KR101080577B1 - 활성성분의 결장 표적화 전달을 위한 제제 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마크로리드(marcolide)와 그 유도제를 불활성화시킬 수 있는 효소, 퀴놀론(quinolone)을 불활성화시킬 수 있는 효소 및 β-락타마아제를 포함하는 군으로부터 선택되는 활성물질의 결장(colon) 표적화 전달을 위하여 디자인된, 경구적 투여를 위한 다중입자형(multiparticular) 제제에 관한 것이다.

Description

활성성분의 결장 표적화 전달을 위한 제제{GALENIC FORM COLON-TARGETED DELIVERY OF ACTIVE INGREDIENTS}
본 발명은 결장(colon) 표적화 전달을 위한 제제, 이의 제조 방법 및 이의 치료적 용도에 관한 것이다.
결장에서의 특이적 방출 시스템은 상당한 치료적 이점을 갖는 것으로 증명되어 왔다.
다수의 결장 질병은 활성 성분이 국부적으로 방출되는 경우 더욱 효과적으로 치료될 수 있었다. 이것은 특히 크론병(Crohn's disease), 궤양성 대장염, 결장직장 암 및 변비에 대한 경우이다.
결장 표적화 방출은 또한 치료적 관점에서 흡수의 지연이 요구될 때, 특히 야간 천식 또는 앙고르(angor)와 같은 병의 치료에서, 관심의 대상이 될 수 있다(Kinget R. et al. (1998), Colonic Drug Targeting, Journal of Drug Targeting, 6, 129).
폴리펩티드 활성 성분의 투여는 거의 비경구로 이루어지는데, 이것은 고통스러우며 치료의 부실한 관찰의 근원이 된다. 최근 몇년간, 펩티드 활성 성분(진통제, 피임약, 백신, 인슐린 등)에 대한 흡수 부위으로서 결장을 사용하는 것이 관심 의 대상이 되어왔다. 결장에서의 펩티드의 흡수는, 특히 상피 결장 세포의 막과 관련된 펩티다아제 활성이 없어 소장에 비해 단백질 가수 분해 활성이 확실히 더 약한 것으로 인하여, 소화관의 다른 부분에서 보다 더 효과적인 것으로 보인다.
항생제의 경구 투여 동안, 이들은 위를 통과하고 이어서 소장에서 흡수되어 전체 조직에 확산되어 이들이 투여되었던 감염성 대상을 치료한다. 모든 경우에 동일하게, 섭취된 항생제(이것의 중요성은 각 항생제의 종류에 특이적인 특징에 따라 다양하다)의 일부는 흡수되지 않고 대변으로 제거되기 전에 결장으로 이동한다. 이들 잔류 항생제는 소장에서 흡수된 항생제의 일부에 의하여 재결합하지만, 이들은 담즙 제거의 방식에 의하여 소화관에서 재배출된다. 이 일부는 각 항생제의 대사 및 제거 경로의 함수로서 다양한 중요성을 갖는다. 마지막으로, 특정 항생제에 대하여, 흡수된 투여량의 일부는 소화관의 루멘 내의 장 점액질에 의하여 직접 제거된다. 항생제는 경구 또는 비경구로 투여되었기 때문에, 활성 잔류 부분은 일반적으로 결장에서 발견된다. 이것은 치료에 사용되는 대다수의 항생제 군에 대하여 정도는 다르지만 진실이며, 장 배출이 무시될 정도인 아미노-글리코사이드 군만이 주목할만한 예외이다. 다른 항생제에 대하여, 잔류 항생제 활성의 장 배출은 상이한 결과를 갖지만 모두 해롭다. 결과적으로, 결장에는 복잡하고(수백의 상이한 박테리아 종) 및 매우 밀집한(결장 면적의 그램당 1011 이상의 박테리아) 박테리아 생태계가 존재하며, 이것은 항생제의 활성 잔류물의 도달에 의하여 영향을 받을 것이다. 하기와 같은 사항이 관찰된다:
1) 때때로 항생제 섭취 이후 평범한 설사의 주요 원인이 될 수 있는 균무리(flora)의 불균형(Bartlett J. G. (2002) Clinical practice. Antibiotic associated diarrhea, New England Journal of Medicine, 346, 334). 이 설사가 일반적으로 심각하지 않고, 자발적으로 또는 치료가 중단되는 경우에 빠르게 완화된다고 할지라도, 그럼에도 불구하고 환자에게는 나쁘게 받아들여지고 항생제가 처방되었던 기본 질병에 불편함을 더한다;
2) 예컨대 살모넬라에 대한 소화 중독(alimentary intoxication)과 같은 감염의 위험을 증가시킬 수 있는, 외인성 박테리아에 의한 군체 형성에 대한 저항 기능의 혼란("배리어(barrier) 효과")(Holmberg S. D. et al. (1984) Drug resistant Salmonella from animals fed antimicrobials, New England Journal of Medicine, 311, 617);
3) 항생제 저항성인 미생물의 선별. 이것은 다양한 종류일 수 있다:
a) 이들은 우선 예컨대 가성막결장염(pseudomembranous)으로 알려진 강력한 대장염을 유발하는 독소를 분비할 수 있는 종인 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile)와 같은 병원성 박테리아일 수 있고(Bartlett J. G. (1997) Clostridium difficile infection: pathophysiology and diagnosis, Seminar in Gastrointestinal Disease, 8,12);
b) 이들은 또한 상대적으로 가벼운 병원성 미생물로, 그 증식이 주변 감염(질 캔디다증(vaginal candidosis) 또는 에스케리키아 콜라이(E. coli) 저항성 방광염)을 유도할 수 있는 미생물일 수도 있으며;
c) 이들은 마지막으로 비병원성 공생 저항성 박테리아로, 그 증식 및 배설물 제거가 환경에서의 확산을 증가시키는 박테리아일 수 있다. 이것 때문에, 이들 저항성 공생 박테리아는 병원성 종에 대한 저항성 메카니즘의 중요한 근원을 구성할 수 있다. 이 위험은, 인간에 대한 수많은 병원성 종들의 다중저항성(multiresistance)으로의 진화를 걱정하는 점의 관점에서, 현재 주요하게 고려된다.
따라서, 소화관의 다양한 생리학적 매개변수를 이용하는 수많은 병법이 결장에 활성 성분을 방출하는 관점으로 설계되어 왔다. 연구는 특히 (1) pH 변화에 민감한 폴리머의 이용, (2) 시간 의존적인 방출 형태, (3) 균무리에서 박테리아에 의해 분해가능한 프로드러그(prodrug) 또는 원래의 폴리머에 기초한 투여 시스템의 수단에 의하여 수행되어왔다.
