CN113208115A - 一种益生菌微胶囊及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种益生菌微胶囊及其制备方法，属于微胶囊技术领域。所述制备方法，包括如下步骤：分别制备多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、填充固体油脂的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、乙酰化的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、去除固体油脂的多孔淀粉‑聚乙烯亚胺载体、吸附益生菌的多孔淀粉菌泥，采用生物聚电解质对上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥进行包埋，得层层自组装的益生菌微胶囊。本发明所得益生菌微胶囊，可显著提高益生菌的存活率。
Description
技术领域
本发明属于微胶囊技术领域，尤其涉及一种益生菌微胶囊及其制备方法。
背景技术
益生菌是一类对人体有益的活性微生物，具有调节宿主肠道菌群平衡，促进肠道营养物质吸收的作用，一直以来，人们致力于将益生菌与食品结合，制备含有益生菌的功能性食品、保健食品等。例如，将益生菌添加到酸奶，乳饮料，奶粉，面包以及饼干等制品中，制备含有益生菌的菌粉，胶囊等。但一些不利因素(例如温度、加工条件、消化道中的胃酸、胆盐等)都会对益生菌的活性造成损失，从而降低其在宿主体内的保健功效。
为了保证足量的活菌定植于肠道(美国FDA推荐食品中活性益生菌的添加量最低限为106CFU/g或106CFU/ml)，研究人员将益生菌微胶囊化，通过将益生菌包埋到更大的基质中，减少与有害环境的接触，从而有效提高了益生菌的活性。常用的益生菌微胶囊化方法包括喷雾干燥法、乳化法、挤压法和凝胶技术等，然而，这些方法仍存在益生菌存活率欠佳的问题。
发明内容
本发明提出一种益生菌微胶囊及其制备方法，首先，利用聚乙烯亚胺等对多孔淀粉进行接枝改性，得到内部孔隙带上大量正电荷，外部不带电的多孔淀粉。然后，带负电的益生菌通过静电相互作用吸附到多孔淀粉的微孔结构里面。最后，生物聚电解质通过静电相互作用自发地逐层吸附到含有益生菌的多孔淀粉的内表面。
本发明提出一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
1)向多孔淀粉中加入缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃～50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺，二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的水溶液，40℃～50℃乳化，加入脂肪酶，40～50℃反应10～20min，离心，产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
5)将上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体置于菌悬液中，震荡，离心，收集沉淀，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥；
6)采用生物聚电解质对上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥进行包埋，得层层自组装的益生菌微胶囊。
进一步地，步骤1)中，所述淀粉包括玉米淀粉、木薯淀粉，大米淀粉，甘薯淀粉，马铃薯淀粉中至少一种；
步骤1)中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的质量比为1～3：1；
步骤1)中，恒温振荡为30～50℃震荡8～16h。
进一步地，步骤(2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1～4：0.32～0.6；
步骤2)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基三聚乙醇磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠中至少一种；
步骤(2)、步骤(4)中，所述乳化具体为：用分散机14000r/min乳化3min后，取出并水浴保温5min，再次乳化，如此重复至少3次。
进一步地，步骤3)中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例0.2～1.5g：2～10ml：10～50ml：1～5ml；
步骤3)中，反应的时间为20～26h；
步骤3)中，反应的温度为20～35℃。
进一步地，步骤5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液；所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml；
步骤5)中，去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、菌悬液的比例为1～3g：20ml～50ml。
进一步地，所述步骤6)中，所述生物聚电解质包括带正电的生物聚电解质、带负电的生物聚电解质；
优选的，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖；
