的OKGM-PS以及载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC分别施加于DSS处理5天后的野生型小鼠后小鼠的体重变化曲线图；
图14显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球、空载的OKGM-PS以及载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC分别施加于DSS处理5天后的野生型小鼠后小鼠结肠的实物图及长度分析示意图；
图15显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球、空载的OKGM-PS、以及载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC分别施加于DSS处理5天后的野生型小鼠后小鼠结肠切面H&E染色显微观察图；
图16显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球、空载的OKGM-PS以及载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC分别施加于DSS处理5天后的野生型小鼠后小鼠的临床评分结果；
图17显示了根据本发明一个实施例的OKGM-PS-miR-31微球、空载的OKGM-PS以及载入蛋白纳米球的OKGM-PS-NC分别施加于DSS处理5天后的野生型小鼠后小鼠的结肠内的Gp130、Gsk3、Dlg1和Lats2的免疫组化结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
本发明提出了微球载体、制备微球载体的方法、包埋物、药物、食品、包埋物在制备药物或食品中的用途，下面将分别对其进行详细描述。
微球载体
在本发明的一个方面，本发明提出了一种微球载体。根据本发明的实施例，该微球载体包括具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。发明人通过在氧化魔芋葡甘露聚糖上引入半胱氨酸(具有巯基基团)，巯基之间可以形成二硫键，使得微球载体的结构更加稳定，在胃液中不易被降解。在肠道中，相互交联的氧化魔芋葡甘露聚糖之间的交联键断开，使得微球降解，释放其中的功能因子。并且，氧化魔芋葡甘露聚糖上的二硫键打开、伸展，接触肠粘液的面积增大，更容易与肠粘液层上的巯基发生置换反应，形成二硫键，以增强氧化魔芋葡甘露聚糖与肠粘液层的相互作用，粘附性能高，具有缓释效果，可充分释放其中的功能因子，持效性好，使得功能因子具有较高的生物利用率。
根据本发明的实施例，部分巯基之间形成二硫键。由此，使得微球载体的结构更加稳定，在胃液中不易被降解。
根据本发明的实施例，微球载体包括多个通过交联剂交联的具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，优选地，交联剂包括铁离子。铁离子在中性及偏碱性的溶液(肠粘液)中会生成铁的氢氧化物而使微球载体降解，释放出被包埋的物质，因此该氧化魔芋微球载体具有一定的pH响应特性。
根据本发明的实施例，巯基修饰是通过将氧化魔芋葡甘露聚糖与半胱氨酸发生酰胺反应而获得的。通过酰胺反应引入巯基，巯基之间可以形成二硫键，使得微球载体的结构更加稳定，在胃液中不易被降解。在肠道中，相互交联的氧化魔芋葡甘露聚糖之间的交联键断开，使得微球载体降解，释放其中的功能因子。并且，氧化魔芋葡甘露聚糖上的二硫键打开、伸展，接触肠粘液的面积增大，更容易与肠粘液层上的巯基发生置换反应，形成二硫键，以增强氧化魔芋葡甘露聚糖与肠粘液层的相互作用，粘附性能高，具有缓释效果，可充分释放其中的功能因子，持效性好，使得功能因子具有较高的生物利用率。
根据本发明的实施例，氧化魔芋葡甘露聚糖中巯基含量为50～500μmol/g，优选250～350μmol/g。发明人发现，巯基含量会影响微球载体的特性，当巯基含量为50～500μmol/g时，微球载体特性较好。若巯基含量过低，不易形成二硫键，交联度低，使得微球载体在胃液中的稳定性和在肠粘液中的粘附性下降；若巯基含量过高，形成的二硫键过多，交联度过高，导致微球载体的稳定性过高，在肠粘液中不易降解，从而无法释放其中的功能因子。
根据本发明的实施例，微球载体中铁离子含量为0.1～1mmol/g。发明人发现，铁离子含量会影响微球载体的交联度。若铁离子含量过低，交联度低，不能很好地形成微球载体；若铁离子含量过高，过量的铁离子中和了羧基的负电荷，减弱了微球载体之间的排斥力，容易引起团聚。当铁离子含量为0.1～1mmol/g时，交联度适宜，稳定性强，不易发生团聚现象。