(1) pH 변화에 기초한 시스템
위 내의 pH는 1 내지 3이지만, 이것은 소장 및 결장에서 증가하여 7에 근접한 값에 도달한다(Hovgaard L. et al. (1996) Current Applications of Polysaccharides in Colon Targeting, Critical Reviews in Theracanic Drug Carrier Systems, 13,185). 활성 성분이 이와 같은 pH의 변화를 겪지 않고 결장에 도달하도록 하기 위하여, pH 의존성, 즉 산 pH에서 불용성이지만 중성 또는 알칼리 pH에서 가용성인 폴리머로 코팅된 구상체(spheroid), 겔 또는 정제의 형태로 이것을 투여하는 것이 가능하다(Kinget et al. op cit). 가장 흔히 사용되는 폴리머는 메타크릴산의 유도체인 유드라짓(Eudragite) L 및 S이다(Ashford M. et al. (1993), An in vivo investigation into the suitability of pH-dependent polymers for colonic targeting, International Journal of Pharmaceutics, 95,193 and 95,241; 및 David A.et al. (1997) Acrylic polymers for colon-specific drug delivery,S. T. P. Pharma Sciences, 7, 546).
위장관 수준에서 pH 값의 중요한 개인별 및 개인내의 다양성으로 인하여 pH-의존성 폴리머는 결장에서의 특이적 방출을 얻기 위한 최선의 수단을 대표하지 않는다(Ashford M. et al., op cit.).
(2) 운반 시간에 따른 시스템
이들 시스템의 제제화는 이것이 미리 정해진 지연 시간 후에 활성 성분이 방출되도록 한다. 결장에서 활성 성분을 방출하기 위하여, 이들 형태는 여전히 위의 산 환경에 저항하여야 하고, 활성 성분을 방출하기 전에, 입으로부터 최종 회장(ileon)까지의 운반 시간에 상응하는 소정 시간의 무반응기(silent phase)로 들어가야 한다(Gazzaniga A. et al. (1995) Time-dependent oral delivery systems for colon targeting, S.T. P. Pharma Sciences, 5,83 and 108, 77; Liu P. et al. (1999) Alginate/Pectin/Poly-L-lysine particulate as a potential controlled release formulation, J. Pharm. Pharmacol., 51, 141; Pozzi F. et al. (1994) The Time Clock system: a new oral dosage form for fast and complete release of drug after predetermined lag time, Journal of Controlled Release, 31,99).
처러(Scherer)에 의한 펄신캅스(Pulsincaps®)는 이러한 종류의 최초 제제화의 하나이다(국제 특허 출원 WO90/09168). 이것은 몸체가 물에 불용성인 겔의 외관을 갖는다. 활성 성분은 수용성 겔의 헤드에 위치한 하이드로겔 스토퍼(hydrogel stopper)에 의하여 몸체 내에 유지된다. 전체는 위-저항성 필름(gastro-registant film)으로 코팅되어 있다. 소장에서 상기 헤드가 용해된 후 상기 스토퍼는 소화액과 접촉시 팽윤한다. 상기 스토퍼가 임계 팽윤 지점에 도달하면, 그것은 분출되어 활성 성분이 방출되도록 한다. 상기 분출 시간은 스토퍼를 구성하는 하이드로겔의 특성에 의하여 조절된다.
그럼에도 불구하고 운반 시간에 기초한 시스템은 다수의 단점(위가 비워지는 시간 및 운반 시간의 변화, 회맹판(ileocaecal valve)에서의 보유 현상(Kinget R., op. cit.)을 제공하여, 특이성을 결여시키고 결장에서의 특이적 방출 시스템으로서의 운반 시간에 기초한 시스템의 유효성을 막는다. 마지막으로, 이러한 종류의 시스템의 대규모 생산은 산업 기술의 비용적으로 상당한 개조를 필요로 하기 때문에 상상하기 어렵다.
최근에, 결장 표적화를 위한 신규한 형태가 "결장-표적화 전달 캡슐(Colon-targeted Delivery Capsule"(CTDC)로 개발되었다(Ishibashi T. et al. (1998) Design and evaluation of a new capsule-type dosage form for colon-targeted delivery of drugs, International Journal of Pharmaceutics, 168,31 and 57,45). CTDC는 pH 의존적 요소와 시간 의존적 요소를 함께 가져오는 시스템이다. 이것은 3층으로 피복된 활성 성분 및 유기산(숙신산)을 싸는 정통적인 겔의 형태이다.
(3) 미생물 결장 균무리의 효소 활성에 기초한 시스템
3.1. 프로드럭(Prodrug)
프로드럭은 대부분 다양한 활성 성분(항염증 비스테로이드성 및 스테로이드성, 진경성 등)의 결장 표적화를 위하여 연구되어왔다. 이들 시스템은 활성 성분의 활성 형태를 방출하기 위하여 프로드럭를 분해하기 위한 결장의 균무리에 의하여 생산된 효소의 능력에 기초한다.
특히 박테리아 아조환원효소(azoreductase)의 활동에 기초한 수많은 프로드럭은 크론병 또는 궤양성 결장염과 같은 국부적인 병의 치료에 사용되는 5-아미노살리실산(5-ASA)과 같은 활성 성분의 결장에서의 방출을 목적으로 개발되어왔다(Peppercorn M. A. et al. (1972) The role of intestinal bacteria in the metabolism of salicylazosulfapyridine, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 181, 555 and 64,240).
또 하나의 접근은 글리코시다제 및 폴리사카리다제와 같은 박테리아 가수분해효소를 이용하는 것으로 이루어진다(Friend D. R. (1995) Glycoside prodrugs: novel pharmacotherapy for colonic diseases, S. T. P. Pharma Sciences, 5, 70 Friend D. R. et al. (1984) A colon-specific drug-delivery system based on drug glycosides and the glycosidases of colonic bacteria, Journal of Medicinal Chemistry, 27, 261; Friend D. R. et al. (1985) Drug glycosides: potential prodrugs for colon-specific drug delivery, Journal of Medicinal Chemistry, 28, 51; and Friend D. R. et al. (1992) Drug glycosides in oral colon-specific drug delivery, Journal of Controlled Release,19, 109). 따라서, 프로드럭은 예컨대 스테로이드를 설탕(글루코스, 갈락토스, 셀로비오스(cellobiose), 덱스트란(국제 특허 출원 WO90/09168)), 시클로덱스트린에 커플링함으로써 개발되어 왔다(Hirayama F. et al. (1996) In vitro evaluation of Biphenylyl Acetic Acid-p-Cyclodextrin conjugates as colon-targeting prodrugs: drug release behavior in rat biological media, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 48, 27).
3.2. 박테리아 효소에 의한 생분해 가능한 폴리머에 의한 코팅
이 경우에 있어서, 결장 표적화는 약제학적 형태를, 아조환원효소 또는 박테리아 글리코시다제의 존재로부터, 미생물 균무리에 의하여 생산된 효소에 의하여 특이적으로 분해되는 폴리머로 코팅함으로써 수행된다.