优选的，带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖中至少一种。
进一步地，所述步骤6)中，具体为：将上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥置于带正电或带负电的聚电解质溶液中，搅拌，完成第一层吸附，洗涤，离心，收集沉淀；再将完成第一层吸附的沉淀置于与第一层吸附使用的聚电解质带相反电荷的聚电解质溶液中，搅拌，完成第二层吸附，离心，洗涤；重复上述吸附，得至少2层层层自组装的益生菌微胶囊。
进一步地，所述层层自组装的益生菌微胶囊的层数为2～12层；
优选的，所述层层自组装的益生菌微胶囊的层数为4～6层。
进一步地，还包括：对步骤6)所得益生菌微胶囊进行干燥，得干燥化的益生菌微胶囊。
本发明还提出一种益生菌微胶囊，包括上述任一制备方法制备得到的益生菌微胶囊。
本发明具有以下优势：
本发明提出的益生菌微胶囊的制备方法，以多孔淀粉为载体，通过引入聚乙烯亚胺、油脂以及乙酰化改性、去油脂等，使得多孔淀粉内部带正电，外部不带电，此结构将益生菌有效的包裹在微胶囊内部，可显著提高益生菌的存活率。同时，利用生物聚电解质与益生菌之间的静电相互作用，形成包埋吸附的多层保护结构，延长了微胶囊在胃肠道中的消解时间，进一步提高了益生菌在肠道输送和定植存活的效率。
附图说明
构成本发明的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为本发明实施例1、对比例1、对比例2不同包埋过程中益生菌在存储时的存活情况；
图2为本发明实施例1、对比例1、对比例2不同包埋过程中益生菌在模拟胃液中的存活情况；
图3为本发明实施例1、对比例1、对比例2不同包埋过程中益生菌先在模拟胃液中消化2h，之后又移到模拟肠液中继续消化2h后的存活情况；
图4是本发明实施例1中所得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的外表面以及所得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的外表面的ZETA电位。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本申请发明人发现，由于益生菌带负电，若多孔淀粉内外部均带正电，部分益生菌会被吸附到多孔淀粉的内部孔隙中，部分停留在其表面，被吸附到内部孔隙的益生菌可得到较好保护，但停留在外表面的益生菌却不能避免胃肠道中胃酸、胆盐的侵蚀，不能存活下来。因此，发明人提出一种仅在多孔淀粉内部包埋益生菌的结构，以有效提高益生菌的存活率。
本发明一实施例提出一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
1)向多孔淀粉中加入磷酸盐缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃～50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺，二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，将产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的溶液，40℃～50℃乳化，加入脂肪酶，40～50℃反应10～20min，离心，产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
5)将上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体置于菌悬液中，震荡，离心，收集沉淀，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥；
6)采用生物聚电解质对上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥进行包埋，得层层自组装的益生菌微胶囊。
本发明实施例提出的益生菌微胶囊的制备方法，首先，采用聚乙烯亚胺接枝多孔淀粉，使多孔淀粉内外表面均带上大量正电荷(NH4 +)。然后，根据固态油脂的熔点特性，在多孔淀粉内部填充油脂后，再用三乙胺等对聚乙烯亚胺进行乙酰化修饰，中和多孔淀粉外表面的大量正电荷(NH4 +)，降低多孔淀粉外表面的氨基正电性，使得仅多孔淀粉内表面带大量正电荷。紧接着，采用脂肪酶去除固体油脂，得内表面带正电的多孔淀粉。由于益生菌表面带负电，利用静电相互作用，可使更多的益生菌吸附到内表面带正电的多孔淀粉结构内部，大大提高了益生菌的存活率。最后，在吸附益生菌的多孔淀粉菌泥上吸附生物聚电解质，利用生物聚电解质之间的静电相互作用，形成包埋吸附的多层保护结构，延长了微胶囊在胃肠道中的消解时间，有效改善了益生菌在肠道输送和定植存活的效率，提高了其在食品、医药领域的商业应用价值。
本发明实施例中，步骤1)制备采用聚乙烯亚胺对多孔淀粉进行改性，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体，使得多孔淀粉的内外表面均带正电。
本发明实施例中，步骤1)中，所述多孔淀粉由包括如下步骤制备而得：将淀粉、磷酸氢二钠和柠檬酸缓冲液的混合溶液、甲苯混合，加入酶解液，40℃恒温振荡24h，离心后，沉淀在60℃常压干燥，粉碎，得多孔淀粉。其中，所述酶解液中的酶为α-淀粉酶，糖化酶按照质量比为1:4组成的复合酶。
