KR20150056107A

KR20150056107A - 코팅 유산균의 제조방법

Info

Publication number: KR20150056107A
Application number: KR1020130138252A
Authority: KR
Inventors: 이현준; 김종훈; 박수현; 정성욱; 민병중; 오세종
Original assignee: 주식회사농심
Priority date: 2013-11-14
Filing date: 2013-11-14
Publication date: 2015-05-26

Abstract

본 발명은 프로바이오틱스의 장내 생존률 및 저장 안정성을 강화시키기 위한 코팅 유산균의 제조방법에 관한 것이다. 더 상세하게는, 본 발명은 펙틴, 카세인산 나트륨, 탈지 분유의 3가지 소재로 3중 코팅된 유산균의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 3중 코팅된 유산균 제제 및 이를 포함하는 식품에 관한 것이다.

Description

코팅 유산균의 제조방법{METHOD FOR PREPARING COATED LACTIC ACID BACTERIA}

인체나 동물의 장에 서식하면서 여러 가지 유익한 작용을 하는 미생물들이 있는데, 이러한 미생물을 프로바이오틱스(Probiotics)라고 하며, Lactobacillus나 Bifidobacterium으로 대변되는 유산균은 프로바이오틱스의 대부분을 차지하고 있다. 국내에서는 정장작용의 기능성을 가지는 대표적인 건강기능식품으로 인식되어 있다.

유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하는 최종 대사산물로 젖산을 만드는 박테리아로, 사람이나 동물의 소화관, 우유, 요구르트, 치즈, 김치, 식물 및 토양 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 이들 유산균은 인류의 생활에 직·간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있는 유익한 공생체이다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로써 이용되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있다. 여기에 속하는 유산균은 스트렙토코코스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 류코노스톡(Leuconostoc)속, 락토바실러스(lactobacillus)속, 스포로락토바실러스(Sporolactobacillus)속과 비피도박테리움(Bifidobacterium) 등이 있다. 상기 균들은 그람 양성균으로써 혐기성이거나 편성혐기성인 성질을 지니고 있으며, 동물의 장내에서 서식한다. 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하며, 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이때, 상기 유산균이 식품 또는 의약품에 이용되기 위해서는 여러 가지 선발 기준이 있는데, 내산성, 담즙산 내성, 콜레스테롤 저하 효과, 항균효과 등을 확인해야 하며, 이러한 효과를 지닌 유산균만이 장내 균총의 정상화, 유당 불내증(lactose intolerance)의 완화, 혈중 콜레스테롤 수준의 저하, 항암 효과 및 면역 체계 강화 등의 효과를 기대할 수 있다.

유산균은 사람의 소화기관 내에 존재하며 특히 소장과 대장은 유산균이 서식하는 대표적인 장소가 된다. 유산균이 인체에 유용한 건강기능 작용을 하기 위한 전제 조건으로는 첫째, 산업적인 규모에서 생산 및 저장 중에 활력을 유지해야 하며, 둘째, 숙주에 대해 유익한 효과를 주어야 하고, 셋째, 목적하는 부위의 정상적인 균주이어야 하며, 넷째, 목적하는 부위에서 생존 또는 성장할 수 있어야 한다는 점이다. 이러한 전제 조건을 갖춘 유산균이 인체에 기여하는 주요 작용으로는 장내 균총의 정상화, 유당 불내증(lactose intolerance)의 완화, 혈중 콜레스테롤 수준의 저하, 항암 효과, 면역 체계 강화 및 식품의 영양적 가치 향상 등이 되고 있다.

우수한 유산균을 선별하는 기준 중 우수한 내산성과 내담즙산성은 1차 요구조건이 된다. 내산성과 내담즙산성이 우수한 균주라 하더라도 인체의 구조상 사람이 유산균을 섭취하면, 소화기관 중 다양한 효소 및 분비되는 산의 종류에 따라 사멸되는 비율이 높을 수밖에 없다.

따라서 상기의 문제점을 해결하기 위해 유산균을 코팅하는 기술이 개발되고 있는데, 코팅을 위한 방법, 소재 등이 매우 다양하다. 종래 유산균의 코팅 기술로는 캡슐제를 이용한 장용 코팅제와 젤라틴, 당류, 검류 등을 이용한 마이크로캡슐(Microencapsulation) 공정 등이 있었다.

코팅 기술의 변화를 보면 초기에는 단일막 코팅(Single layer coating), 중기에는 이중막 코팅(Double layer coating)이 활발히 연구되었으나, 최근에는 3중 이상 복합 코팅기술에 대한 연구가 진행되고 있다. 물론 코팅 소재를 다중으로 활용할 경우 유산균의 보호에는 적합하지만, 체내 원하는 부위에 방출을 시키기 위해서는 최적 조합비 및 혼합 순서 등 세심한 연구가 필요하다. 뿐만 아니라 in vitro, in vivo 실험을 통해 그 효능을 확실히 검증할 필요가 있다.

또한 지금까지 사용되고 있는 코팅 소재의 경우 유산균 표면을 완벽히 매끄럽게 코팅할 수 없었기에 이를 위해 나노 입자코팅을 적용하는 등 다양한 기술이 연구되고 있다(출원번호 10-2008-0008269 참조). 하지만 공정이 늘어나면 제조비용 등이 상승할 수 있으며, 공정 중 외부 미생물 등이 혼입될 우려가 있다.