아조방향족 링크를 비롯한 수많은 폴리머들은 활성성분을 코팅하기 위하여 사용되어왔다. 사프란 등의 문헌[Oral insulin in diabetic dogs, Journal of Endocrinology (1991), 131, 267] 및 [A new approach to the oral administration of insulin and other peptide drugs, Science (1986), 233, 1081]에는 아조방향족 결합에 의하여 링크된 스티렌과 히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA)의 공중합체로 코팅된 경구용 형태로부터 쥐 및 개의 결장에서의 인슐린 및 바소프레신의 방출이 기재되어 있다. 이 코팅은 활성 물질의 방출을 초래하는 박테리아 아조환원효소에 의하여 결장에서 분해된다.
아조폴리머의 이점은 이들이 활성 성분의 방출을 위한 매우 우수한 결장 선 택성을 제공한다는 점이다. 사용과 관련된 단점은 이들의 가능한 독성에 대한 정보 부족이다.
이 단점을 피하기 위하여, 다른 연구들이 폴리사카라이드와 같은 천연 물질에 기초한 코팅 필름, 특히 덱스트란 에스테르(Bauer K. H. et al. (1995) Novel pharmaceutical excipients for colon targeting, S. T. P. Pharma Sciences, 5,54) 또는 펙틴에 기초한, 아밀로스/에틸셀룰로스(Milojevic S. et al. (1996) Amylose as a coating for drug delivery to the colon: preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of Controlled Release, 38, 75)에 기초한 코팅 필름의 사용에 촛점을 맞추기 위해 선택되었다.
3.3. 박테리아 효소에 의하여 생분해 가능한 매트릭스
결장에서의 특이적 방출 시스템의 또 하나의 접근은 활성 성분과 생물분해가능한 폴리머, 예컨대 콘드로이틴 설페이트(chondroitin sulfate)(Rubinstein A. et al. (1992b) Chondroitin sulfate: a potential biodegradable carrier for colon-specific drug delivery, International Journal of Pharmaceutics, 84, 141 및 Rubinstein A. et al. (1992a) Colonic drug delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin matrix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, 9,276), 구아 고무(guar gum)(Krishnaiah Y. S. R. et al. (1998) Evaluation of guar gum as a compression coat for drug targeting to colon, International Journal of Pharmaceutics, 171,137), 키토산(Tozaki H. et al. (1997) Chitosan capsules for colon-specific drug delivery: improvement of insulin absorption from the rat colon, Journal of Pharmaceutical Sciences, 86,1016) 또는 펙틴(Rubinstein A. et al. (1993) In vitro evaluation of calcium pectinate: a potential colon-specific drug delivery carrier, Pharmaceutical Research, 10,258)의 혼합물의 압축에 의하여 매트릭스를 제조하는 것으로 이루어진다.
미생물 균무리의 효소 활성에 기초한 시스템은 아마도 활성 성분의 방출에 대해 가장 큰 결장 특이성을 갖는 것들일 것이다. 따라서, 이들은 결장 표적화를 위한 미래 경로를 형성한다.
결장의 투여를 위한 시스템의 제조에 있어서, 폴리사카라이드에의 관심은 이들이 천연 기원이고, 독성이 약하며, 결장 균무리의 박테리아 효소에 의하여 특이적으로 분해된다는 것이다.
따라서, 펙틴은 농업-영양 산업(아이스, 잼의 겔제(gelling agent) 또는 증점제(thickener) 등으로서) 및 약학 산업에서 널리 사용되는, 고등 식물의 세포벽으로부터 분리된 폴리사카라이드이다. 이것은 다분자(polymolecular) 및 다분산(polydisperse)이다. 이것의 조성물은 공급원, 추출 및 환경 요소의 상태에 따라 다양하다.
펙틴은 원래 직쇄의 α-1,4-(D)-갈락투론산(galacturonic acid)으로 구성되고, 때때로 람노스(rhamnose)의 단위로 산재한다. 갈락투론산의 카복실기는 부분적으로 에스테르화되어 메틸화된 펙틴을 제공할 수 있다. 2 종류의 펙틴이 이들의 메틸화 정도에 따라 구별된다(DM: 갈락투론산의 100 단위당 메톡시 그룹의 수):
- 메틸화 정도가 50 내지 80%로 다양한, 고도로 메틸화된 펙틴(HM: 고 메톡시). 이것은 물에 단지 약간 가용성이고 산 배지(pH<3.6)에서 또는 설탕의 존재하에 겔을 형성한다;
- 메틸화 정도가 25 내지 50%인 약간 메틸화된 펙틴(LM: 낮은 메톡시). HM 펙틴 보다 물에 더 가용성이고, 이것은 Ca2+ 이온과 같은 2가 양이온의 존재하에 겔을 제공한다. 사실, Ca2+ 이온은 갈락투론산이 없는 카복실화된 기들 사이에 "다리(bridges)"를 형성한다. 이렇게 형성된 네트워크는 에그-박스 모델(egg-box model)이라는 이름으로 그랜트 등의 문헌[Grant G. T. et al. (1973) Biological interactions between polysaccharides and divalent cations: the egg-box model, FEBS Letters, 32, 195]에 기재되어 있다.
또한, 아미드화된 펙틴이 있다. 메틸카복실레이트(-COOCH3)의 특정 기는 암모니아에 의한 펙틴의 처리에 의하여 카복사미드기(-CONH2)로 변형될 수 있다. 이 아미드화는 펙틴에 신규한 특성, 특히 pH 변화에 대한 향상된 저항성을 부여한다.
상기 펙틴은 고등 식물 및 인간 결장의 균무리의 박테리아를 비롯한 다양한 미생물(버섯, 박테리아 등)로부터 기원하는 효소에 의하여 분해된다. 미생물 균무리에 의하여 생산된 효소들은 폴리사카리다제(polysaccharidase), 글리코시다제 및 에스테라제로 구성된다.
이 제제(galenic form)는 압축을 통하여(Ashford M. et al. (1993b), An evaluation of pectin as a carrier for drug targeting to the colon, Journal of Controlled Release, 26, 213) 또는 분쇄를 통하여, 펙틴에 의하여 코팅된다. 압축에 의한 코팅은 일반적으로 펙틴만으로 이루어지는 반면, 분쇄에 의한 압축은 펙틴 이외에 필름형성(filmogenic) 폴리머의 사용이 요구된다(Milojevic S. et al.(1996) Amylose as a coating for drug delivery to the colon: preparation and in vitro evaluation using 5-aminosalicylic acid pellets, Journal of Controlled Release, 38, 75; Wakerly Z. et al. (1996) Pectin/ethycellulose film coating formulations for colonic drug delivery, Pharmaceutical Research, 13, 1210).