根据本发明的实施例，氧化魔芋葡甘露聚糖的羧基上的巯基与铁的摩尔比为1：(40～70)。由此，交联度适宜，稳定性强，且不易发生团聚现象。
根据本发明的实施例，微球载体的粒径为10～20μm。由此，以便提高微球载体的稳定性和口感，且包埋率高。若粒径过高，微球载体在制备或者包埋体系中容易出现聚沉现象，且食用时口感略差，沙粒感强；若粒径过小，没有过多的空间可用于包埋，造成包埋率低。
制备微球载体的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述微球载体的方法。根据本发明的实施例，参见图1，该方法包括：S100混合、S200形成油包水乳液和S300通入空气。由此，利用根据本发明实施例的方法所得到的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。并且，操作简便，成本低，适于规模化生产。下面将对其进行详细描述。
为了方便理解，下面简要阐述下制备微球载体的原理：
本发明是基于OKGM上的羧基和三价铁离子可以发生配位反应以制备微球载体。具体地，利用空气中的氧气能使交联剂Fe2+氧化为Fe3+，Fe3+将OKGM交联使其在水相中固化，最终制成微球载体。
根据本发明的实施例，该方法包括：
S100混合
在该步骤中，将具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖与含铁化合物在水中进行混合，以便获得水相溶液。
根据本发明的实施例，含铁化合物选自硫酸亚铁、七水合硫酸亚铁和四水合氯化亚铁的至少之一。由此，含铁化合物中的Fe2+在后续步骤S300中通入的空气作用下氧化为Fe3+，从而能够与羧基发生配位反应，交联固化，形成微球载体。
根据本发明的实施例，基于1mg具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，含铁化合物的用量为0.1～0.2mg。由此，以便保证微球载体中铁含量为0.1～1mmol/g，使其稳定性好，不易团聚。
根据本发明的实施例，参见图2，具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖是通过下列方式获得的：S110将氧化魔芋葡甘露聚糖溶解于水中、S120活化处理、S130第一混合处理、S140第二混合处理，过滤，收集沉淀。通过OKGM与半胱氨酸发生酰胺反应以引入巯基，巯基之间可以形成二硫键，使得微球的结构更加稳定，在胃液中不易被降解。在肠道中，相互交联的氧化魔芋葡甘露聚糖之间的交联键断开，使得微球载体降解，释放其中的功能因子。并且，氧化魔芋葡甘露聚糖上的二硫键打开、伸展，接触肠粘液的面积增大，更容易与肠粘液层上的巯基发生置换反应，形成二硫键，以增强氧化魔芋葡甘露聚糖与肠粘液层的相互作用，粘附性能高，具有缓释效果，可充分释放其中的功能因子，持效性好，使得功能因子具有较高的生物利用率。
S110将氧化魔芋葡甘露聚糖溶解于水中
在该步骤中，将氧化魔芋葡甘露聚糖溶解于水中，以便获得水溶液。
S120活化处理
在该步骤中，将水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化处理，以便获得活化液。氧化魔芋葡甘露聚糖上的羧基需要经过活化处理之后才能发生酰胺反应。
根据本发明的实施例，基于1g氧化魔芋葡甘露聚糖，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为0.5～2g，半胱氨酸盐酸盐的用量为0.2～1g。由此，以便保证巯基含量为50～500μmol/g，使得微球载体在胃液中稳定性好，在肠粘液中可以降解，以便释放其中的功能因子。
根据本发明的实施例，活化时间为0.5～1.5小时。多糖上的羧基被充分活化，更有利于和半胱氨酸发生酰胺反应。
S130第一混合处理
在该步骤中，将活化液与半胱氨酸盐酸盐进行第一混合处理，以便获得第一混合液。
根据本发明的实施例，第一混合处理时间为12～36小时。由此，半胱氨酸和氧化多糖充分反应，有利于多糖连接上更多的半胱氨酸。
S140第二混合处理，过滤，收集沉淀
在该步骤中，将第一混合液与乙醇进行第二混合处理，过滤，收集沉淀，以便获得具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。
S200形成油包水乳液
在该步骤中，将水相溶液加入到油相溶液中，以便形成油包水乳液。
根据本发明的实施例，油相溶液选自含有span 80的石蜡油。由此，以便形成均匀的乳浊液。
S300通入空气