따라서 본 발명자들은 코팅제 첨가 및 전반적 공정 프로세스를 최소화하기 위해 범용적으로 사용되는 탈지 분유 및 카세인 나트륨(Sodium caseinate)에 지금까지 유산균의 코팅소재로 사용되지 않던 펙틴을 적용하여 코팅 소재의 경제성, 코팅 효율성 및 외부환경에 대한 저장성을 향상시키는 기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

코팅 소재는 현재까지 매우 다양하게 개발되고 있는데, 지금까지 가장 많이 연구되어왔던 소재는 alginate로써 코팅 표면이 매끄럽고 코팅 내구성이 높으며, 대량 스케일에 적용이 용이한 것이 특징이었다(출원번호 10-2011-0041930 참조). 하지만, Alginate 코팅의 경우 코팅 후 내부 물질의 방출속도 조절이 어려우며, 분산성이 떨어지는 것이 단점이다.

유산균 식품에 사용되는 유산균은 동결건조를 하여 사용하는데 동결건조방법은 유산균의 활력을 극대화시킬 수 있는 방법으로 여겨져 왔다. 유산균의 동결건조 동안 생존율을 증가시키기 위해서는 탈지 분유 또한 많이 사용되어 왔는데 탈지 분유는 세포손상을 방지하고 냉동건조물에 다공성을 부여하여 재수화 작용을 용이하게 하고 세포표면을 보호 및 피복하는 단백질을 함유하고 있기 때문이다.

유산균 세포를 보호하는 작용을 하는 아미노기나 2차 알코올기를 함유한 성분을 탈지 분유와 함께 사용하면 보호 작용을 강화할 수 있다. 이러한 성질을 가지는 물질에는 ① 세포벽과 세포질 막을 투과하는 DMSO 및 글리세롤(glycerol), ② 세포벽은 투과하나 세포막은 통과하지 못하는 올리고당(oligosaccharides), 아미노산 및 저분자량을 가진 중합체, ③ 세포벽을 통과하지 못하고 아울러 세포막 및 벽과 직접적인 상호작용이 없는 고분자의 단백질 및 다당류로 나눌 수 있다.

특히 탈지 분유와 가장 시너지 효과를 부여할 수 있는 코팅 소재는 유사 성질을 가진 우유 단백질인 카세인 나트륨(Sodium caseinate)이다. 카세인은 우유에 함유된 전체 단백질의 80%를 차지하는 성분으로, 카세인 나트륨은 우유에 산(酸) 처리를 해 얻어낸 정제된 우유 단백질을 말한다. 이는 식품의 점도를 높이고 촉감을 개선하는 등의 효과를 가진 식품첨가물이다.

우유에 수산화나트륨과 같은 알칼리 처리를 하고 섭씨 80~90도로 열을 가하면 카세인 단백질만 녹아서 나오는데, 카세인 나트륨은 여기에 수용성을 높이기 위해 나트륨을 결합시킨 것으로 성분은 카세인과 별 차이가 없다. 식품의약품안전청이 허가한 일종의 유화제(乳化劑)로 식품의 점착성, 유화안정성, 물성 등 여러 가지의 목적으로 사용되며 커피 크림을 비롯해 마요네즈, 케첩 등에 다양하게 사용되고 있다. 특히 JECFA(국제식량농업기구-세계보건기구 합동 식품첨가물 전문가위원회)에서 1일 허용 섭취량을 설정하지 않을 만큼 안전성이 확인된 물질이다. 코팅 소재로서 카세인 나트륨(Sodium caseinate)은 단백질 코딩 작용을 할 수 있기 때문에 유산균 분말의 안정화, 조직감 개선, 사상화 방지, 저장 중 수축이나 형태 변화 등을 방지할 수 있는 장점이 있다.

동결건조에 의한 생물학적인 손상은 주로 세포막 지질의 물리적인 상태의 변화, 세포내 민감성 단백질의 구조적 변화로 사료되고 있으며 당류를 첨가하면 막 손상을 방지하고 지방산화 방지효과가 있으며, 당류와 단백질 복합체가 생성되어 단백질 구조를 안정화하여 정상적인 기능유지 효과 및 팽압(turgor)을 유지하는 효과가 있다. 한편 트레할로오스는 점도가 높으므로 유리 같은 망(glassy matrix)을 형성하여 단백질의 기능성을 유지하는 등 다른 당류보다 더 좋은 효과가 보고되고 있으나 가격이 비싼 점이 사용의 제한요인이다.

따라서, 본 발명에서는 경제적이면서, 동결건조에 의한 생물학적인 손상을 최소화하며, 코팅의 견고성 및 표면 매끄러움 향상을 위해 펙틴 소재를 적용하였다. 펙틴이란 pectinic acid로 그 기본 구성단위는 D-galacturonic acid이며 이것이 α-1,4결합으로 직쇄상으로 연결된 것이다. Galacturonic acid의 측쇄의 carboxyl기 일부가 임의로 methylester화되어 methoxyl을 함유한다. 그 전부가 methylester화된 경우에는 이론적으로 methoxyl기 함량은 16.32%가 되지만 일반적으로는 8~12% 정도의 것이 많다. 이용상에서는 7% 이상을 포함하고 있는 것을 고 methoxyl pectin(high methoxyl pectin:HMP)이라 하고 7% 이하를 포함하고 있는 것을 저 methoxyl pectin(low methoxyl pectin:LMP)이라고 한다. Methoxyl기가 0%인 polygalacturonic acid는 pectic acid이다. 본 발명에서는 탈지 분유, 카세인 나트륨 등과 사용하기에 적합한 코팅 소재로 저 methoxyl pectin(이하 LM-Pectin)을 선정하였으며, 3중 혼합코팅 소재에 적용하였다.