펙틴에 기초한 수많은 매트릭스 형태가 마찬가지로 연구되어 왔다. 이들은 일반적으로 순수한 펙틴 또는 이것의 Ca2+ 이온과의 복합체인 약간 수용성인 칼슘 펙티네이트에 의하여 구성된다. 인도메타신을 비롯한 칼슘 펙티네이트의 매트릭스는 특히 문헌[Rubinstein et al. (1992a) Colonic drug delivery: enhanced release of Indomethacin from cross-linked chondroitin matrix in rat cecal content, Pharmaceutical Research, 9, 276]에 기재되어 있으며, 이것은 소화액에서 단독의 펙틴 보다 칼슘 펙티네이트가 더 우수한 안정성을 나타내고, 펙틴 분해 효소(pectinolytic enzyme)의 활동에 대한 감응성이 유지됨을 나타낸다.
pH의 변화에 더 내성을 갖는 아미드화된 펙틴도 역시 결장 관찰을 위한 매트릭스 정제의 제조를 위하여 연구되었다(Wakerly Z. et al. (1997) Studies on amidated pectins as potential carriers in colonic drug delivery, Journal of Pharmacy and Pharmacologyl. 49, 622).
문헌[Aydin et al. (1996) Preparation and evaluation of pectin beads, International Journal of Pharmaceutics, 137,133]에서는 알기네이트 및 키토산의 비드(bead)가 기재되어 있는 문헌[Bodmeier et al. (1989) Preparation and evaluation of drug-containing chitosan beads, Drug Development and Industrial Pharmacy, 15, 1475 및 Spherical agglomerates of water-insoluble drugs, Journal of Pharmaceutical Sciences, 78, 964]에 따른 이온 겔화(gelification) 방법에 따라 펙틴 비드를 처음으로 제제화하였다. 이들의 목적은 펙틴과 가능한 상호 작용을 부여하기 위하여 비드 내에 2가지의 상이한 활성 성분, 양이온성(아테놀롤(atenolol)) 및 음이온성(피록시캄(piroxicam)) 활성 성분을 혼입하는 것이었다. 따라서, 이들은 2종류의 활성 성분을 갖는 비드를 형성할 수 있었고, 조작상 조건은 생성한 비드의 특성에 주요한 영향을 미친 것으로 나타났다.
시리아몬삭(Sriamornsak)은, 단백질 모델로서 분자량이 66400 Da인 소의 혈청 알부민(BSA)을 사용함에 의한, 결장에서 단백질의 특이적 방출을 위한 시스템을 제작하기 위하여, 칼슘 펙티네이트의 비드를 사용하였다(Sriamornsak P. (1998) Investigation on pectin as a carrier for oral delivery of proteins using calcium pectinate gel beads, International Journal of Pharmaceutics, 169, 213 및 (1999) Effect of calcium concentration, hardening agent and drying condition on release characteristics of oral proteins from calcium pectinate gel beads, European Journal of Pharmaceutical Sciences, 8,221). 그는 생성된 비드의 특성, 예컨대 이들의 형태, 이들의 크기, BSA의 캡슐화 비율 및 이들의 방출 동역학에 대한 제제화의 상이한 요소들의 영향을 연구하였다. 따라서, 시리아몬삭은 Ca의 펙티네이트 비드가 결장에서의 단백질의 특이적 방출에 이용될 수 있다는 것을 나타내었다. 적절한 방출 동역학 프로필을 얻는 것은 기초적으로 비드의 제조를 위한 조작 조건 및 제제화의 선택에 의존한다. 캡슐화된 활성 성분의 방출 프로필의 생체외/생체내 상관성은 성립되어 있지 않다.
소화관을 따라 입자의 안정성을 증가시키기 위하여, 그리고 캡슐화된 활성 성분의 임의의 미성숙 방출을 피하기 위하여, 양이온성 폴리머로 펙틴 비드를 망상화(reticulation)시킴으로써 펙틴 비드를 보강할 수 있다.
문헌[Munjeri et al. (1997) Hydrogel beads based on amidated pectins for colon-specific drug delivery: the role of chitosan in modifying drug release, Journal of Controlled Release, 46, 273]에서는 키토산으로 아미드화된 펙틴 비드를 망상화하였다. 이들은 망상화된 형태와 비망상화된 형태의 용해의 동역학을 비교함으로써, 키토산이 최소화된 불용성 활성 성분의 방출을 허용했으나, 수용성 활성 성분의 방출을 유의하게 변형시키지 않았다는 것을 나타냈다. 따라서, 위 및 소장의 것들과 필적하는 조건에서의 활성 성분의 손실은 키토산과 아미드화 펙틴 사이의 복합체의 형성에 의하여 제한될 수 있고; 망상화된 펙틴 비드는 여전히 결장의 펙틴 분해 효소의 활성에 감응성으로 남아 있다.
또 하나의 망상화제인 폴리라이신(polylysine)을 알기네이트/펙틴 비드의 존재하에 테스트하였다 (Liu P. et al. (1999) Alginate/Pectin/Poly-L-lysine particulate as a potential controlled release formulation, J. Pharm. Pharmacol., 51,141). 폴리라이신에 의하여 망상화된 비드는, 고도로 수용성인 활성 성분의 존재하인 경우를 제외하고는, 비망상화된 비드 보다 산 매질(HCl, 0.1 N)에서 더 적은 활성 성분을 방출하는 것으로 보인다. 동일한 종류의 효과가 알칼리 매질(포스페이트 버퍼, pH 7.5)에서 발견되었으나, 이것은 분명히 산 매질에서보다 명확히 덜 현저하였다.
국제 특허 출원 WO88/07865는 잔류 항생제를 가수분해시키기 위하여 결장에서 β-락타마아제(β-lactamase)를 생산하는 박테리아를 투여하는 것을 제안한다. 이용된 미생물은 엄격한 혐기성 대사를 하는 박테리아이며, 이것은 약물을 제조하기에 충분한 양으로 생산 및 감압동결건조하는 것이 어렵다. 또한, 이들은 β-락타마아제를 암호화하여 이들 유전자를 결장 생태계 내에 그리고 환경에 퍼지게 하는 위험을 일으키는 항생제에 저항성인 유전자의 캐리어이다.
국제 특허 출원 WO93/13795는 β-락타마아제를 함유하는 경구용 제제를 제안한다. 이것은 β-락타마아제 또는 아미다아제 및 임의로 트립신 억제제를 싸고 있는 직경 1 내지 2.5 mm의 사카로스 입자로서 위저항성 폴리머에 의하여 피복된 입자로 이루어질 수 있다. 이들 입자들은 소화관의 상이한 구획에서 효소를 잘 방출하여 이의 활성이 장 내 원하는 위치에서 필요한 만큼 일어난다.
어떠한 실시예도 제안된 제제가 소장 내 원하는 위치에서 효소를 활성 형태로 효과적으로 방출할 수 있다는 것을 나타내는 실험 데이터를 포함하지 않는다. 또한, 항생제를 효과적으로 가수분해하는 제제의 능력은 생체내에서도, 소장 매질의 특성을 재생한 실험실내 배지에서도 증명되지 않았다.
이러한 모든 이유로, 경구 또는 비경구 항생제 치료 후에 결장에 도달한 잔류 항생제의 양을 감소시키기 위한 또는 결장으로 직접 활성 성분을 전달할 수 있는 시스템을 사용하는 것이 매우 바람직하다.
따라서, 본 발명의 목적은 활성 성분을 결장 투여를 위하여 경구용으로 이용되는 다중 입자형(multiparticular) 제제이다.