在该步骤中，向油包水乳液中通入空气，以便获得微球载体。含铁化合物中的Fe2+被空气中的氧气氧化为Fe3+，从而能够与羧基发生配位反应，交联固化，形成微球载体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对微球载体所描述的特征和优点，同样适用于该制备微球载体的方法，在此不再赘述。
包埋物
在本发明的又一方面，本发明提出了一种包埋物。根据本发明的实施例，包埋物包括：前面所述的微球载体；以及功能因子，功能因子包埋于微球载体上。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
根据本发明的实施例，微球载体上功能因子的包埋率为10～20％。如前所述，本发明的微球载体具有适宜的交联度，由此，能够提供足够的空间用于包埋，功能因子的包埋率高。
需要说明的是，本发明所使用的术语“包埋率”是指微球载体上包埋入功能因子的量占功能因子总量的百分比。例如，实施包埋处理所用的功能因子的重量为100g，制备得到的包埋物中微球载体包埋的功能因子的重量为10g，剩余90g并未包埋入微球载体上，那么功能因子的包埋率为10％。
根据本发明的实施例，功能因子呈亲水性。由于氧化魔芋葡甘露聚糖呈亲水性，所以需要功能因子也具备亲水性，由此，能够稳定地包埋于微球载体上。
根据本发明的实施例，功能因子包括药物。需要说明的是，本发明对于药物的种类不作严格限定，既可以是化学药物，也可以是生物药物，可以根据实际情况灵活选择。根据本发明的具体实施例，生物药物选自微生物、核酸和蛋白质的至少之一。根据本发明的具体实施例，功能因子还可以进一步包括示踪因子，例如使药物携带示踪因子，以便起到示踪效果。
根据本发明的实施例，核酸选自micro RNA，优选miRNA-27a。
micro RNA(简称miRNA)作为代谢过程中重要的中间介质，其失调会影响代谢系统的正常代谢，从而破坏生物基体内环境的稳态。其中，miRNA-27a(简称miR-27a)的表达将导致PPARc和C/EBPa(两种脂肪生成的主要调节剂)的表达被阻断。因此，miRNA-27a可被视作脂肪形成抑制剂，包埋有该核酸的微球载体能够起到抑制脂肪形成的效果。
根据本发明的实施例，蛋白质选自携带有miRNA-31的α-乳清蛋白。研究发现，miRNA-31(简称miR-31)有治疗结肠炎或结肠癌的效果。由于miRNA-31具有疏水性，无法直接包埋于亲水性的微球载体内，而α-乳清蛋白是呈亲水性的。因此，预先将miRNA-31包埋于α-乳清蛋白内，可以有效地克服疏水性的miRNA-31无法包埋于微球载体的缺陷，使得包埋有该蛋白质的微球载体起到治疗结肠炎或结肠癌的效果。
根据本发明的实施例，微生物为益生菌，优选乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和酪酸梭菌的至少之一。由此，包埋有上述微生物的微球载体在肠道内具有较好的定植效果，起到维持肠道菌群平衡作用。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对微球载体所描述的特征和优点，同样适用于该包埋物，在此不再赘述。
药物
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，该药物含有前面所述的包埋物。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对包埋物所描述的特征和优点，同样适用于该药物，在此不再赘述。
食品
在本发明的又一方面，本发明提出了一种食品。根据本发明的实施例，食品含有前面所述的包埋物。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，使包埋于微球载体上的功能因子具有较高的生物利用率。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对包埋物所描述的特征和优点，同样适用于该食品，在此不再赘述。
包埋物在制备药物或食品中的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述包埋物在制备药物或食品中的用途。根据本发明的实施例，功能因子为miRNA-27a，药物或食品用于抑制脂肪形成。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，可充分释放其中的miRNA-27a，使其具有较高的生物利用率，抑制脂肪形成的效果好。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对包埋物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
包埋物在制备药物或食品中的用途