펙틴은 분자량이 200,000~400,000 정도의 고분자이며, 세포막의 결착 물질로서 역할을 하므로, 유산균을 효과적으로 보호하고, 낮은 pH 조건에서 생존률을 향상시켜 주는 긍정적인 역할을 할 수 있다. 하지만, 실제 적용하기에 용해성 및 분산성이 낮아 사용에 제한이 있어 3중 혼합 코팅소재로 사용된 사례는 없다. 따라서, 상기 한계점을 펙틴을 고온에서 용해시킨 후 교반기를 통해 3가지 코팅소재 최적 조성비로 혼합한 후 균질화하는 공정을 통해 해결하였다.

따라서 본 발명자들은 코팅제 첨가 및 전반적 공정 프로세스를 최소화하기 위해 범용적으로 사용되는 탈지 분유 및 카세인 나트륨(Sodium caseinate)에 지금까지 유산균 코팅 소재로 사용되지 않던 펙틴을 적용하여 코팅 소재의 경제성, 효율성 및 외부환경에 대한 저장성을 향상시키는 3중 혼합 코팅기술을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 상기 목적은 배양된 유산균 배양액 또는 동결건조된 분말에 펙틴, 탈지 분유, 카세인 나트륨을 3중 혼합 코팅함으로써 내산성, 내담즙산성 특히 장내 생존률 및 저장 안전성을 더욱 증진시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 일 측면은 증류수에 펙틴을 분산시키는 단계; 상기 펙틴 용액에 카세인 나트륨을 첨가하고 분산시키는 단계; 상기 펙틴 및 카세인 나트륨 용액에 탈지 분유를 첨가하고 분산시켜, 3중 코팅 용액을 제조하는 단계; 상기 3중 코팅 용액을 살균하는 단계; 및 살균된 상기 3중 코팅 용액에 유산균 분말 또는 유산균 농축액을 혼합하는 단계;를 포함하는 코팅 유산균의 제조방법을 제공한다.

이때, 3중 코팅 용액에 유산균 농축액을 혼합하여 제조된 코팅 유산균 농축액을 건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

펙틴을 분산시키는 단계는, 80~100℃의 증류수에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 0.3~2중량부의 펙틴을 첨가한 후 5,000~8000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 카세인 나트륨을 분산시키는 단계는, 60~100℃의 펙틴 용액에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 2~10중량부의 카세인 나트륨을 첨가한 후 5,000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 탈지 분유를 분산시키는 단계는, 60~100℃의 펙틴 및 카세인 나트륨 용액에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 5~15중량부의 탈지 분유를 첨가한 후 5,000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 3중 코팅 용액을 살균하는 단계는, 펙틴, 카세인 나트륨 및 탈지 분유의 혼합 용액을 100~121℃에서 살균한 후 25~38℃로 냉각하는 단계를 포함할 수 있다.

여기서, 이용될 수 있는 유산균은 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 페디오코커스(Pediococccus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 다른 측면은 상술한 코팅 유산균의 제조방법에 의해 제조된 코팅 유산균을 포함하는 유산균 제제를 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 상술한 코팅 유산균의 제조방법에 의해 제조된 코팅 유산균을 포함하는 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 개발된 코팅 기술을 적용할 수 있는 상기 유산균으로는 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 페디오코커스(Pediococccus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속 등을 이용할 수 있다.

본 발명에서 개발된 코팅 소재의 전처리 공정은 다음과 같다.

(a) 증류수에 펙틴을 분산시키는 단계;

(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 펙틴 용액에 카세인 나트륨(Sodium caseinate)를 분산시키는 단계;

(c) 상기 (b) 단계에서 제조된 펙틴, 카세인 나트륨(Sodium caseinate) 혼합 용액에 탈지 분유를 분산시키는 단계;

(d) 상기 (c) 단계에서 제조된 펙틴, 카세인 나트륨(Sodium caseinate), 탈지 분유가 혼합된 코팅 용액을 살균하는 단계;

(e) 상기 (d) 단계에서 제조된 살균 혼합 코팅 용액을 유산균 농축액 또는 유산균 분말에 혼합하는 단계; 및

(f) 상기 (e) 단계에서 혼합된 코팅 유산균 농축액을 건조하는 단계;를 포함한다.

(a) 단계: 증류수에 펙틴을 분산시키는 단계

상기 (a) 단계에서 사용되는 펙틴은 경제적이면서, 동결건조에 의한 생물학적인 손상을 최소화하며, 코팅의 견고성 및 표면 매끄러움 향상에 도움을 준다. 또한, 세포막의 결착물질로서 역할을 하므로 유산균을 효과적으로 보호하고, 낮은 pH 조건에서 생존률을 향상시켜 주는 긍정적인 역할을 할 수 있다. 본 발명에서는 탈지 분유, 카세인 나트륨 등과 사용하기에 적합한 methoxyl기 함량이 7% 이하인, LM-Pectin을 첨가하였다.