본 발명의 관점에서, 활성 성분은 치료 또는 진단에 이용되기에 적합한 물질 또는 조성물을 의미하는 것으로 이해되며, 본 발명에 따른 제제로 혼입될 수 있다.
활성 성분은 항감염, 예컨대 항생제, 항염증제 화합물, 항히스타민제, 항콜린성제, 항바이러스제, 항유사분열제(antimitotics), 펩티드, 단백질, 유전자, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 진단제 및/또는 면역 억제제 또는 박테리아일 수 있다.
특히 유리한 활성 성분의 예는 항염증제, 항종양제, 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 결장에서 항생제를 불활성화시킬 수 있는 효소, 특히, β-락타마아제, 또는 예를 들어, 문헌[Andremont A. et al. (1985) Plasmid mediated susceptibility to intestinal microbial antagonisms in Escherichia coli Infect. Immun. 49 (3), 751]에 기재된 에리트로마이신 에스테라제와 같은 마크로리드(macrolide) 및 관련 물질을 불활성화시킬 수 있는 효소, 또는 문헌[Chen Y et al. (1997) Microbicidal models of soil metabolisms biotransformations of danofloxacin, Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 19,378]에 기재된 것들과 같은 퀴놀론을 불활성화시킬 수 있는 효소이다.
활성물질은 수용성 또는 지용성일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예에서 다중 입자형 제제는 경구적으로 이용하는 데 적합하고, 활성물질을 둘러싸는 양이온성 염의 형태의 펙틴 비드를 포함하는 활성물질의 결장 전달에 적합하고, 상기 펙틴은 양이온성 폴리머에 의해 망상화된다.
본 발명의 바람직한 실시예에서, 펙틴의 망상화를 가능하게 하는 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리라이신(polylysine), 키토산 및 이들의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
보다 바람직하게, 이들 양이온성 폴리머의 분자량은 10,000 내지 100,000 달톤, 바람직하게는 20,000 내지 50,000 달톤이다.
본 발명의 또 다른 실시예에서, 사용되는 양이온성 펙틴 염은 칼슘 펙티네이트이다.
본 발명의 관점에서, 또한, 펙틴은 메틸화 또는 비-메틸화, 아미드화(amidated) 또는 비아미드화된 펙틴을 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명에 따른 제제는 모든 경구 형태, 특히 겔 및 캡슐의 형태로 투여될 수 있다.
이러한 겔 및 캡슐은 다른 활성물질과 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있는데, 특히, 겔 또는 캡슐이 항생제를 불활성화시킬 수 있는 효소를 포함하는 경우 이들 겔 또는 캡슐은 대응하는 항생제의 제제와 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 제제를 함유하는 겔 및 캡슐과 함께 투여되는 활성물질은 경구적으로 또는 다른 방법을 통해 투여된다.
본 발명에 따른 제제는 전문가에 공지된 방법 또는 본 발명을 구성하는 것과 같은 신규한 공정에 의해 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 활성물질을 함유하는 펙틴 수용액을 염화칼슘 용액에 0.5 내지 5％(v/v)의 농도로 적하하여 첨가하여 칼슘 펙티네이트의 비드를 형성하고, 이어서, 얻어진 칼슘 펙티네이트를 회수하고, 양이온성 폴리머의 수용액에 도입하는 것을 특징으로 하는 다중입자형 제제의 제조공정을 제공하는 것이다.
본 발명의 공정의 바람직한 실시예에서, 펙틴 용액은 4 내지 10％ (m/v), 바람직하게는 4 내지 7％이고, 염화칼슘 용액은 2 내지 10％ (m/v)이고, 양이온성 폴리머의 용액은 0.5 내지 2％ (m/v)이고, 상기 양이온성 폴리머 용액은 바람직하게는 폴리에틸렌이민의 용액이다.
본 발명의 더욱 바람직한 실시예에서, 본 제제는, 6％(m/v)의 펙틴 용액, 6％(m/v)의 염화칼슘 용액 및 1％ 또는 0.6％의 폴리에틸렌이민의 용액으로부터 제조된다.
비드는 염화칼슘내에서 10분 내지 1시간 동안, 바람직하게는 20 분간 천천히 교반하면서 유지된다.
양이온성 폴리머에 의한 망상화 단계는 15 내지 40분간, 바람직하게는 20분간 천천히 교반하면서 수행된다.
펙티네이트 비드를 회수한 후, 20℃ 내지 40℃의 온도에서 30분 내지 10시간 동안, 바람직하게는 37℃에서 2시간 동안 건조시킨다.
본 발명에 따른 입자의 직경은 800 내지 1500 ㎛, 바람직하게는 1000 내지 1200 ㎛이다.
캡슐화 수율은, 펙틴이 아미드화되거나 또는 비아미드화된 경우에, 벤질페니실린 기질에 대해 표현되는 활성으로 β-락타마아제의 경우 50 내지 90％ 또는 3-6 UI/비드이다.
위장액 내에서의 안정성은 10시간 이상이고, 그 안정성이 7시간 이상(비-망상화 펙틴비드의 안정성 지속기간은 1시간을 초과하지 않는다)이기 때문에 소장 매질 USP XXIV내에서의 안정성도 매우 우수하고, 이는 이용되는 펙틴의 타입에 무관하다.
다음의 실시예 1 내지 7 및 도 1 내지 8를 통해 본 발명을 설명한다.
도 1은 PBS, 0.01 M, pH 7.4; pH 6.8의 소장매질 + 0.1 UPS XXIV; pH 1.1의 위장액 UPS XXIV의 3개의 상이한 매질에 놓여진 아미드화 펙틴 비드의 분해시간에 대한, PEI의 상이한 농도(0.6; 0.7; 0.8; 0.9 및 1%)에서의 망상화 효과를 보여준다.
도 2는 4.4 UI/비드의 비율로 β-락타마아제를 함유하고, 1% PEI내에서 20분간 망상화되고, 주사전자현미경으로 관찰한 비드의 구조를 보여준다.
도 3은 0.6 내지 0.7%의 PEI 농도로 실시예 1에 따라 제조되고, 약 5 UI/비드를 함유하고, 소장 매질 USP XXIV와 이어서 결장 매질(HEPES 버퍼 pH 6 + 펙틴분해 효소)에 놓여진 망상화된 아미드화 펙틴 비드로부터의 생체외 β-락타마아제의 방출을 보여준다.
도 4는 실시예 1에 따라 제조되고 4.4 UI/비드를 함유하는 PEI내에서의 망상화 펙틴 비드의 경구 투여후의, 시간의 함수로서 마우스의 대변에서의 β-락타마아제의 방출을 보여준다.
도 5는 생체내 투여후 30분에서의 4.4 UI/비드 비율의 β-락타마아제를 함유하는 비드의 구조를 보여준다. 이어서 비드는 위장내에 있다. A 및 B는 전체 비드를 나타내고, C 및 D는 절단된 비드를 나타낸다.