具体而言，所述淀粉包括玉米淀粉、大米淀粉、木薯淀粉、甘薯淀粉等。本发明实施例中，优先选用了多孔淀粉作为益生菌的包埋材料。多孔淀粉是变性淀粉的一种，来源广泛，安全无毒，具有类似蜂窝煤状的多孔结构，表面疏松多孔，可提高核心材料的粘附性和吸附性，具有良好的生物相容性和合适的孔径大小。此外，淀粉对胰淀粉酶具有抗性，在人体内被缓慢消化，且对肠道微生物群落和人体健康有益。
具体而言，步骤1)中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的比例为1～3:1。
具体而言，步骤1)中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的pH为8.0。
具体而言，步骤1)中，恒温振荡为30～50℃震荡8～16h。
具体而言，步骤1)中，多孔淀粉、磷酸盐缓冲液的添加量为1g：100mL。
本发明实施例中，步骤2)中，根据油脂熔点的高低，采用油脂填充步骤1)所得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
本发明一实施例中，步骤(2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1～4：0.32～0.6。
具体而言，步骤2)中，固体油脂通常是指动物油脂，例如，羊油，猪油，牛油，黄油等。
其中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基三聚乙醇磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠中至少一种。乳化剂主要用于乳化固体油脂，制备乳状液。乳化剂以溶液的形式添加，例如，聚乙烯醇可以以质量分数为4％聚乙烯醇(PVA)水溶液形式添加10～15ml，即实际聚乙烯醇的质量为0.32～0.6g。
具体而言，步骤2)中，所述乳化具体为：用分散机14000r/min乳化3min后，取出并水浴保温5min，再次乳化，如此重复至少3次。
具体而言，步骤2)中，冷却至室温，例如，可以为0～30℃，优选5～10℃。
具体而言，步骤2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、乳化剂的添加量为1～2g:8～15ml。
本发明实施例中，步骤3)中，对填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体进行乙酰化处理，中和掉多孔淀粉外表面的大量正电荷(NH4 +)，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
具体而言，步骤3)中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例为0.2～1.5g：2～10ml：10～50ml：1～5ml。
具体而言，步骤3)中，反应的时间为20～26h；反应的温度为20～35℃。
具体而言，步骤3)中，所述透析具体为：先用磷酸盐缓冲液透析3次，每次用4L磷酸盐缓冲液，再用蒸馏水透析3次，每次4L蒸馏水。
具体而言，步骤3)中，填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液为其溶解在生理盐水中形成的溶液。
本发明实施例中，步骤4)中，采用脂肪酶去除固体油脂，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的。
具体而言，步骤4)中，所述乳化包括：用分散机14000r/min乳化3min后，取出并水浴保温5min，再次乳化，如此重复至少3次，乳化剂用量为8～15ml 4％聚乙烯醇水溶液。
具体而言，步骤(4)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基三聚乙醇磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠中至少一种。乳化剂主要用于乳化固体油脂，制备乳状液。乳化剂主要以溶液的形式添加，例如，聚乙烯醇可以以质量分数为4％聚乙烯醇水溶液形式。
具体而言，步骤(4)中，乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、乳化剂、脂肪酶的质量比为1.0g：0.32～0.6g：0.1～1mg。
具体而言，步骤4)中，保温的时间为5min。
具体而言，步骤4)中，乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液为其溶解在生理盐水中形成的溶液。
本发明实施例中，步骤5)中，由于益生菌表面带负电，利用静电相互作用，使更多的益生菌吸附到内表面带正电的多孔淀粉结构内部，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥。
本发明一实施例，步骤5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液。所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
优选的，所述菌悬液由包括如下步骤制备：将益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，离心，收集菌体，洗涤，重悬于生理盐水，得浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml的菌悬液。
具体而言，步骤5)中，去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、菌悬液的比例为1～3g：20ml～50ml。