펙틴은 코팅기술에 적용하기에 용해성 및 분산성이 낮아 사용에 제한이 있어 3중 혼합 코팅소재로 사용된 사례는 없었다. 따라서, 상기 한계점을 펙틴을 고온에서 용해시킨 후 교반기를 통해 3가지 코팅소재 최적 조성비로 혼합한 후 균질화하는 공정을 통해 해결하였다.

펙틴을 용해시키기 위하여 80~100℃로 가열된 증류수에 코팅용액 100중량부에 대하여 0.3~2 중량부의 펙틴을 첨가한 후 균질화 공정을 거친다. 펙틴은 용해도 및 분산성이 떨어지므로, 균질화시 5,000~8,000rpm에서 30~60분 동안 교반하는 것이 중요하다. 그렇지 않으면, 펙틴이 다시 뭉치거나 침전되어 코팅 효율이 감소하게 된다. 펙틴은 소량 첨가하기 때문에 최소 5,000rpm 이상에서는 분산이 잘 이루어지고, 다시 뭉치는 현상이 일어나지 않게 된다. 그리고 8,000rpm 이상에서 균질화시키면 펙틴의 분산효율이 5,000rpm보다 크게 증가하지 않기 때문에, 5,000~8,000rpm 수준에서 교반하는 것이 좋다.

(b) 단계: 상기 (a) 단계에서 제조된 펙틴 용액에 카세인 나트륨(Sodium caseinate)을 분산시키는 단계

카세인 나트륨(Sodium caseinate)은 탈지 분유와 가장 시너지 효과를 부여할 수 있는 코팅 소재로써 우유에 산(酸) 처리를 해 얻어낸 정제된 우유 단백질을 말한다. 이는 식품의 점도를 높이고 촉감을 개선하는 등의 효과를 가진 식품첨가물이다.

코팅 소재로서 카세인 나트륨(Sodium caseinate)은 단백질 코딩 작용을 할 수 있기 때문에 유산균 분말의 안정화, 조직감 개선, 사상화 방지, 저장 중 수축이나 형태 변화 등을 방지할 수 있는 장점이 있다.

상기의 장점을 가진 카세인 나트륨은 60~100℃ 펙틴 용액에 코팅용액 100중량부에 대하여 2~10중량부를 첨가할 수 있다. 펙틴의 용해도 및 분산성 감소 방지를 위해 (a)과정에서와 동일하게 균질기(Homogenizer)로 균질화 과정을 수행한다.

(c) 단계: 상기 (b) 단계에서 제조된 펙틴, 카세인 나트륨 혼합 용액에 탈지 분유를 분산시키는 단계

유산균 식품에 사용되는 유산균은 동결건조를 하여 사용하는 것이 일반적이다. 동결건조방법은 특히 유산균의 활력을 유지 또는 극대화시킬 수 있는 방법으로 여겨져 왔다. 유산균의 동결건조 동안 생존율을 증가 증가시키기 위해서는 탈지 분유 또한 많이 사용되어 왔는데, 탈지 분유는 세포손상을 방지하고 냉동건조물에 다공성을 부여하여 재수화 작용을 용이하게 하고 세포표면을 보호 및 피복하는 단백질을 함유하고 있기 때문이다.

상기의 장점을 가진 탈지 분유는 60~100℃의 펙틴, 카세인 나트륨 혼합 용액에 코팅용액 100중량부에 대하여 5~15 중량부를 첨가할 수 있다. 펙틴 및 카세인 나트륨의 용해도 및 분산성 감소 방지를 위해 (a)과정에서와 동일하게 균질기(Homogenizer)로 균질화 과정을 수행한다.

(d) 단계: 상기 (c) 단계에서 제조된 펙틴, 카세인 나트륨(Sodium caseinate), 탈지 분유가 혼합된 코팅 용액을 살균하는 단계

균질화된 3가지 코팅소재가 혼합된 코팅 용액은 살균 과정을 거쳐 외부 미생물의 혼입을 방지한다. 살균 과정은 100~121℃에서 15~30분 수행하며, 살균 후 25~38℃에서 냉각시킨다. 살균 온도는 일반 미생물이 사멸할 수 있는 최저 온도인 100℃에서 121℃까지 설정할 수 있으며, 100℃ 이하가 될 경우 일반 미생물 또는 포자형성 미생물이 생존하여 오염요인이 될 수 있다. 또한 121℃ 이상 살균할 경우에는 단백질이 주성분인 코팅 소재가 변성이 일어날 수 있어 온도 범위는 최대 121℃ 이하로 하는 것이 좋다. 또한, 살균한 코팅 용액을 냉각하는 이유는 농축된 유산균 배양액에 고온 또는 저온의 코팅 혼합액을 첨가할 경우 균주의 활성에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문이다.

(e) 단계: 상기 (d) 단계에서 제조된 살균 혼합 코팅 용액을 유산균 농축액 또는 유산균 분말에 혼합하는 단계

(f) 단계; 상기 (e) 단계에서 혼합된 코팅 유산균 농축액을 건조하는 단계

상기 코팅 혼합액을 첨가한 유산균 농축액은 동결건조기를 통해 3중 혼합코팅 유산균 분말로 제조될 수 있다.

상기 (f) 단계를 통해 발명된 3중 혼합 코팅 유산균은 종래 코팅되지 않은 유산균 또는 이중 코팅된 유산균에 비해 다음과 같은 현저한 효과를 가져올 수 있었다.