도 6은 생체내 투여후 2시간에서의 4.4 UI/비드 비율의 β-락타마아제를 함유하는 비드의 구조를 보여준다. 이어서 비드는 소장내에 있다. A 및 B는 전체 비드를 나타내고, C 및 D는 절단된 비드를 나타낸다.
도 7은 생체내 투여후 4시간에서의 4.4 UI/비드 비율의 β-락타마아제를 함유하는 비드의 구조를 보여준다. 이어서 비드는 결장내에 있다. A 및 B는 전체 비드를 나타내고, C 및 D는 절단된 비드를 나타낸다.
도 8은 펙틴 비드내에서 유리 또는 양이온성 리피드(리포플렉스, Lipoplexe) 또는 양이온성 폴리머(폴리플렉스, Polyplexe)와 복합화된 플라스미드 DNA의 캡슐화를 보여준다.
실시예 1 : 제제의 제조
6%의 펙틴 수용액(400 또는 OG175C Unipectint by Degussa)을 6%(m/v) 염화칼슘 용액에 적하하여 도입하였다. 펙틴용액은 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump, Microperpexe LKB Bromma)에 연결된 티곤 파이핑(Tygon piping)을 통해 염화칼슘 용액으로 도입하였다. 직경 0.8mm(21G, Nedus Terumo)의 바늘을 통해 통과하는 용액은 펙틴의 방울을 형성하고, 염화칼슘(40ml)와 접촉함과 동시에 겔화되어 칼슘 펙티네이트의 비드를 형성하였다. 비드는 염화칼슘내에서 20분간 천천히 교반하여 유지하였다.
활성성분(β-락타마아제)을 함유하지 않는 백색 비드는 6%의 아미드화(OG 175C) 또는 비-아미드화(OF 400) 펙틴 용액으로부터 출발하여 얻었다.
로드된 비드를 제조하기 위해서, 활성성분(시그마에 의해 제공되는, β-락타마아제, 바실러스 세레우스로부터 추출한 타입 A의 페니실리나아제)을 3%(Vpa/Vpectin)의 비율로 펙틴용액과 함께 혼합하였다.
이어서, 형성된 칼슘 펙티네이트의 비드를 여과하여 회수하고, 증류수로 세정하고, 페트리 디쉬상에 두고, 37℃에서 2시간 동안 화로에서 건조하였다.
폴리에틸렌이민에서의 망상화를 위해서, 여과에 의해 염화칼슘 용액으로부터 회수한, 건조되지 않은 비드를 1%의 폴리에틸렌이민(PEI)의 수용액으로 도입시키고 천천히 교반하면서 20분 동안 유지하였다.
비-아미드화 펙틴 OF400으로부터 제조된 비드는 1 내지 2.5 UI/비드를 포함하고 아미드화 펙틴 OG175C로부터 제조한 비드는 1 내지 5 UI/비드를 포함하였다.
실시예 2 : 비드의 안정성
1. 조작방법
망상화 단계를 포함하거나 또는 망상화 단계 없이 실시예 1에 의해 비드를 제조하였다; 0.6 내지 1% 범위 농도의 용액에서 PEI내에서의 망상화 기간은 20분이다.
비드는 포스페이트 버퍼(PBS, O.01M, pH 7.4) 또는 소화액을 자극하는 매질(위장 및 소장 USP XXIV)내에 두었고, 분해(disaggregation)되는 시간을 관찰하였다.
2. 결과
이는 도 1에 주어진다.
망상화되거나, 망상화되지 않은 비드는 PBS 및 위장 매질에서 안정하다. 그러나, 비-망상화된 비드는 소장 매질 내에서 불안정한 반면, 본 발명에 따른 비드는 7시간에 걸쳐 안정하다.
실시예 3 : 비드의 형태적 특징
이들은 도 2A 내지 2D에 설명되어 있다.
절단면은 비드의 중심이 꽉 차고 조밀하다는 것을 보여준다. 표면 껍질은 PEI에 해당한다. 내부와 외부는 상이한 구조를 보여준다.
실시예 4 : 생체외 방출 동역학
1. 조작 방법
실시예 1에 따라 아미드화 펙틴 및 5 UI/비드를 함유하는 PEI의 두개의 상이한 농도(0.6% 및 0.7%)에서 망상화시킨 비드를 제조하였다. 이들을 pH 6.8의 소장 매질 USP XXIV 에서 5시간 동안 두었다. 이어서, 펙틴분해 효소(Pectinex Ultra SPL)을 함유하는 pH 6에서의 합성 결장 매질에 도입하였다.
비드내의 잔여 β-락타마아제 활성을 니트로세핀(nitrocephine)의 존재하에서 광분석기를 통해 시간에 걸쳐 측정하였다.
2. 결과
이들은 도 3에 설명하였다.
소장 매질내에서의 5시간의 비드 인큐베이션 후에(T5H) 이들이 포함하고 있는 β-락타마아제의 25%미만이 방출되었다. 방출은, 0.6% PEI로 망상화된 비드에 대하여, 펙틴분해 효소(Tien)의 작용하에 결장 매질내에서는 중요하고, 반면에 펙틴분해 효소가 없는 샘플(T10H 대조군)은 β-락타마아제 활성의 중요한 변형을 가져오지는 않았다. 이와는 반대로, 0.7% PEI로 망상화된 비드는 결장 매질에서 5H후에 이들의 활성을 감소하게 하지 않았다.
따라서, PEI의 농도는 비드의 내성을 변형시키고, 결장 매질내에서의 활성성분의 방출시간에 중요한 역할을 한다.
실시예 5 : 생체내에서의 방출 동역학
1. 조작방법
이 분석법은 수컷 마우스 CD1에 대하여 수행하였다. 비드는 4 UI/비드를 포 함하였다.
10개의 비드를 포함하는 겔을 마우스에 투여하였다. 대변을 0, 2H, 3H, 4H, 5H, 6H, 7H 및 8H 시간 간격으로 회수하였고, 대변내의 β-락타마아제의 양을 측정하였다.(분석은 각 시간에 대해 5마리의 동물에 대하여 수행하였다) 또한, 30분, 2H, 4H의 시간에서 한 마리의 마우스를 희생시켜, 소화관내에서의 비드를 회수하였고, 주사전자현미경에 의해 이들의 형태적 변형을 관찰하였다.
2. 결과
이들은 도 4 내지 도 7에 나타내었다.
비드는 약 3시간의 전달 후에 결장에 도착하였다.
비드를 경구적으로 흡수한 후 상이한 시간에서 수집한 마우스의 대변에서 직접적으로 방출된 β-락타마아제의 비율은 기초적 β-락타마아제 활성이 초기에는 낮다는 것을 보여준다. 투여후 2 내지 4시간에는 이의 활성이 비드의 전달에 대응하여 뚜렷이 증가하였다. (도 4)
주사 전자현미경으로 찍은 사진은 소화관의 상이한 지점에서 비드의 보전된 모습을 보여준다.