本发明一实施例中，步骤6)中，在吸附益生菌的多孔淀粉菌泥上吸附生物聚电解质，利用生物聚电解质之间的静电相互作用，形成层层包埋吸附的多层保护结构，即益生菌微胶囊。
所述生物聚电解质包括带正电的生物聚电解质、带负电的生物聚电解质、两性生物聚电解质。优选的，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖。优选的，带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖。另外，所述生物聚电解质还可以包括两性生物聚电解质，如乳清蛋白、明胶等。任何带电的聚电解质，包括多糖、蛋白质等大分子都可以作为包埋壁材。
所述步骤6)中，具体为：将上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥置于带正电或带负电的聚电解质溶液中，搅拌，完成第一层吸附，洗涤，离心，收集沉淀；再将完成第一层吸附的菌泥置于与第一层吸附使用的聚电解质带相反电荷的聚电解质溶液中，搅拌，完成第二层吸附，离心，洗涤；重复上述吸附，得到至少2层层层自组装的益生菌微胶囊。
聚电解质溶液可以为壳聚糖溶液或果胶溶液。优选的，壳聚糖溶液的浓度可以为0.5mg/ml～2.5mg/ml，pH值为5.6。果胶溶液的浓度可以为0.5mg/ml～2.5mg/ml，pH值为5.6。
优选的，所述层层自组装的益生菌微胶囊的层数为4-12层。更优选的，层层自组装的益生菌微胶囊的层数为4～6层。本发明中壁材包埋层数优先选择4层和6层，层数并不仅仅局限于4层和6层，可根据实际情况稍作调整。
本发明所采用的层层自组装技术是通过静电相互作用使阴阳离子聚电解质交替吸附在模板上，形成想要的厚度、成分、物理化学功能的多层膜。该制备工艺简单高效、囊壁更为结实，包封更全面，因在益生菌吸附到多孔淀粉内部以后，又增加了层层组装的保护，这使益生菌更容易抵抗外部胃酸或胆盐的侵蚀。
本发明一实施例中，还包括：对步骤6)所得益生菌微胶囊进行干燥，得干燥化的益生菌微胶囊。所述干燥包括喷雾干燥或者冷冻干燥。
本发明一实施例还提出一种益生菌微胶囊，包括上述任一制备方法制备得到的层层自组装的益生菌微胶囊。
本发明一实施例还提出一种海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊的制备方法，还包括步骤7)，采用内源乳化法将海藻酸钠包埋在步骤6)所得层层自组装的益生菌微胶囊的外表面。与外源乳化法相比，内源乳化法采用难溶性钙盐作为钙源，克服了外源乳化法中氯化钙溶液加入引起的微胶囊成簇凝聚现象，使得微胶囊粒径易于控制，可形成粒径更小的微胶囊，经海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊，颗粒粒径比较均一、表面更光滑、呈球性更佳，故粒径分布窄、微胶囊形态好、抗逆能力强。
具体地，所述步骤7)具体包括，将1.8g海藻酸钠和0.45g CaCO3粉末加入45mL水中形成悬浊液，搅拌均匀，配制含海藻酸钠和CaCO3的混合液，溶胀；
将步骤6)中所得层层自组装的益生菌微胶囊与上述所得45mL混合溶液按照体积比1∶(1-5)混合均匀，加入到225mL大豆油中，搅拌，形成油包水液滴后，加入到200μL冰醋酸，搅拌，固液分离，得海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊。
其中，所述大豆油含1wt％的Span80。
本发明一实施例还提出一种利用上述制备方法制备得到的海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊。
下面将结合实施例详细阐述本发明。
实施例1一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔淀粉的制备：2g生淀粉加入到250ml三角瓶中，加入pH 4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸缓冲液，40ml，加入0.1ml甲苯，加入适当稀释酶液，40℃，恒温振荡24h，离心分离上清液，沉淀在60℃下常压干燥，粉碎即可。
(2)多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体制备：准确称取2.0g的玉米多孔淀粉，放于烧杯中，为了平衡载体，加入200mL的磷酸盐缓冲液(pH8.0)，放1h，然后向其中加入1.0g的聚乙烯亚胺，40℃恒温振荡10h，反应完成后用pH8.0的缓冲液冲洗，直到滤液无三硝基苯磺酸反应(TNBS)。用蒸馏水洗涤，最后对载体进行干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(3)填充固体油脂：将(2)制得的1.0g多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和1g固体油脂混合，加入10m L 