在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述包埋物在制备药物或食品中的用途。根据本发明的实施例，功能因子为携带有miRNA-31的α-乳清蛋白，该药物或食品用于治疗结肠炎或结肠癌。如前所述，本发明的微球载体在胃液里的稳定性强，在肠道内的粘附性能高，可充分释放其中携带有miRNA-31的α-乳清蛋白，使其具有较高的生物利用率，治疗结肠炎或结肠癌的效果好。
术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病(例如预防结肠炎或结肠癌)或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述包埋物的药物给予有需要的个体。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对包埋物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在该实施例中，按照下列方法制备巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖OKGM-Cys：
称取3份100mg氧化魔芋葡甘露聚糖，分别溶于20mL超纯水中，待氧化葡甘露聚糖完全溶解之后，分别加入0.083g的EDC【1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐】活化1h，再分别加入0.038g半胱氨酸盐酸盐，在磁力搅拌器上室温反应24h，期间通入氮气除氧。
用等体积的乙醇将产物沉淀、过滤，用乙醇洗涤沉淀3次，除去EDC和未反应的半胱氨酸盐酸盐，得到沉淀OKGM-Cys。将沉淀用10mL超纯水复溶，室温条件下搅拌2h直至无可见的白色颗粒，可视为沉淀完全溶解。将复溶后的溶液置于-80℃的冰箱中冷冻过夜，然后真空冷冻干燥48h，并将冻干后的样品置于4℃下保存待用。
实施例2
在该实施例中，按照下列方法制备微球载体：
取50mg实施例1制备的巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖粉末与6mg七水合硫酸亚铁溶解在500微升的去离子水中，待粉末完全溶解后，将0.75g span 80溶解到20g石蜡油中，搅拌均匀。在温和条件下将水相逐渐加入到油相中以形成油包水乳液。35℃水浴条件下，将空气逐渐泵入乳液中，同时以500rpm的转速在磁力搅拌器下搅拌4h。4h后，在3000rpm，2min离心条件下，用正己烷洗涤微粒3次，用甲醇洗涤微粒3次。最后一步洗涤出来的微球沉淀溶于2mL pH 3的超纯水中，样品储存于4℃。
对比例1
按照实施例2的方法制备微球载体，区别在于，实施例1中，EDC用量为0.050g，半胱氨酸盐酸盐用量为0.023g。
对比例2
按照实施例2的方法制备微球载体，区别在于，实施例1中，EDC的用量为0.166g，半胱氨酸盐酸盐的用量为0.076g。
实施例3
将实施例2、对比例1和2所得到的微球载体在体外模拟肠胃液下的稳定性表征，具体步骤如下：
将1g胃蛋白酶溶于90mL超纯水中，用盐酸溶液将溶液pH值调至1.2，定容至100mL，即得到1％(w/v)的模拟胃液；取0.68g磷酸二氢钾，加入50mL的超纯水使之溶解，用0.5mol/L的氢氧化钠将溶液的pH值调至6.8，加入1g胰酶，定容至100mL，既得到1％(w/v)的模拟肠液。
取100μL上述制备的三种OKGM-Cys巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖微球分别加入400μL模拟胃液中，37℃水浴条件下消化30min；另取100μL上述制备的三种OKGM-Cys巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖微球分别加入400μL模拟肠液中，在37℃水浴条件下消化60min。用AxioVert.A1倒置式荧光显微镜观察微球在消化前后的形态变化。
实施例2的微球载体中巯基含量为315.8±11.2μmol/g，对比例1的微球载体中巯基含量为52.8±1.7μmol/g，对比例2的微球载体中巯基含量为443.7±49.9μmol/g，结果如图3所示。可以看出，巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖的巯基量越高，所制备的微球在胃液和肠液中的稳定性越高。这个结果也能过侧面表征微球上有二硫键形成。但是，由于巯基量为443.7±49.9μmol/g的巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖所制备的微球含有的二硫键过多导致其结构过于稳定，因此其在肠液中的稳定性太强，肠液消化1h后仍然存在完整的微球。因此优选巯基含量为315.8±11.2μmol/g的巯基化氧化魔芋葡甘露聚糖微球载体。
