KR20240046025A - 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법 - Google Patents
탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 탄산칼슘으로 프로바이오틱스를 캡슐화하여 장 도달률, 동결건조 시의 프로바이오틱스 안정성 및 저장 안정성을 향상시킨 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 탄산칼슘으로 프로바이오틱스를 캡슐화하여 장 도달률, 동결건조 시의 프로바이오틱스 안정성 및 저장 안정성을 향상시킨 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 적당량을 섭취했을 때 인체에 이로움을 주는 살아있는 균을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익을 주는 균을 의미한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균이다. 프로바이오틱스인 유산균이나 이로운 세균들은 몸 안의 위산과 담즙산에서 살아남아서 소장까지 도달하여 장에서 증식하고 정착한다. 이후, 정착한 장 안에서 건강에 이로운 효과를 나타내므로, 이러한 프로바이오틱은 독성이 없고 비병원성이어야 한다.
프로바이오틱스 제품 개발에 있어서 가장 중요한 것은 유산균이 생존한 상태로 안전하게 장에 도달하는 것이다. 왜냐하면 프로바이오틱스도 균 자체가 단백질로 구성되어 있어 체내로 투입 시 위산 및 담즙산에 의해 세포막이 손상되면서 프로바이오틱스의 이로운 기능이 발휘되지 못하기 때문이다.
시판되는 대부분의 유산균 제품은 알지네이트, 단백질, 다당류 등을 첨가하여 유산균을 다중 코팅하는 방법으로 문제를 해결하고 있다. 하지만 종래의 기술을 이용해서 유산균을 보호하는 경우 다중 코팅으로 인해 생산 비용이 증가하는 문제점이 있다. 뿐만 아니라 동결건조 과정에서 코팅이 변형되며 유산균이 사멸하는 치명적인 문제점들이 존재한다.
이에, 보다 간편하게 유산균을 보호하면서 효과적으로 장에 도달할 수 있는 프로바이오틱스 제품 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 탄산칼슘으로 프로바이오틱스를 캡슐화하여 장 도달률, 동결건조 시의 프로바이오틱스 안정성 및 저장 안정성을 향상시킨 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 프로바이오틱스 분말을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법을 제공하는 것이다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 본 발명의 기재로부터 당해 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있다.
본 발명은 탄산칼슘; 및 프로바이오틱스;를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 입자 크기가 0.9 내지 9.2 μm인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 탄산칼슘의 함량이 17 내지 98%인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 장 도달 개체수가 8.2 내지 10.4 Log CFU/g인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘은 담즙과 반응하여 수산화인회석(hydroxyapatite)으로 전환되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 캡슐화 수율이 96 내지 100%인 것을 특징으로 하고, 상기 캡슐화 수율은 하기 식 1으로 계산되는 것을 특징으로 한다.
[식 1]
E(%) = [ (N0-N1) ÷ N0 ] × 100
(상기 식 1에서 E(%)는 캡슐화 수율, N0는 유산균 캡슐화 공정에 사용한 세포수(CFU/g), N1은 캡슐화 후 용액에 남아있는 세포수(CFU/g), 즉 캡슐 내에 안착하지 못한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 프로바이오틱스 분말을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 액상 제제에 첨가한 프로바이오틱스 액상 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 프로바이오틱스를 배양하는 단계; 및 칼슘 소스, 탄산 소스 및 상기 배양한 프로바이오틱스를 혼합하고 반응시켜 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제조하는 단계;를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하여 분말화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 칼슘 소스는 CaCl2, Ca(NO3)2, CaO 및 유기산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 칼슘 소스인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산 소스는 Na2CO3, K2CO3, (NH4)2CO3 및 CO2(g)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 탄산 소스인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 프로바이오틱스는 Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 칼슘 소스는 농도가 50 내지 60000 ppm인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 탄산 소스는 농도가 50 내지 60000 ppm인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 탄산칼슘으로 프로바이오틱스를 캡슐화하여 장 도달률, 동결건조 시의 프로바이오틱스 안정성 및 저장 안정성을 향상시킨 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 프로바이오틱스 분말을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 액상 제제에 첨가한 프로바이오틱스 액상 제제를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 효과들은 이상에서 언급한 효과들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 청구범위의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스(PEC)를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 동결건조 유무에 따른 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 입도 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 FT-IR 피크 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 TGA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 SEM-EDS 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 CLSM 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 SEM-EDS 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 내산성, 내담즙성 평가 전과 후의 PEC의 XRF 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 저장 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 변비 유도 동물모델을 준비한 실험 과정을 그린 모식도이다.