4％聚乙烯醇(PVA)溶液,在50℃水浴保温5min，用高速分散机14000r/min乳化3min后取出并水浴保温5min,再次乳化,如此重复3次后离心(4000r,10min)，冷却至5℃，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(4)聚乙烯亚胺乙酰化：将(3)中1.2g填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在100ml生理盐水中(pH8.0)，加入2ml三乙胺，10ml二甲亚砜，放在磁力搅拌器上充分搅拌30min,然后再逐滴加入1.41ml乙酸酐，该反应在室温下反应24h，最后将反应溶剂二甲亚砜，过量的反应物以及反应副产物通过透析法除去，即先用PBS磷酸盐缓冲液透析3次，每次4L，再用蒸馏水透析3次，每次4L，最后将产物的水溶液冷冻干燥，此时多孔淀粉的外表面聚乙烯亚胺已经被乙酰化，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(5)去除固体油脂：将(4)得1.0g乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在生理盐水中(pH8.0)中，加入10m L 4％聚乙烯醇(PVA)溶液,50℃水浴保温5min,用高速分散机14000r/min乳化3min，加入1mg脂肪酶40℃处理15min。离心，将产物的水溶液冷冻干燥，此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(6)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min离心10min收集菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(7)生物聚电解质溶液的制备：称取200mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得到浓度为1mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；称取200mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得到浓度为1mg/ml的果胶溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(8)将2.0g步骤(5)所得改性后的多孔淀粉置于50ml步骤(6)的菌悬液中，摇床震荡(180g，2h，37℃)，使益生菌在多孔淀粉的孔径结构中被均匀吸附，1000r/min离心5min收集沉淀，将上清液排出，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥。
(9)将(8)中吸附益生菌的多孔淀粉菌泥先与果胶溶液(pH5.6)(2％w/v)混合，在磁力搅拌器上搅拌(800r/min速度)直至溶解完全，离心，弃去上清液，得初湿胶囊。
(10)将步骤(9)中的初湿胶囊置于30ml，1mg/ml壳聚糖溶液中，温和搅拌30min，完成第一层吸附，离心(4000s,10min)，用NaCl溶液洗涤两次。
(11)再将步骤(10)中处理后的初湿胶囊置于30ml，1mg/ml果胶溶液中，温和搅拌30min，完成第二层吸附，离心(4000s，10min)，用NaCl溶液洗涤两次。
(12)重复以上两个步骤，直到组装完成6层层层自组装的益生菌微囊。离心(4000s,10min)，弃去多余电解质，得包埋好的层层自组装的益生菌微胶囊。
(13)将(12)层层自组装的益生菌微胶囊溶液以5mL/min的速度通过喷雾干燥机进行干燥，边喷边搅拌，进口温度为170℃，出口温度为80℃，计算得率、益生菌存活率。喷雾干燥结束后，立即收集制备得到的微胶囊粉末于无菌密封玻璃瓶中，并储存于4℃保藏。
实施例2一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
同实施例1，不同之处在于，步骤(12)：重复以上两个步骤，直到组装完成4层层层自组装的益生菌微囊。
实施例3一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
同实施例1，不同之处在于，步骤(9)～(12)，先采用壳聚糖进行吸附，再采用果胶进行吸附；具体为：
(9)将吸附有益生菌的微孔淀粉先与壳聚糖溶液(pH5.6)(2％w/v)混合，在磁力搅拌器上搅拌(800r/min速度)直至溶解完全。离心，弃去上清液，得初湿胶囊。
(10)再将步骤(9)中得初湿胶囊置于30ml，1.5mg/ml果胶溶液中，温和搅拌30min,完成第一层吸附，离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，用NaCl溶液洗涤两次。
(11)再将步骤(10)中菌泥置于30ml，1.5mg/ml壳聚糖溶液中，温和搅拌30min,完成第二层吸附，离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，用NaCl溶液洗涤两次。
(12)重复以上两个步骤，直到完成预定组装层数的层层自组装益生菌微胶囊。离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，得到包埋好的益生菌微胶囊。
实施例4一种益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)多孔淀粉的制备：2g生淀粉加入到250ml三角瓶中，加入pH4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸缓冲液，40ml，滴入0.1ml甲苯，加入适当稀释酶液，40℃，恒温振荡24h，离心分离上清液，沉淀在60℃下常压干燥，粉碎即可。