구조는 소장내에서 약간 무른 모습이고, 내부는 결장 수준에서 완전히 파괴되고, 여기에서 비드는 구멍을 가진 것처럼 보인다.
도 5에 나타내는 바와 같이, 위에서 머물고 있는 입자는 어떠한 처리도 행해지지 않은 것과 매우 유사하게 보인다(도 2). 효과상으로, 폴리에틸렌이민의 존재에 기인하여, 표면은 동일하게, 울퉁불퉁하고 불규칙한 모양(도 5 A 및 5 B)을 가지고, 비드의 단면은 균일하고 조밀하게 보인다(도 5 C 및 5 D).
2h의 말기에서 비드의 약간의 변형이 분명하게 나타나고(도 6 A), 소장에 체류함으로써 약간 무르게 되었지만(도 6 D), 입자는 여전히 동일한 표면 외관(도 6 B)및 조밀한 단면(도 6 C)을 갖는다.
통과가 종결되면, 즉 투여후 4h, 비드는 결장 내에 있고; 입자의 외부 모습은 폴리에틸렌이민에 기인한 동일한 표면 불규칙성을 가져(도 7 B) 변화가 없다(도 7 A). 그러나, 비드의 단면은, 결장 펙틴 분해효소에 의한 칼슘펙티네이트의 중앙 네트워크가 붕괴된다는 사실에 의해 빈 공동이다(도 7 C 및 7 D). 마지막으로, 폴리에틸렌이민에 의해 형성된 외부 껍질만이 남아있다.
실시예 6 : 에리트로마이신 에스터라아제의 캡슐화
6. 1. 에리트로마이신 에스터라아제를 함유하는 수용성 분획의 제조
6. 1. 1. 조작방법
배양은 파스퇴르 연구소의 E. coli C600 pIP1100 균주로부터 제조하였다. 배양조건은 다음과 같다. 20시간 예비 배양으로부터 0.5%의 뮬러-힌톤(Mueller-Hinton) 배지에 접종하고, 얼렌마이어(Erlenmeyer)내에서 200 내지 400 mL의 배양 부피로, 150rpm에서 고정 교반하면서, 37℃의 온도에서 배양하였다.
GOTS 테스트는 많은 에리트로마이신 에스터라아제를 생산하는 균주를 확립하는데 도움을 주었다.
E. coli C600 pIP1100 균주를 3.6 L 배양하고 다음의 프로토콜을 따라 농축시켰다.
ㆍ 3400g 에서 15분간 원심분리
ㆍ 포타슘 포스페이트 버퍼 5mM, pH 7.5, 최종부피 70mL 에서 캡을 회수
ㆍ 상등액을 3400g에서 15분간 2차 원심분리
ㆍ 포타슘 포스페이트 버퍼 5mM, pH 7.5의 20mL 에서 캡을 회수
ㆍ 2개의 원심분리 캡을 합침(약 100mL)
ㆍ 캡을 세정하고 원심분리(12,000g에서 10분간)
ㆍ 상등액의 2차 원심분리(12,000g에서 10분간)
ㆍ 포타슘 포스페이트 버퍼내에서 회수된 캡의 최종 부피 : 100mL
에리트로마이신 에스터라아제는 세포내 효소이다. 이 때문에 이를 용해시키기 위해서는 세포를 파괴시켜야 한다. 이러한 조작은 아래에 기재한 프로토콜에 따라 포타슘 포스페이트 버퍼 5mM, pH 7.5에서 회수된 원심분리 캡을 초음파 추출함으로써 수행하였다.
ㆍ 1% 트리톤 X 100 (v/v)을 첨가
ㆍ 5℃까지 냉각
ㆍ 1분간의 포노라이시스(phonolysis) 7 사이클, 최초온도 5℃, 최대온도 15℃, 파워: 100% (500W, 20 kHz); 각 사이클후 온도 5℃로 취함.
ㆍ 12,000g에서 10분간 원심분리
ㆍ 포타슘 포스페이트 버퍼 5mM, pH 7.5의 10mL에서 캡을 회수
ㆍ 상등액(91 mL)를 회수하고 응고시킴 = 용액 A
전문가에게 공지된 방법에 따라 상등액과 불용성 물질(세포 부스러기)내에서의 미생물적 용량에 의한 에리트로마이신 에스터라아제 활성을 평가하였다.
6. 1. 2. 결과
결과를 표 2에 표시한다.
(표 2)
샘플 억제 직경(mm)
T0 T30 T60 T120
초음파후의
상등액		 31 25 18 -
21 - 18 14
초음파후의
캡(Cap)		 30 28 24 -
22.5 - 19.5 19
에리트로마이신 에스터라아제 활성은 억제 직경으로부터 평가되었다.
후자는 포노라이시스 상등액에 대하여 2 U/mL이고, 포노라이시스 캡에 대하여 1.5 U/mL이다(1 Unit(U) = 1분당 분해되는 1 ㎍의 에리트로마이신)
에리트로마이신 에스터라아제 활성의 회복의 균형은 다음의 표 3에 표시한다.
(표 3)
샘플 평가된
활성(U/mL)		 부피(mL) 총 평가 활성
(U)
초음파후의
상등액		 2.0 92 184
초음파후의
캡		 1.5 10 15
결과는, 존재하는 에리트로마이신 에스터라아제 활성에서의 필수요소가, 포노라이시스 매질내에 용해되었다는 것을 분명히 보여준다.
6.2 에리트로마이신 에스터라아제의 캡슐화
6.2.1. 조작방법
캡슐화는 다음의 프로토콜에 따라 세포를 분쇄한 후 얻어진 정제하지 않은 가용성 분획(용액 A)로부터 달성하였다.
ㆍ 펙틴 5%의 최종농도를 얻기 위해서 10mL 용액 A내의 펙틴 0.5g을 용해시켰다(용액 B). pH의 갑작스런 변동을 일으키지 않도록 하기 위해서 자석 교반을 하면서 펙틴을 매우 점진적으로 첨가하였다. pH는 1M 소다를 몇 방울 첨가하여 7 부근에서 유지하였다.
ㆍ 6% 염화칼슘 40mL에 페리스탈틱 펌프에 의해 적하방식으로 펙틴용액(용액 B)를 분산시켰다. 이렇게 형성된 비드는 20분간 염화칼슘내에서 유지되었고, 뷰흐너 여과로 회수하였고, 이어서, 광물을 제거한 물로 세정하였다.
ㆍ 자석교반을 하면서 20분간 0.6%의 PEI 용액내에서 담가서 비드를 망상화시켰다.
ㆍ 여과에 의해 망상화된 비드를 회수하였다.
ㆍ 주위온도(20℃)에서 비드를 건조시켰다. 6.1mL의 펙틴/용액 A 혼합물에서 12.2 U 활성의 총 567개의 비드를 제조하였다.
ㆍ 버퍼 HEPES/NaCl/EDTA 1% 에서 건조비드를 분해시켰다.
6.2.2. 결과
펙틴의 최초 용액내에 존재하고 분해된 매질내에서 방출된 에리트로마이신 에스터라아제 활성을 상기의 프로토콜과 동일하게 측정하였다.