도 15는 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 개수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 중량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17은 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 수분 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 18는 변비 유도 동물모델에서 PEC가 소화관 이동률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 19는 PEC를 포함하는 액상 제제의 보관 기간에 따른 pH 및 장 도달률 변화를 나타낸 그래프이다.
도 2는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 동결건조 유무에 따른 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 입도 크기 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 FT-IR 피크 변화를 나타낸 그래프이다.
도 6은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 TGA 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 SEM-EDS 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 8은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 CLSM 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 9는 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 SEM-EDS 결과를 나타낸 그림이다.
도 10은 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 FT-IR 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 내산성, 내담즙성 평가 후의 PEC의 XRD 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 내산성, 내담즙성 평가 전과 후의 PEC의 XRF 분석 결과를 나타낸 그림이다.
도 13은 칼슘 용액 농도에 따른 PEC의 저장 안정성을 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 변비 유도 동물모델을 준비한 실험 과정을 그린 모식도이다.
도 15는 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 개수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 16은 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 중량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 17은 변비 유도 동물모델에서 PEC가 배변 수분 함량에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 18는 변비 유도 동물모델에서 PEC가 소화관 이동률에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 19는 PEC를 포함하는 액상 제제의 보관 기간에 따른 pH 및 장 도달률 변화를 나타낸 그래프이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스
본 발명은 탄산칼슘 및 프로바이오틱스를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 탄산칼슘은 바테라이트 또는 칼사이트인 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 프로바이오틱스는 Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC 3237), Bifidobacterium breve (KCTC 3419) 및 Lactococcus lactis subsp. lactis (KCTC 3769)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC 3237), Bifidobacterium breve (KCTC 3419) 및 Lactococcus lactis subsp. lactis (KCTC 3769)을 모두 포함하는 미생물 복합균주일 수 있다.
본 발명의 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 Probiotics encapsulated with calcium carbonate(PEC)으로 명명될 수 있으며, 상기 PEC의 입자 크기는 0.9 내지 9.2 μm일 수 있으며, 바람직하게는 1.5 내지 9.2 μm일 수 있고, 더욱 바람직하게는 7.0 내지 9.0 μm일 수 있다.
상기 PEC는 탄산칼슘의 함량이 17 내지 98%인 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 75 내지 98%인 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 상기 PEC의 프로바이오틱스와 탄산칼슘의 중량비는 1:0.2~17.6일 수 있으며, 바람직하게는 1:3~17.6일 수 있다.
상기 PEC는 FT-IR 분석시 유산균의 특징적인 피크인 3280 cm-1에서 OH의 신축진동 피크가 관찰될 수 있으며, 2927, 1636, 1036 cm-1에서 각각 CH, C=C, CO의 피크가 관찰될 수 있다. 또한, 상기 PEC는 FT-IR 분석시 탄산칼슘의 특징적인 피크인 1386, 872, 712 cm-1에서 피크가 관찰될 수 있다.
상기 PEC의 캡슐화 수율은 하기 식 1에 따라 계산될 수 있으며, 본 발명의 PEC는 96 내지 100%의 캡슐화 수율을 가질 수 있다.
[식 1]
E(%) = [ (N0-N1) ÷ N0 ] × 100
(상기 식 1에서 N0는 유산균 캡슐화 공정에 사용한 세포수(CFU/g), N1은 캡슐화 후 용액에 남아있는 세포수(CFU/g), 즉 캡슐 내에 안착하지 못한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
상기 PEC의 프로바이오틱스 함량(Log CFU/g)은 8 내지 11일 수 있다.