(2)多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体制备：准确称取2.0g的玉米多孔淀粉，放于烧杯中，为了平衡载体，加入200mL的磷酸盐缓冲液(pH8.0)，放1h，然后向其中加入1.0g的聚乙烯亚胺，50℃恒温振荡10h，反应完成后用pH8.0的缓冲液冲洗，直到滤液无三硝基苯磺酸反应(TNBS)。用蒸馏水洗涤，最后对载体进行干燥，制得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(3)填充固体油脂：将(2)制得l.0g的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和1g固体油脂混合，加入10m L 4％聚乙烯醇(PVA)溶液,在45℃水浴保温5min，用高速分散机14000r/min乳化3min后取出并水浴保温5min,再次乳化,如此重复3次后离心(4000r,10min)，冷却至10℃，获得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(4)聚乙烯亚胺乙酰化：将(3)1.2g中填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在100ml生理盐水中(pH8.0)，加入2ml三乙胺，10ml二甲亚砜，放在磁力搅拌器上充分搅拌30min,然后再逐滴加入1.41ml乙酸酐，该反应在室温下反应24h，最后将反应溶剂二甲亚砜，过量的反应物以及反应副产物通过透析法除去，即先用PBS磷酸盐缓冲液透析3次，每次4L，再用蒸馏水透析3次，每次4L，最后将产物的水溶液冷冻干燥，此时多孔淀粉的外表面聚乙烯亚胺已经被乙酰化，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(5)去除固体油脂：将(4)得1.0g乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体溶解在生理盐水中(pH8.0)中，加入10m L 4％聚乙烯醇(PVA)溶液,45℃水浴保温5min,用高速分散机14000r/min乳化3min，加入1mg脂肪酶45℃处理20min。离心，将产物的水溶液冷冻干燥，此时得到的多孔淀粉粉末，内部带上了大量的氨基，而外部是不带电的，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体。
(6)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min离心10min收集菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(7)生物聚电解质溶液的制备：称取300mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；称取300mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的果胶溶液，pH用0.15MNaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(8)将2.0g步骤(5)所得改性后的多孔淀粉置于50ml步骤(6)的菌悬液中，摇床震荡(180g,2h，37℃)，使益生菌微胶囊在多孔淀粉的孔径结构中被均匀吸附，1000r/min离心5min收集沉淀，将上清液排出，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥。
(9)将吸附有益生菌的微孔淀粉先与壳聚糖溶液(pH5.6)(2％w/v)混合，在磁力搅拌器上搅拌(800r/min速度)直至溶解完全。离心，弃去上清液，得初湿胶囊。
(10)再将步骤(9)中得初湿胶囊置于30ml，1.5mg/ml果胶溶液中，温和搅拌30min,完成第一层吸附，离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，用NaCl溶液洗涤两次。
(11)再将步骤(10)中菌泥置于30ml，1.5mg/ml壳聚糖溶液中，温和搅拌30min,完成第二层吸附，离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，用NaCl溶液洗涤两次。
(12)重复以上两个步骤，直到完成预定组装层数的层层自组装益生菌微胶囊，离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，得到包埋好的益生菌微胶囊。
(13)将得到的益生菌微胶囊沉淀物置于无菌培养皿中，在冰柜中(-20℃)预冷4h，然后冷冻干燥24h，微囊收集在10ml无菌试管中，并于4℃下冷藏保存。
实施例5一种海藻酸钠包裹的益生菌微胶囊的制备方法，包括如下步骤：
(1)～(12)同实施例1；
(13)将1.8g海藻酸钠和0.45g CaCO3粉末加入45mL水中形成悬浊液，搅拌均匀，配制含海藻酸钠和CaCO3的混合液，溶胀；将步骤(12)中层层自组装制得的益生菌微胶囊与配制的混合溶液(45mL)按照体积比1∶2混合均匀后；加入到225mL大豆油中(含1％的Span80)，机械搅拌形成油包水液滴后，加入到200μL冰醋酸继续搅拌，固液分离得到微胶囊。
对比例1一种益生菌微胶囊的制备方法
多孔淀粉的制备、菌悬液的制备同实施例1，然后直接制备经多孔淀粉包埋后的益生菌胶囊。具体包括如下步骤：
(1)多孔淀粉的制备:2g生淀粉加入到250ml三角瓶中，加入pH 4.6的0.2mol/L磷酸氢二钠和0.1mol/L柠檬酸缓冲液，40ml，加入0.1ml甲苯，加入适当稀释酶液，40℃，恒温振荡24h，离心分离上清液，沉淀在60℃下常压干燥，粉碎即可。