1) 코팅형태의 우수성- 외벽형태,

2) 내산성 및 내담즙산성 향상,

3) 내열성 향상,

4) 장내 생존률 향상,

5) 저장 안정성 향상 등 우수한 생리활성 기능을 나타내었다.

이상 살펴본 바와 같이 본 발명은 배양된 유산균 배양액 또는 동결건조된 분말에 펙틴, 탈지 분유, 카세인 나트륨을 3중 혼합 코팅함으로써 내산성, 내담즙산성, 특히 장내 생존률, 열 안전성 및 저장 안전성을 더욱 증진시킬 수 있다. 이와 같은 방법으로 제조된 코팅 유산균을 발효유, 가공유, 장류 발효식품, 김치발효식품, 기능성 음료, 기능성 식품, 일반식품 및 화장품 등의 다양한 제품에 활용할 수 있다.

도 1은 코팅 유산균 제조공정을 나타낸 것이다.
도 2는 3중 혼합코팅 유산균 Lactobacillus acidophilus NS1의 주사전자현미경 관찰결과에 관한 것이다.
도 3은 3중 혼합코팅 유산균 Lactobacillus acidophilus NS1의 투사전자현미경 관찰결과에 관한 것이다.
도 4는 3중 혼합코팅 유산균 L. acidophilus NS1의 내열성 평가 결과에 관한 것이다.
도 5는 Fluorescein isothiocyanate(FITC) 촬영결과에 관한 것이다.
도 6은 시판제품 비교평가 결과에 관한 것이다.
도 7은 저장안전성 평가 결과에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 통한 효능 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법의 이해를 돕기 위하여 실시예를 기재한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

본 발명에서 개발된 코팅기술은 유산균 배양 후 농축과정 및 분말화 공정 후 적용 가능하다.

[실시예 1] 유산균 배양

유산균 대량생산용 배지에는 그 목적에 따라 다르지만, 기본적으로 유제품에 사용할 목적인 경우 탈지 분유(skim milk powder)를 많이 사용한다. 탈지 분유는 식품용으로 사용하기 때문에 요구르트나 치즈의 스타터(starter)로 유산균을 사용하고자 할 때에는 이를 사용한다. 탈지 분유를 사용한 경우에는 동결이나 건조에 유산균을 보호할 수 있는 장점이 있다.

그러나, 탈지 분유는 pH 저하에 따라 우유 단백질의 카세인(casein)이 침전되기 때문에 균체를 회수하고자 할 때 카세인이 같이 회수된다. 따라서, 균체만을 회수하여 다른 목적으로 사용할 때에는 균체의 회수가 용이한 배지를 사용한다. 본 발명에서는 트립톤, 효모추출물, 포도당이 첨가된 간단한 배지를 구성해 보았으며, 배지 조성은 다음과 같다.

참고로 본 실시예에서 배양한 유산균은 2012년 11월 14일에 한국미생물보존센터에 기탁된 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) NS1(KCCM11322P)(한국출원번호 10-2012-0155778 참조) 및 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) NS 2(KCCM11323P)이다.

유산균 대량 생산 배지

L. plantarum NS		L. acidophilus NS 1
Soy pepton	2%	Peptone	1.5%
Yeast extract	0.5%	Trytone	1.5%
Glucose	2%	Glucose	3%
Potassium phosphate	0.2%	Yeast extract	1%
Magnesium sulfate	0.01%	Potassium phosphate dibase	0.2%
Manganese sulfate	0.005%
pH 7.0		pH 7.0

상기 배지 조건으로 대량생산 한 후 농축하여 균체를 회수한 다음 생균수를 측정한 결과 10⁹ CFU/ml 수준으로 나타났다.

선발 유산균의 대량생산 후 생균수

	L. acidophilus NS1	L. plantarum NS2
배양 후	9.8×10⁸	1.21×10⁹
농축 후	8.7×10⁹	9.1×10⁹

[실시예 2] 3중 혼합코팅 유산균의 제조

본 발명에서 개발된 코팅 소재의 전처리 공정 및 코팅 유산균의 제조과정을 도 1을 참조하여 설명한다.

(a) 증류수에 펙틴을 분산시키는 단계

펙틴을 용해시키기 위하여 80~100℃로 가열된 증류수에 코팅 용액 100중량부에 대하여 0.3~2 중량부의 펙틴을 첨가한 후 균질화 공정을 거친다. 펙틴은 용해도 및 분산성이 떨어지므로, 5,000rpm에서 최소 30~60분 이상 교반하여 균질화시키는 것이 중요하다. 그렇지 않으면 펙틴이 다시 뭉치거나 침전되어 코팅 효율이 감소하게 된다. 펙틴은 소량 첨가하기 때문에 최소 5,000rpm 이상에서는 분산이 잘 이루어지고, 다시 뭉치는 현상이 일어나지 않게 된다. 그리고 8,000rpm 이상에서 균질화 시키면 펙틴의 분산효율이 5,000rpm보다 크게 증가하지 않기 때문에, 5,000~8,000rpm 수준에서 교반하는 것이 좋다.

(b) 상기 (a) 단계에서 제조된 펙틴 용액에 카세인 나트륨(Sodium caseinate)을 분산시키는 단계;

60~100℃ 펙틴 용액에 코팅 용액 100중량부에 대하여 2~10중량부의 카세인 나트륨을 첨가한다. 펙틴의 용해도 및 분산성 감소 방지를 위해 (a)과정에서와 동일하게 균질기(Homogenizer)로 균질화 과정을 수행한다.