상기 PEC의 장 도달 개체수는 하기 식 2에 따라 계산될 수 있으며, 본 발명의 PEC는 제조시 사용된 칼슘 용액 농도에 따라 장 도달률이 상이할 수 있다. 보다 구체적으로, 50 내지 200 ppm, 그리고 60000 ppm의 칼슘 용액을 사용하여 제조된 PEC는 이의 장 도달 개체수가 8 내지 9.5 Log CFU/g일 수 있으며, 400 내지 40000 ppm의 칼슘 용액을 사용하여 제조된 PEC는 이의 장 도달 개체수가 10 내지 11 Log CFU/g일 수 있다.
[식 2]
I(%) = [ N2 ÷ (N0-N1) ] × 100
(상기 식 2에서 N2는 모의 위액 및 모의 장액 연속 테스트 후 최종 방출된 세포수(CFU/g)를 의미하고, N0-N1은 탄산칼슘으로 캡슐화한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
본 발명의 PEC에 있어서, 상기 PEC에 포함되는 탄산칼슘은 담즙과 반응하여 수산화인회석((Ca10(PO4)6(OH)2), hydroxyapatite)으로 전환되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 PEC에 있어서, 상기 PEC에 포함되는 탄산칼슘은 캡슐화제의 역할 뿐만 아니라 동결건조보호제의 역할까지 수행할 수 있다. 즉, 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는 캡슐화되지 않은 프로바이오틱스에 비해 동결건조시 유산균의 생존률이 높을 수 있다.
본 발명은 상기에서 기술한 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 프로바이오틱스 분말을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기에서 기술한 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 액상 제제에 첨가한 프로바이오틱스 액상 제제를 제공할 수 있으며, 상기 액상 제제는 우유 또는 pH를 7.5로 조절한 우유일 수 있다.
탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법
본 발명은 프로바이오틱스를 배양하는 단계; 및 칼슘 소스, 탄산 소스 및 상기 배양한 프로바이오틱스를 혼합하고 반응시켜 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제조하는 단계;를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법을 제공한다. 또한, 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하여 분말화하는 단계;를 더 포함할 수 있다.
상기 프로바이오틱스를 배양하는 단계는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스에 사용될 유산균 균주를 배양하는 단계로, 상기 프로바이오틱스는 Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물일 수 있으며, 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC 3237), Bifidobacterium breve (KCTC 3419) 및 Lactococcus lactis subsp. lactis (KCTC 3769)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물일 수 있고, 더욱 바람직하게는 Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC 3237), Bifidobacterium breve (KCTC 3419) 및 Lactococcus lactis subsp. lactis (KCTC 3769)을 모두 포함하는 미생물 복합균주일 수 있다.
상기 프로바이오틱스는 고압 멸균된 MRS broth 배지에 접종되어 35 내지 39℃에서 100 내지 300 rpm으로 48 내지 72시간 동안 배양 후 계대배양하여 사용할 수 있다.
상기 칼슘 소스, 탄산 소스 및 상기 배양한 프로바이오틱스를 혼합하고 반응시켜 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제조하는 단계는 칼슘 소스, 탄산 소스 및 프로바이오틱스를 혼합하고 교반하여 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스(PEC)를 제조하는 단계일 수 있다.
상기 칼슘 소스는 칼슘 용액일 수 있으며, 보다 구체적으로는 CaCl2, Ca(NO3)2, CaO 및 유기산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 칼슘 소스는 CaCl2일 수 있다. 상기 칼슘 소스의 농도는 50 내지 60000 ppm일 수 있으며, 바람직하게는 400 내지 40000 ppm일 수 있다.
상기 탄산 소스는 탄산 용액일 수 있으며, 보다 구체적으로는 Na2CO3, K2CO3, (NH4)2CO3 및 CO2(g)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 물질을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 탄산 소스는 Na2CO3일 수 있다. 상기 탄산 소스의 농도는 50 내지 60000 ppm일 수 있으며, 바람직하게는 400 내지 40000 ppm일 수 있다.
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하여 분말화하는 단계는 상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하여 프로바이오틱스 분말을 제조하는 단계일 수 있다. 상기 동결건조는 상기 PEC를 여과 후 -70 내지 -50℃에서 1시간 동안 급속냉동한 뒤, -90 내지 -60℃에서20 내지 28시간 동안 동결건조하는 것을 의미할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.