(2)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min离心10min收集菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(3)将(1)所得2.0g多孔淀粉置于50ml步骤(2)的菌悬液中，摇床震荡(180g，2h，37℃)，使益生菌在多孔淀粉的孔径结构中被均匀吸附，1000r/min离心5min收集沉淀，将上清液排出，得经多孔淀粉包埋后的益生菌胶囊。
对比例2一种益生菌微胶囊的制备方法
多孔淀粉的制备、菌悬液的制备同实施例1，然后直接制备经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊。具体包括如下步骤：
(1)制备聚电解质溶液：称取300mg壳聚糖溶解于200ml 0.15M醋酸溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的壳聚糖溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；称取300mg果胶溶液溶解于200ml 0.15M NaCl溶液中，得到浓度为1.5mg/ml的果胶溶液，pH用0.15M NaOH和0.15M HCl调整到5.6；两种聚电解质溶液均在高压蒸汽灭菌锅中120℃条件下高温灭菌20min。
(2)制备菌悬液：益生菌接种于灭菌的MRS液体培养基中，37℃摇床培养20h，4000r/min离心10min收集菌体用无菌生理盐水(0.9％NaCl)洗涤两次，重悬制成菌悬液用于后续的包埋实验，浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml。
(3)将菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml壳聚糖溶液中，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，使壳聚糖聚电解质分子充分吸附在益生菌的表面，完成第一层吸附后，离心(3500s，15min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(4)再将步骤(3)中菌悬液在无菌条件下，置于30ml，1.5mg/ml果胶溶液中，pH调整到5.6，摇床震荡(180rpm，37℃，30min)，完成第二层吸附，离心(3500s，10min)，弃去多余电解质，用0.15M NaCl溶液洗涤两次。
(5)重复以上两个步骤，直到完成预定组装层数的层层自组装益生菌微胶囊。离心(3500s,15min)，弃去多余电解质，得到包埋好的益生菌微胶囊。
试验例1益生菌微胶囊储存稳定性测试
准确称取未进行包埋的益生菌样品、对比例1所得经多孔淀粉包埋后的益生菌胶囊、对比例2所得经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊以及实施例1中经多孔淀粉和多层自组装复合包埋的益生菌微囊以及实施例5海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊所得各3g，置于25℃下恒温保存，分别在0、5、10、15、20、25周之后取出计算其活菌数。保存不同时间之后的益生菌存活率如图1所示。
由图1可得，未经包埋的益生菌很快全部死亡，经过多孔淀粉和6层层层自组装包埋的益生菌存活率虽然提高，但是已比初始浓度低了许多，本发明中结合改性的多孔淀粉和层层自组装技术制得的益生菌微胶囊其储存稳定性有了明显的提高，在储存25周之后存活率仍能达到7～8log CFU/ml，外表面包埋海藻酸钠的益生菌微胶囊活性进一步提升。
试验例2益生菌微胶囊对人工模拟胃肠液的耐受性
(1)人工模拟胃液实验
准确称取未进行包埋的益生菌样品、对比例1所得经多孔淀粉包埋后的益生菌胶囊、对比例2所得经过层层自组装6层包埋后的益生菌微胶囊以及实施例1所得经多孔淀粉和多层自组装复合包埋的益生菌微囊各0.1g的益生菌微胶囊、实施例5所得海藻酸钠包裹的层层自组装益生菌微胶囊添加至9.9mL的模拟胃液中，并不断震荡混匀，在培养时间分别为20、40、60、80、100、120min时，从中取出1mL的溶液立即添加进9mL的磷酸盐缓冲溶液中，并在37℃下搅拌震荡1h，使益生菌微胶囊充分解聚，随后通过梯度稀释，使用螺旋平板接种仪接种到MRS培养板中进行计数。结果见图2。
由图2可得，未经包埋的益生菌在模拟胃液中很快全部死亡，多孔淀粉包埋后的益生菌存活率下降了8个log，6层包埋后的益生菌存活率下降了2.5个log，而多孔淀粉与层层组装复合包埋的益生菌存活了仅下降了1个log，外表面包埋海藻酸钠的益生菌微胶囊存活下降了不到1个log，说明本发明方法制备的益生菌胶囊具有很好的耐胃酸特性。
(2)人工模拟肠液实验
在进行上述模拟胃液的处理以后，紧接着在120min的模拟胃液培养后，使用1M的氢氧化钠将其pH调节至7.0，然后加入10mL的模拟肠液，混合均匀，并在培养时间分别为0、20、40、60、80、100、120min时，取出1mL溶液，随后通过梯度稀释，使用螺旋平板接种仪接种到MRS培养板中，进行计数。结果见图3。