此外，通过图3的结果还可以观察到该微球的粒径分布在10～20μm左右。
实施例4
在该实施例中，制备包埋有miR-27a-Cy3的OKGM-Cys微球载体，具体步骤如下：
将50mg实施例1的巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖粉末与6mg七水合硫酸亚铁溶解在450μL的超纯水中，待粉末完全溶解后，加入50μL10μM的miR-27a-Cy3溶液。将0.75gspan 80溶解到20g石蜡油中，搅拌均匀。在温和条件下将水相逐渐加入到油相中以形成油包水乳液。35℃水浴条件下，将空气逐渐泵入乳液中，同时以500rpm的转速在磁力搅拌器下搅拌4h。4h后，在3000rpm，2min离心条件下，用正己烷洗涤微粒3次，用甲醇洗涤微粒3次。将最后一步洗涤出来的微球沉淀溶于2mL pH 3的超纯水中。因环境中存在大量的RNA酶，因此本次试验所使用的玻璃器具及转子等需用0.5M的氢氧化钠溶液浸泡过夜并用灭菌DEPC水冲洗，需使用无菌无酶枪头及离心管，且试验需要在超净工作台中进行。
样品储存于4℃的冰箱中，并在Axio Vert.A1倒置式荧光显微镜下观察微球的形态。用Cy3的荧光滤光片观察荧光场。
结果如图4所示，可以看出，miR-27a-Cy3已被成功包入OKGM-Cys微球载体中，包埋率为15.8±0.9％。通过图5表征的肠胃液稳定性实验结果可以看出，该微球在胃液中仍然能够稳定存在，但是在肠液中会完全破裂并释放出其中所包埋的miR-27a-Cy3。
根据图5所示的体外模拟胃肠液释放率的测定中可以看出，该微球在胃液中的30min内极缓慢地释放出miR-27a-Cy3，但是在进入肠液的15min内就将其中所包埋的miR-27a-Cy3全部释放出来。后续实验中释放率的下降可能是由于Cy3分子荧光猝灭。
该实验体外模拟了微球进入胃肠道内的消化过程并通过结果验证了该微球具有良好的pH响应特性，能够将其所包埋的物质在肠道中释放出来。
通过图6所示的肠道冰冻切片观察的结果可以看出，微球包埋组在1h至8h内肠道荧光强度大体上逐渐增强，且荧光在小肠绒毛内的分布随时间的延长越来越深入。另一方面，任意时间点的荧光强度均高于miR-27a-Cy3组。而miR-27a-Cy3组荧光强度一直都处于较低水平。
表1显示了高内涵成像分析系统对该肠道切片荧光总量的测定结果，灌胃1h时miR-27a-Cy3组的荧光强度非常微弱，而微球包埋组的荧光强度已经上升到一定程度，证明包埋组的miR-27a-Cy3率先进入小肠中端。在灌胃4h时，二者的荧光状态均达到峰值，说明在这个时间点miR-27a-Cy3在小肠绒毛上的富集量最大。
表1未经包埋的miR-27a-Cy3/经包埋的miR-27a-Cy3灌胃后的肠道切片荧光总量的测量结果
Figure BDA0001775426340000141
总之，从这个实验结果中可以看出：当灌胃相同量的miR-27a-Cy3时，微球组的荧光总量要高于未包埋的miR-27a-Cy3组的荧光总量，进而说明微球包埋组能有效提高miR-27a-Cy3在小肠绒毛中的富集。
实施例5
在该实施例中，按照下列方法制备微球载体：
配置若干支10mlMRS肉汤培养基及10ml的生理盐水，121℃灭菌15min。取-20℃保藏的菌株(导入pNZ11·Far RED质粒的NZ9000乳酸乳球菌)，无菌条件下，将1.5ml的EP管中的菌倒入10ml的MRS肉汤培养基中，并加入5微升10mg/ml的氯霉素。并在37℃恒温培养箱中培养48h。4200r/min，3min的离心条件下用生理盐水洗涤3次，并将最后一次洗得的菌泥溶于500微升的灭菌生理盐水中。将50mg实施例1制备的OKGM-Cys粉末与6mg七水合硫酸亚铁溶解在500微升的去离子水中。向上述溶液中加入100微升洗好的菌悬液。将0.75gspan80溶解到20g石蜡油中，搅拌均匀。在温和条件下将水相逐渐加入到油相中以形成油包水乳液。35℃水浴条件下，将空气逐渐泵入乳液中，同时以500rpm的转速温和地搅拌4h。4h后，3000rpm，2min离心条件下，用正己烷洗涤微粒3次，用甲醇洗涤微粒3次。在最后一个洗涤步骤之后，将包菌凝胶颗粒溶于pH＝3的超纯水中，4℃下储存。
实施例6
在该实施例中，体外模拟肠胃液消化验证实施例5制备的OKGM-Cys氧化魔芋包菌微球载体的pH响应特性，具体步骤如下：