실시예 1. 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조
1-1. 균주 선정
본 발명의 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스(Probiotics encapsulated with calcium carbonate, PEC)을 제조하기 위해 실시예 1을 실시하였다. 상기 PEC를 제조하기 위해 사용된 균주는 총 5종으로, 보다 구체적으로 Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC 3237), Bifidobacterium breve (KCTC 3419) 및 Lactococcus lactis subsp. lactis (KCTC 3769)을 동일한 비율로 혼합하여 사용하였다. 상기 균주 5종은 한국생명공학연구원(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 제공받았다.
1-2. 프로바이오틱스 배양
상기 실시예 1-1에서 선정한 프로바이오틱스 균주 5종을 배양하기 위해 실시예 1-2를 실시하였다. 상기 프로바이오틱스 균주 5종을 유산균 배양배지에서 액상배양하였으며, 상기 배양배지는 DifoTM Lactobacilli MRS broth (Becton, Dickinson and Company, France), DifoTM Lactobacilli MRS Agar (Becton, Dickinson and Company, France), BL Agar(KisanBio, Seoul, Korea)를 배지로 사용하였다. 각 균체는 1010 CFU/mL 이상의 배양액으로 준비하였다.
다음으로, 55g의 MRS broth를 1L 증류수에 넣은 후 121℃에서 15분간 고압 멸균 후 균주를 접종하였으며, 상기 접종한 배지는 37℃, 200rpm 인큐베이터에서 48~72시간 동안 배양 후 1주일마다 계대배양하여 사용하였다. 상기 배양액은 원심분리기로 15000rpm, 5℃, 15분간 원심분리하였다. 상기 원심분리 후 상등액은 버리고 펠렛을 멸균증류수로 3번 세척한 후 실험에 사용하였다. 또한 프로바이오틱스의 생균수 측정을 위한 배지인 MRS Agar와 BL Agar는 1L 증류수에 각각 70g, 60.23g 첨가 후 121℃ 고압 멸균기에서 15분간 멸균 후 4℃에 보관하여 사용하였다.
1-3. PEC 제조
상기 실시예 1-2에서 배양한 균주 5종과 칼슘 용액 및 탄산 용액을 혼합하여 PEC를 제조하였으며, 이 때 혼합한 균주(유산균) 수는 10.16 Log CFU/g였다. 상기 CaCl2, Na2CO3 및 배양한 균주를 혼합한 혼합물을 마그네틱바를 이용해 800rpm에서 교반하여 PEC를 제조하였다.
1-4. PEC 분말의 제조
상기 실시예 1-3에서 제조된 PEC를 동결건조하여 분말화하기 위해 실시예 1-4를 실시하였다. 상기 실시예 1-3에서 제조된 PEC 용액을 0.45 μm 멤브레인 필터(MCE04547A, HYUNDAI Micro Co,)로 여과 후, -60℃ 냉동고에서 4시간 동안 급속냉동하였다. 이후 freeze dryer (Operon, OPR-FDU-8606, Korea)를 사용하여 5 mbar, -80℃ 조건의 압력하에 24시간 동안 건조하였다. 상기 동결건조 과정을 통해 PEC 분말을 제조하였다. 상기 실시예 1-1 내지 1-4에서 개시한 PEC의 제조과정을 도 1에 모식도로 나타내었다.
실험예 1. PEC의 XRD 분석
1-1. 칼슘 용액 농도에 따른 탄산칼슘 형태 변화
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 탄산칼슘 형태 변화를 알아보기 위해 실험예 1-1을 실시하였다. 상기 실험예 1-1에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 칼슘 용액을 농도별로 제조한 PEC의 XRD 피크는 X선 회절(X-ray Diffractometer, XRD, Smart lab, Rigaku)을 사용하여 분석되었다. 상기 XRD 분석 결과는 도 2에 그래프로 나타내었다.