由图3可得，未经包埋的益生菌早已在模拟胃液中全部死亡，无法到达指定肠道，而多孔淀粉包埋的益生菌也最终全部死亡，不能存活，6层层层自组装包埋后的益生菌存活率由107CFU/ml降到了105CFU/ml，无法达到人体最低限度值(106CFU/ml或106CFU/g)；而本发明方法的复合益生菌微囊经过模拟胃肠液的消化后，存活率仍能达到107CFU/ml～108CFU/ml，外表面包埋海藻酸钠的益生菌微胶囊的存活率达到108CFU/ml，说明这种复合结构对益生菌的保护更加有效，具有良好的耐酸，耐胆盐特性，它克服了传统壁材结构疏松不紧实的缺陷，实现了益生菌在胃中不释放，在肠道才释放的靶向释放定植的功效。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种益生菌微胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向多孔淀粉中加入缓冲液，静置，加入聚乙烯亚胺，恒温振荡反应，洗涤，干燥，得多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
2)将上述多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体和固体油脂混合，加入乳化剂的溶液，40℃～50℃恒温乳化，冷却，得填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
3)向上述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体的溶液中，加入三乙胺，二甲亚砜，搅拌，加入乙酸酐，反应，然后透析，产物冷冻干燥，得乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
4)向上述乙酰化的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体中，加入乳化剂的水溶液，40℃～50℃乳化，加入脂肪酶，40～50℃反应10～20min，离心，产物冷冻干燥，得去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体；
5)将上述去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体置于菌悬液中，震荡，离心，收集沉淀，得吸附益生菌的多孔淀粉菌泥；
6)采用生物聚电解质对上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥进行包埋，得层层自组装的益生菌微胶囊。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤1)中，所述淀粉包括玉米淀粉、木薯淀粉，大米淀粉，甘薯淀粉，马铃薯淀粉中至少一种；
步骤1)中，多孔淀粉、聚乙烯亚胺的质量比为1～3：1；
步骤1)中，恒温振荡为30～50℃，震荡8～16h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤(2)中，多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、固体油脂、乳化剂的质量比为1：1～4：0.32～0.6；
步骤2)中，所述乳化剂包括聚乙烯醇，十二烷基三聚乙醇磺酸钠，十二烷基苯磺酸钠中至少一种；
步骤(2)、步骤(4)中，所述乳化具体为：用分散机14000r/min乳化3min后，取出并水浴保温5min，再次乳化，如此重复至少3次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤3)中，所述填充固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、三乙胺、二甲亚砜、乙酸酐的比例0.2～1.5g：2～10ml：10～50ml：1～5ml；
步骤3)中，反应的时间为20～26h；
步骤3)中，反应的温度为20～35℃。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
步骤5)中，所述菌悬液为经MRS液体培养基培养的益生菌溶液；所述菌悬液的浓度为1.0×109～1.0×1010CFU/ml；
步骤5)中，去除固体油脂的多孔淀粉-聚乙烯亚胺载体、菌悬液的比例为1～3g：20ml～50ml。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤6)中，所述生物聚电解质包括带正电的生物聚电解质、带负电的生物聚电解质；
优选的，带正电的生物聚电解质包括壳聚糖；
优选的，带负电的生物聚电解质包括果胶、海藻酸钠、羟甲基纤维素钠、植酸钠、硫酸葡聚糖中至少一种。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
所述步骤6)中，具体为：将上述吸附益生菌的多孔淀粉菌泥置于带正电或带负电的聚电解质溶液中，搅拌，完成第一层吸附，洗涤，离心，收集沉淀；再将完成第一层吸附的沉淀置于与第一层吸附使用的聚电解质带相反电荷的聚电解质溶液中，搅拌，完成第二层吸附，离心，洗涤；重复上述吸附，得至少2层层层自组装的益生菌微胶囊。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，
所述层层自组装的益生菌微胶囊的层数为2～12层；
优选的，所述层层自组装的益生菌微胶囊的层数为4～6层。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，
还包括：对步骤6)所得益生菌微胶囊进行干燥，得干燥化的益生菌微胶囊。
10.权利要求1～9任一项所述的方法制备得到的益生菌微胶囊。
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