미생물적 양의 결과는 표 4 및 표 5에 나타낸다.
표 4
샘플 평균억제직경(mm)
펙틴/용액A
(용액B)-T0 		23
펙틴/용액 A-T3h 19
분해된 비드 - T0 24
분해된 비드 - T3h 18
표 5
샘플 평가된 활성
펙틴(용액 B) 2.4
분해된 비드 2.4
결과는 펙틴의 존재하에서(용액 B) 측정된 활성은 2.4 U 임을 나타내고, 반면에 포노라이시스 상등액내에서의 에리트로마이신 에스터라아제의 양에 따르면(표 3), 존재하는 이론적 활성은 약 12U 이어야 한다 (2U/mL의 6.1 mL).
분해된 후의 비드의 효소활성의 양은 2.2 U으로 측정되었다; 이는 비드로 도입된 최초 활성의 90%를 나타태는 것이다.
이들 결과는 효소의 캡슐화후의 최후 분획 및 비드의 분해로 에리트로마이신 에스터라아제의 활성이 존재한다는 것을 명백히 입증한다.
실시예 7 : 칼슘 펙티네이트 비드에서의 DNA의 캡슐화
7.1 DNA의 제조
여기에서 캡슐화되는 활성성분은 포스포어 33(Phosphore 33)으로 방사능 표지된 플라스미드이다. 방사능 표지는 아머샴 바이오사이언스(Amersham Biosciences)로부터의 Nick Translation Kit N5500에 의해 제공자에 의한 프로토콜에 따라 수행하였다.
7.2 캡슐화
7.2.1. 조작방법
DNA의 캡슐화는 실시예 1에 기술된 조작 방법에 따라, 유리, 양이온 리피드(리포플렉스, Lipoplexe) 또는 양이온 폴리머(폴리플렉스, Polyplexe)의 복합체 형태로 행하였다.
유리 DNA에 대하여는, 5%의 최종 펙틴 농도를 얻기 위해서, 750㎕의 MilliQ 물내에서 용액에서 방사능 표지된 DNA 약 5 ㎍을, 아미드화되거나 아미드화되지 않은 10% 0.75g의 펙틴용액으로 도입하였다. 리포플렉스의 경우, 375㎕의 방사능 표지된 DNA의 수용액을, 375㎕의 양이온 리포좀(10의 N/P 비율)의 현탁액과 혼합하였다.
5%의 펙틴 최종농도를 얻기 위해, 이어서, 750㎕의 생성된 리포플렉스를 10%의 펙틴용액 0.75g과 혼합하였다.
폴리플렉스의 경우, 375㎕의 방사능 표지된 DNA의 수용액을 PEI 4mM의 수용액 375㎕와 혼합하였다. 이어서, 이렇게 얻어진 375㎕의 폴리플렉스 현탁액을 최종 농도 5%의 펙틴을 제공하기 위해 10%의 펙틴 용액 0.75g과 혼합하였다.
이어서, 유리(free) 또는 복합 DNA를 캡슐화하는 칼슘 펙티네이트의 비드를 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 상기에서 얻어진 용액으로부터 제조하였다.
여기에서 이용된 염화칼슘의 농도는 5%이고, PEI의 농도는 0.6%이다.
7.2.2. 결과
이들 결과는, 아미드화 또는 비-아미드화 펙틴 비드에서 플라스미드 DNA의 캡슐화 수율을 보여주는 도 8에 나타내었다.
캡슐화된 DNA는 유리 또는 양이온성 리피드(리포플렉스) 또는 양이온성 폴리머(폴리플렉스)내의 복합체의 형태이다.
DNA의 캡슐화 수율은 사용되는 펙틴의 타입에 따라 60 내지 90%에서 변화한다. 이들은 일반적으로 아미드화 펙틴에서 더욱 유의하였다. 리피드 또는 양이온성 폴리머와의 복합화는 비교적 높은 채인 이러한 수율로의 유의한 변형을 일으키지 않는다.

Claims (15)

  1. i)β-락타마아제 및 ii) 에리트로마이신 에스터라아제(erythromycin esterase)를 포함하는 군으로부터 선택되는 활성작용제의 경구투여 및 결장방출(colonic release)을 위한 다중입자형 제제(multiparticular dosage form).
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 활성작용제를 둘러싸는 양이온성 염 형태의 펙틴 비드(beads of pectin)을 포함하고, 상기 펙틴은 양이온성 폴리머에 의해 망상화된(reticulated) 다중입자형 제제.
  4. 제3항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine), 폴리라이신(polylysine), 키토산 및 이들의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택되는 다중입자형 제제.
  5. 제3항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머는 10,000 - 100,000 달톤의 분자량을 갖는 다중입자형 제제.
  6. 제5항에 있어서, 상기 양이온성 폴리머는 20,000 - 50,000 달톤의 분자량을 갖는 다중입자형 제제.
  7. 제3항에 있어서, 상기 펙틴염은 아미드화(amidated) 또는 비 아미드화(non amidated) 펙틴으로부터 제조된 칼슘 펙티네이트인 다중입자형 제제.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 기재된 경구투여 및 결장전달용 다중입자형 제제를 제조하기 위한 방법으로서,
    a) i)β-락타마아제 및 ii) 에리트로마이신 에스터라아제(erythromycin esterase)를 포함하는 군에서 선택되는 활성 작용제를 포함하는 펙틴용액을 제조하는 단계;
    b) 상기 펙틴용액을 염화칼슘용액에 첨가하여 양이온적으로 가교된 펙틴 비드를 형성하는 단계; 및
    c) 폴리에틸렌이민 용액으로 상기 펙틴 비드를 망상화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    a) 4 - 10％(m/v)의 펙틴용액을 제조하는 단계;
    b) 상기 펙틴용액을 2 - 10％(m/v)의 염화칼슘용액에 첨가하여 양이온적으로 가교된 펙틴 비드를 형성하는 단계; 및
    c) 0.5 - 2％(m/v)의 폴리에틸렌이민 용액으로 상기 펙틴 비드를 망상화시키는 단계를 포함하는, 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 펙틴 용액은 4 - 7％(m/v) 용액인, 방법
  11. 제9항에 있어서,
    상기 펙틴용액은 6％의 펙틴용액이고, 상기 염화칼슘용액은 6％의 염화칼슘용액이고, 상기 폴리에틸렌이민 용액은 1％ 또는 0.6％의 폴리에틸렌이민 용액인,방법.
  12. 제8항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 활성 작용제의 경구투여 및 결장방출을 위한 다중입자형 제제.
  13. 제9항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 활성 작용제의 경구투여 및 결장방출을 위한 다중입자형 제제.
  14. 제10항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 활성 작용제의 경구투여 및 결장방출을 위한 다중입자형 제제.
  15. 제11항에 기재된 방법에 의해 얻어지는, 활성 작용제의 경구투여 및 결장방출을 위한 다중입자형 제제.
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