60~100℃의 펙틴, 카세인 나트륨 혼합 용액에 코팅 용액 100중랴부에 대하여 5~15중량부의 탈지 분유를 첨가한다. 펙틴 및 카세인 나트륨의 용해도 및 분산성 감소 방지를 위해 (a)과정에서와 동일하게 균질기(Homogenizer)로 균질화 과정을 수행한다.

상기 3가지 코팅 소재는 펙틴을 최우선으로 투입하여 분산성과 용해도를 향상시키는 과정이 중요하며, 그 다음으로 카세인 나트륨, 탈지 분유 순으로 저용량에서 고용량의 순서로 투입하는 것이 균일한 혼합 코팅 용액 제조에 용이하다.

균질화된 3가지 코팅소재가 혼합된 코팅 용액은 살균 과정을 거쳐 외부 미생물의 혼입을 방지한다. 살균 과정은 121℃에서 15~30분 수행하며, 25~38℃로 조절하여 냉각시킨다. 살균 과정은 100~121℃에서 15~30분 수행하며, 25~38℃로 조절하여 냉각시킨다. 살균 온도는 일반 미생물이 사멸할 수 있는 최저 온도인 100℃에서 121℃까지 설정할 수 있으며, 100℃ 이하가 될 경우 일반 미생물 또는 포자형성 미생물이 생존하여 오염요인이 될 수 있다. 또한 121℃ 이상 살균할 경우에는 단백질이 주성분인 코팅 소재가 변성이 일어날 수 있어 온도 범위는 최대 121℃ 이하로 하는 것이 좋다. 또한, 살균된 코팅 용액을 냉각하는 이유는, 농축된 유산균 배양액에 고온 또는 저온의 코팅 혼합액을 첨가할 경우 균주의 활성에 부정적인 영향을 줄 수 있기 때문이다.

(e) 상기 (d) 단계에서 제조된 살균된 코팅 용액을 유산균 농축액 또는 유산균 분말에 혼합하는 단계;

상기 (d) 단계에서 제조된 코팅 용액 100중량부에 50~90중량부의 유산균 농축액 또는 유산균 분말을 혼합하여, 펙틴, 카세인 나트륨, 탈지 분유로 3중 코팅된 유산균을 제조한다.

(f) 상기 (e) 단계에서 혼합된 코팅 유산균 농축액을 건조하는 단계;

상기 (e) 단계에서 유산균 농축액을 이용한 경우, 코팅 유산균 농축액을 동결건조기를 이용하여 건조시키는 단계를 더 포함할 수 있고, 이를 통해 펙틴, 카세인 나트륨, 탈지 분유로 3중 코팅된 유산균 분말을 제조할 수 있다.

상기 방법을 통해 제조된 3중 혼합 코팅 유산균 분말의 생균수는 다음 표 3과 같다.

3중 혼합 코팅 유산균 생균수

	L. acidophilus NS1	L. plantarum NS2
3중 혼합코팅제	1.84×10¹¹ CFU/g	1.21×10¹¹ CFU/g

[실시예 3] 3중 혼합코팅 유산균 L. acidophilus NS1의 주사/투사 전자 현미경 관찰

이하, 상기에서 제조된 3중 혼합코팅 유산균의 효능을 검증한 과정에 대한 설명이다. 첫 번째 검증 과정으로, 주사전자 현미경 관찰을 통해 코팅 후 크기 변화, 코팅 외부 표면의 매끄러움 등을 확인하였다. 코팅 유산균 동결건조 분말을 이온도금 장치를 사용하여 20nm 두께로 금 도금을 한 후 주사전자현미경(scanning electron microscope, SEM, Hitachi S-450, Japan)으로 15kV의 가속전압 하에서 관찰하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 알 수 있듯이, 관찰 결과 비 코팅 유산균에 비해 코팅 유산균의 크기가 약 3배 이상 커지는 것을 확인할 수 있었고, 표면이 더욱 매끄럽게 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 코팅됨으로써 유산균이 외부 환경(산소, 온도 등)에 노출되는 위험성을 감소시킬 수 있다.

다음으로 코팅 절단면을 투과전자현미경(Transmission electron microcope)으로 촬영해 보았다. 촬영용 표본 제작은 동결건조된 시료에 propylene oxide와 spurr's resin을 3:1, 3:2, 1:1, 2:3 및 1:3의 비율로 30분씩 갈아준 후 마지막에 100% spurr's resin을 넣어서 overnight 하였다. 이렇게 나온 시료를 block dye에 넣어준 다음 7C incubator에서 overnight 하여 polymerization 하였다. 그리고 semithin section 후 두께 70 nm 정도로 ultrathin section 하여 uranyl acetate와 lead citrate 용액으로 2중 염색 후 투과전자현미경(JEM-1010, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 알 수 있듯이, 관찰결과, 3중 혼합 코팅 소재가 균주 주위를 둘러싸고 외부로부터 보호하고 있는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명의 3중 혼합 코팅은 Matrix system으로 코어 물질인 유산균이 코팅 매트릭스 속에 삽입(embedded)된 형태로 분산되어 있다. 즉, 3개 층으로 코팅되는 것이 아닌 혼합된 코팅 전처리 용액과 유산균이 동시에 혼재되어 있는 상태로 볼 수 있다.