将实施例5制备的OKGM-Cys氧化魔芋包菌微球在37℃水浴条件下用模拟胃液(1％w/v胃蛋白酶，pH＝3)消化30min、模拟肠液(1％w/v胰酶，0.68％w/v磷酸二氢钾，pH＝6.8)消化2h，用荧光显微镜观察微球的形态变化。图7中可以看出，该微球具有良好的胃肠液pH响应性。
实施例7
在该实施例中，体外模拟胃液-肠液连续消化OKGM-Cys氧化魔芋包菌微球过程并验证菌活力，具体步骤如下：
将实施例5的包菌氧化魔芋微球和未经过包埋的菌100微升分别加入模拟胃液800微升，37℃水浴条件下消化30min，掌式离心机下离心，弃上清加入1mL模拟肠液消化4h，掌式离心机下离心。超净工作台下，将1ml MRS肉汤培养基(含5mM氯霉素)加入上述菌泥，并吹吸多次使得菌泥分散。分别取这两组溶液200微升加入Bioscreen的灭菌100孔板中，并用Bioscreen全自动生长曲线测定仪在37℃培养60h测定培养基的OD600值，做出培养基在60h内的浊度变化曲线以表征经包埋/未经包埋的菌在胃液消化后的生存活力。一组三个平行样品，并用不接种的MRS肉汤培养基(含5mM氯霉素)做空白对照。
从图8可以看出：经60h的连续测定，OKGM-Cys氧化魔芋微球包埋的菌在培养基中浊度升高得幅度更大，据此可以证明：该氧化魔芋微球能够明显提高菌在胃液中的生存率。
实施例8
在该实施例中，体内表征OKGM-Cys氧化魔芋包菌微球的粘附性能，具体步骤如下：
购入20只6-8周龄SPF级BALB/C小鼠后喂养1周适应试验环境，自由进食和饮水。试验分别设空白生理盐水组、未经包埋的pNZ11·Far Red NZ9000菌组及经OKGM-Cys包埋的pNZ11·Far Red NZ9000菌组。未经包埋的pNZ11·Far Red NZ9000菌组及经OKGM-Cys包埋的pNZ11·Far Red NZ9000菌组分别灌胃8小鼠，于6h、24h、48h时解剖(一个时间段一组解剖2只)，刮去小鼠十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠黏液层，稀释适当倍数后MRS固体平板计数(含5mM氯霉素)，空白组灌胃2只老鼠作为空白对照，做出灌胃后的小鼠肠道各部位的乳酸乳球菌数目随时间的变化趋势图。并于68h时解剖剩余的未经包埋的pNZ11·Far RedNZ9000菌组及经OKGM-Cys包埋的pNZ11·Far Red NZ9000菌组的老鼠，制作空肠中端冰冻切片观察截面的荧光情况。
通过图9灌胃实验的结果可以看出：灌胃后48h内未经包埋的组和包埋组的肠道的乳酸乳球菌数目均逐步上升，并且在48h时，未经包埋的组和包埋组的盲肠内菌数均是最高的。更重要的是，该结果显示：包埋组的总菌数要明显高于未经包埋的总菌数。为了排除该实验出现假阳性结果，在平板上随机挑取10个菌落并在荧光显微镜下观察，均发现荧光，证明平板上的菌落均为pNZ11·Far Red NZ9000菌。
通过图10的结果可以看出：在68h后空肠中段的包菌组的粘液层上仍能观察到明显的荧光。而未经包埋的组的粘液层上的荧光非常微弱。由此，可推断出微球载体在肠道内具有粘附性，使得包埋于内的乳酸乳球菌在肠道内可长时间定植，增强其生物利用率。
实施例9
在该实施例中，为避免负载miR-31的蛋白纳米球在肠道中被快速降解，将该纳米粒子用微球载体包裹起来，并在结肠炎小鼠模型中通过灌肠将这些负载miR-31的微球载体施用于大肠，以验证该微球载体运载效果，具体步骤如下：
首先用精密分析天平准确称6mg的乳清蛋白溶于6mL的0.067M的PBS中，待样品充分溶解后，加入2.2μL蛋白水解酶，在涡旋振荡器上震荡均匀，于50℃水浴下加热30min后立即取出样品，置于冰箱冷藏层，30min后，取出样品超声30s，使其加速形成纳米球α-La PS。将miR-31-mimic通过静电吸附加载到α-La PS的表面，形成miR-31-PS颗粒。采用实施例4的方法将miR-31-PS颗粒包埋于OKGM-Cys微球载体中(即将实施例4的miR-27a-Cy3溶液替换为miR-31-PS溶液)，并且在结肠炎的小鼠模型中通过灌肠将这些负载miR-31的微球施用于大肠。给miR-31敲除的小鼠喂养了含有3.5％DSS饮用水，同时通过灌肠将OKGM-PS-miR-31微球灌入小鼠大肠内。最后，测试OKGM-PS-miR-31微球对WT小鼠中DSS诱导的结肠炎的治疗效果。
通过图11的结果可以看出，与OKGM-PS阴性对照相比，OKGM-PS-miR-31微球可消除结肠炎导致的结肠缩短状况。从图12的结果可以看出，OKGM-PS-miR-31微球处理的miR-31敲除小鼠的炎症得到了缓解。
在证明OKGM-PS-miR-31微球可以显著改善miR-31敲除小鼠中的DSS结肠炎相关表型之后，继续验证OKGM-PS-miR-31微球对WT小鼠中DSS诱导的结肠炎的治疗效果。从图13-16的结果可以看出，OKGM-PS-miR-31微球减轻了炎症并缓解了结肠上皮完整性的损害，具体体现在体重增加、免疫反应降低、结肠长度增加等。并且，Hippo信号传导途径在OKGM-PS-miR-31处理的结肠中被激活。而从图17的结果可以看出，miR-31的靶基因——Gp130，Gsk3，Lats2和Dlg1减少。总之，这些研究结果有力地证明以OKGM微球作为载体的OKGM-PS-miR-31微球是治疗溃疡性结肠炎的可行治疗方法。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种微球载体，其特征在于，包括具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖。
2.根据权利要求1所述的微球载体，其特征在于，部分所述巯基之间形成二硫键；
任选地，所述微球载体包括多个通过交联剂交联的所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，优选地，所述交联剂包括铁离子；
任选地，所述巯基修饰是通过使氧化魔芋葡甘露聚糖与半胱氨酸发生反应而获得的；
任选地，所述氧化魔芋葡甘露聚糖中巯基含量为50～500μmol/g，优选250～350μmol/g；
任选地，所述微球载体中铁离子含量为0.1～1mmol/g；
任选地，所述微球载体的粒径为10～20μm。
3.一种制备权利要求1或2所述微球载体的方法，其特征在于，包括：
将所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖与含铁化合物在水中进行混合，以便获得水相溶液；
将所述水相溶液加入到油相溶液中，以便形成油包水乳液；以及
向所述油包水乳液中通入空气，以便获得所述微球载体。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述含铁化合物选自硫酸亚铁、七水合硫酸亚铁和四水合氯化亚铁的至少之一；
任选地，所述油相溶液选自含有span 80的石蜡油；
任选地，基于1mg所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖，所述含铁化合物的用量为0.1～0.2mg；
任选地，所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖是通过下列方式获得的：
将氧化魔芋葡甘露聚糖溶解于水中，以便获得水溶液；
将所述水溶液与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐进行活化处理，以便获得活化液；
将所述活化液与半胱氨酸盐酸盐进行第一混合处理，以便获得第一混合液；以及
将所述第一混合液与乙醇进行第二混合处理，过滤，收集沉淀，以便获得所述具有巯基修饰的氧化魔芋葡甘露聚糖；
任选地，基于1g所述氧化魔芋葡甘露聚糖，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的用量为0.5～2g，所述半胱氨酸盐酸盐的用量为0.2～1g；
任选地，所述活化时间为0.5～1.5小时，所述第一混合处理时间为12～36小时。
5.一种包埋物，其特征在于，包括：
权利要求1或2所述微球载体；以及
功能因子，所述功能因子包埋于所述微球载体上。
6.根据权利要求5所述的包埋物，其特征在于，所述微球载体上所述功能因子的包埋率为10～20％；
任选地，所述功能因子呈亲水性；
任选地，所述功能因子包括药物；
任选地，所述药物包括微生物、核酸和蛋白质的至少之一；
任选地，所述核酸选自micro RNA，优选miRNA-27a；
任选地，所述蛋白质选自携带有miRNA-31的α-乳清蛋白；
任选地，所述微生物为益生菌，优选乳酸乳球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、酵母菌、枯草芽孢杆菌和酪酸梭菌的至少之一。
7.一种药物，其特征在于，含有权利要求5或6所述包埋物。
8.一种食品，其特征在于，含有权利要求5或6所述包埋物。
9.权利要求5或6所述包埋物在制备药物或食品中的用途，其特征在于，所述功能因子为miRNA-27a，所述药物或食品用于抑制脂肪形成。
10.权利要求5或6所述包埋物在制备药物或食品中的用途，其特征在于，所述功能因子为携带有miRNA-31的α-乳清蛋白，所述药物或食品用于治疗结肠炎或结肠癌。
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