3가지 코팅 소재가 혼합된 코팅 용액 중 펙틴성분은 점착성이 좋으므로 유산균 세포막과의 결착에 가장 큰 역할을 한다. 뿐만 아니라, 펙틴의 점착성으로 카세인 나트륨과 탈지 분유가 더 잘 혼합되어 코팅을 안정화시키는데 도움을 주는 역할을 한다. 도 3과 같이, 코어물질인 유산균을 펙틴 성분이 안정화시키고 카세인 나트륨과 탈지 분유가 더 잘 섞여 코팅 성분 간의 결합에 도움을 주는 것이 핵심 요소라 볼 수 있다.

[실시예 4] 3중 혼합코팅 유산균의 내열성(Heat resistance) 증진효과 평가

고온 처리시 생존율의 증진효과를 조사하기 위하여 복합코팅 유산균 L. acidophilus NS1과 대조구 유산균을 50℃와 60℃로 높인 후 생존율을 비교하였다. 열처리 전 생균수를 기준으로 하여 다음과 같이 생존율(%)을 계산하여 고온에 대한 내성을 비교하였다.

생존율(%)=열처리 후 생균수 ( log CFU / ml )/ 열처리전 생균수( log CFU / ml )

도 4는 50℃와 60℃에서의 유산균의 내열성을 비교한 것이다. 3중 혼합 코팅된 유산균은 50℃와 60℃에서 1시간 및 2시간 동안 열처리에서 코팅 유산균의 생균수가 높은 것으로 나타나, 3중 혼합코팅은 유산균의 고온 스트레스에 대한 사멸 억제 작용이 있는 것으로 확인되었다.

[실시예 5] 내산성 평가

0.05M Sodium phosphate 용액을 제조하여 HCl로 pH를 2.0, 2.5로 조정한 MRS broth에 pepsin (Sigma Co., USA)을 1,000 unit/mL 되도록 첨가하였다. 초기 균수가 10⁷cfu/ml정도가 되도록 코팅 및 비코팅(대조구) L. acidophilus NS1 및 코팅 및 비코팅(대조구) L. plantarum NS2를 0.05 M Sodium phosphate buffer에 접종하여 37℃에서 2시간 배양한 후 성장한 집락수를 계산하여 내산성을 평가하였다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

코팅 유산균의 내산성 평가결과

구분	L. acidophilus NS1		L. plantarum NS2
구분	대조구	코팅	대조구	코팅
pH 7.0(Control)	1.12×10⁷	1.22×10⁷	1.81×10⁷	1.79×10⁷
pH 3.0	2.02×10⁶	5.13×10⁶	1.41×10⁶	4.23×10⁶
pH 2.5	2.0×10⁶	6.6×10⁶	1.24×10⁶	3.47×10⁶
pH 2.0	1.24×15	4.93×10⁵	2.26×10⁵	6.12×10⁵

상기 표 4에서 알 수 있듯이, 내산성 평가 결과 두 균주 모두 3중 혼합 코팅시 3배 이상의 생존률이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 6] 내담즙산성 평가

여과 제균된 oxgall(Difco, USA) 용액을 oxgall 함량이 0.5% (w/v)가 되도록 첨가한 MRS 배지에 코팅 및 비코팅(대조구) L. acidophilus NS1 및 코팅 및 비코팅(대조구) L. plantarum NS2의 현탁액을 접종하여 37℃에서 0, 24시간 배양하여 집락수를 평가하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

코팅 유산균의 내담즙산성 평가결과

구분	L. acidophilus NS1		L. plantarum NS2
구분	대조구	코팅	대조구	코팅
초기균수 1회	2.06×10⁶	2.16×10⁶	1.06×10⁶	1.09×10⁶
초기균수 2회	2.31×10⁶	2.41×10⁶	1.31×10⁶	1.25×10⁶
초기균수 평균	2.19×10⁶	2.29×10⁶	1.19×10⁶	1.18×10⁶
24시간 후 1회	1.9×10⁶	2.9×10⁶	1.7×10⁶	2.9×10⁶
24시간 후 2회	1.0×10⁶	3.0×10⁶	1.0×10⁶	2.5×10⁶
24시간 후 평균	1.45×10⁶	2.95×10⁶	1.35×10⁶	2.7×10⁶

상기 표 5에서 알 수 있듯이, 내담즙산성 평가 결과 두 균주 모두 3중 혼합 코팅시 2배 이상의 생존률이 향상되는 것을 확인할 수 있었다.

[실시예 7] Fluorescein isothiocyanate(FITC)를 이용한 mouse 장부착성 비교

복합 코팅된 균주 2종, L. acidophilus NS1 및 L. plantarum NS2을 MRS broth pH 7.0에서 OD₆₀₀ 0.6까지 배양한 후(8h), 원심분리하였다. 회수된 균체는 탈지 분유(10%), glucose(0.5%), yeast extract(0.25%)가 함유된 배지에 혼합하여 -70℃에서 보관하며 사용하였으며, 각 유산균 시료는 pellet 무게(30~50 mg)는 동일하게 하여 진행하였다. 각 유산균 pellet에 solution 상태의 FITC(1 mg/mL in 50 mM sodium carbonate buffer pH 8.9, sigma)를 넣고 2시간 상온에서 배양하였다. 10,000 g에서 원심분리하여 cell에 스며들지 않은 FITC 잔해를 제거하며, 0.85% NaCl로 3~6회 세척하였다. Bacteria cell은 2×10⁸의 농도로 mouse(C57BL6)에 경구 투여하고 24시간 후, 소장 및 대장 내 형광물질 발현 상태를 Olympus 1X71 FV500 confocal laser-scanning microscope (Olympus America Inc.)으로 확인하였다. 도 5는 소장 및 대장에서 형광 처리한 3중 혼합코팅 프로바이오틱스의 장내 생존률 결과를 나타낸다. 도 5에서 보이듯이 코팅하지 않은 프로바이오틱스에 비해 코팅된 프로바이오틱스가 현저히 많은 수가 생존해 있는 것을 확인할 수 있다.

이후 객관적인 비교평가를 위해 소장 및 대장의 조직사진에 heamacytometer grid를 겹쳐서 형광 spot을 계수하였다.

즉 각 시료당 소장 및 대장의 5 구역을 랜덤으로 선정 후 형광색으로 표시되는 균을 계수 후 평균값을 구하여 생존률을 비교하였다(도 6). 도 6의 종축은 계수된 프로바이오틱스의 수를 의미한다.

[실시예 8] 저장 안전성 평가

실시예 2에서 제조된 3중 혼합 코팅 유산균의 저장 안전성 평가를 수행하였다. 약 120일 동안 -50℃, 25℃, 30℃, 35℃에서 보관 후 일 수 경과에 따른 코팅 분말 1g당 생균수를 측정해 보았다. 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 의하면, -50℃ 냉동보관을 대조구로 하여 생균수를 비교하였을 때, 25℃, 30℃, 35℃에서 생균수 변화가 코팅 유산균의 경우 거의 일정하게 유지되는 것을 확인하였다. 반면 비코팅 유산균의 경우 시간이 지날수록 생균수가 1 log cfu/g 이상 감소하는 경향을 보였다.

[실시예 9] 유산균 제제의 제조

본 발명의 3중 혼합코팅 유산균을 활용하여 건강기능식품, 정장제 등의 유산균 제제를 제조하였다. 이를 위하여 3중 혼합 코팅 프로바이오틱스 L. acidophilus NS1, L. fermentum NS2 분말 20중량%에 무수결정 포도당 20중량%, 결정과당 7중량%, 과일 분말향 3중량%, 식이섬유 20중량%, 비타민 혼합분말 3중량%, 식물성 분말크림 15중량%, 과일 분말 12중량%를 혼합하였다. 이후 스틱 또는 캡슐 형태로 일정량 분주하여 포장하였으며, 이렇게 제조된 코팅 유산균 제제는 5×10⁹ cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.

[실시예 10] 체중조절식품의 제조

본 발명의 3중 혼합코팅 유산균을 활용하여 체중조절식품을 제조하였다. 이를 위하여 이를 위하여 3중 혼합 코팅 프로바이오틱스 L. acidophilus NS1, L. fermentum NS2 분말 2 중량%에 분리대두단백 30 내지 40 중량%, 결정 과당 10 내지 20 중량%, 코코아 파우더 5 내지 15 중량%, 곡물 믹스 5 내지 15 중량%, 프락토 올리고당 5 내지 15 중량%, 식이섬유 1 내지 5 중량%, 비타민 미네랄 믹스 0.1 내지 0.5 중량%, 과일향 분말 0.1 내지 1 중량%을 혼합하여 전체 100중량%가 되도록 혼합하였다. 이렇게 제조된 체중조절식품 내 코팅 유산균은 5×10⁹ cfu/g 이상의 생균수를 유지하였다.

Claims

증류수에 펙틴을 분산시키는 단계;
상기 펙틴 용액에 카세인 나트륨을 첨가하고 분산시키는 단계;
상기 펙틴 및 카세인 나트륨 용액에 탈지 분유를 첨가하고 분산시켜, 3중 코팅 용액을 제조하는 단계;
상기 3중 코팅 용액을 살균하는 단계; 및
살균된 상기 3중 코팅 용액에 유산균 분말 또는 유산균 농축액을 혼합하는 단계;를 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 3중 코팅 용액에 유산균 농축액을 혼합하여 제조된 코팅 유산균 농축액을 건조하는 단계를 더 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 펙틴을 분산시키는 단계는
80~100℃의 증류수에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 0.3~2중량부의 펙틴을 첨가한 후 5,000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 카세인 나트륨을 분산시키는 단계는
60~100℃의 펙틴 용액에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 2~10중량부의 카세인 나트륨을 첨가한 후 5,000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 탈지 분유를 분산시키는 단계는
60~100℃의 펙틴 및 카세인 나트륨 용액에 3중 코팅 용액 100중량부에 대하여 5~15중량부의 탈지 분유를 첨가한 후 5,000rpm에서 30~60분 동안 교반하여 균질화시키는 단계를 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 3중 코팅 용액을 살균하는 단계는
펙틴, 카세인 나트륨 및 탈지 분유의 혼합 용액을 121℃에서 살균한 후 25~38℃로 냉각하는 단계를 포함하는, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 유산균은 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 페디오코커스(Pediococccus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 비셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인, 코팅 유산균의 제조방법.
제1항 또는 제2항에 따른 코팅 유산균의 제조방법에 의해 제조된 코팅 유산균을 포함하는 유산균 제제.
제1항 또는 제2항에 따른 코팅 유산균의 제조방법에 의해 제조된 코팅 유산균을 포함하는 식품.