상기 실험예 1-1의 결과, 상기 PEC에서 프로바이오틱스를 캡슐화한 물질이 칼사이트와 바테라이트 결정 형태의 탄산칼슘임을 확인하였다. 상기 도 2를 참조하면, 칼사이트의 특징적인 피크(●로 표시)와 바테라이트의 특징적인 피크(◆로 표시)가 같이 확인되었으며, 칼슘 용액 농도가 낮아질수록 상기 칼사이트의 특징적인 피크의 강도가 높아지고, 바테라이트의 특징적인 피크의 강도는 낮아졌다.
1-2. 동결건조 유무에 따른 탄산칼슘 형태 변화
동결건조 유무에 따른 탄산칼슘 XRD 피크의 변화를 알아보기 위해 실험예 1-2를 실시하였다. 상기 실험예 1-2에서는 프로바이오틱스를 캡슐화하는 탄산칼슘이 칼사이트인 PEC와 바테라이트인 PEC로 나누어서 실험하였으며, 상기 두가지 PEC를 동결건조 유무에 따라 탄산칼슘의 XRD 피크를 비교하였다. 상기 동결건조는 상기 실시예 1-4와 동일하게 실시하였으며, 상기 XRD 분석은 상기 실험예 1-1과 동일하게 실시하였다. 상기 실험예 1-2의 결과는 도 3에 그래프로 나타내었으며, 보다 구체적으로는 바테라이트형 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하지 않은 샘플의 XRD는 도 3a에, 바테라이트형 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 샘플의 XRD는 도 3b에, 칼사이트형 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하지 않은 샘플의 XRD는 도 3c에, 칼사이트형 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 샘플의 XRD는 도 3d에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 1-2의 결과, 동결건조의 유무에 따라 PEC의 XRD 피크가 변하지 않는 것을 확인하였다. 즉, 동결건조 전과 후에 있어서, PEC의 형태 및 함량 변화는 관찰되지 않았다.
실험예 2. PEC의 입도 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 입도를 분석하기 위해 실험예 2를 실시하였다. 상기 실험예 2에서 칼슘 용액을 50, 100, 200, 400, 2000, 4000, 20000, 40000 또는 60000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 칼슘 용액을 농도별로 제조한 PEC의 입도 크기는 Particle Size Analyzer (PSA, Mastersizer 3000, Malvern, UK)를 이용하여 측정하였다. 상기 실험예 2의 결과는 도 4에 그래프로 나타내었다.
상기 실험예 2의 결과, 칼슘 용액 농도에 따라 입도 크기의 차이는 존재하지만 PEC의 입도 크기(D50)는 0.9 내지 9.2 μm였다. 칼슘 용액 농도에 따른 입도 분포는 하기 표 1에 기재하였다.
실험예 3. PEC의 FT-IR 분석
PEC의 FT-IR을 분석하기 위해 실험예 3을 실시하였다. 상기 실험예 3에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 칼슘 용액을 농도별로 제조한 PEC의 FT-IR은 Fourier-transform infrared spectrometer (FT-IR, iS50, Thermo Fisher Scientific, USA)을 사용하여 분석되었으며, 500~4000 cm-1의 스펙트럼 영역에서 분석되었다. 또한, 상기 실험예 3에서는 비교군으로 칼사이트, 바테라이트 및 프로바이오틱스의 FT-IR도 함께 분석하였다. 상기 FT-IR 분석 결과는 도 5에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 3의 결과, 상기 PEC의 스펙트럼에서 3280 cm-1 에서 OH의 신축진동 피크가 나타났으며, 2927, 1636, 1036 cm-1 에서 각각 CH, C=C, CO의 피크가 관찰되었다. 상기 피크는 모두 유산균에 나타나는 특징이며, 칼슘용액의 농도가 증가할수록 해당 피크의 강도가 감소하였고 칼슘농도가 20000 ppm 이상일 때는 피크가 거의 관찰되지 않았다.
또한, 칼슘용액 농도가 증가함에 따라 스펙트럼의 1386, 872, 712 cm-1에서 피크의 강도가 증가하는 경향을 보였으며, 상기 피크는 모두 탄산칼슘에 나타나는 특징이다. 특히 칼슘농도가 20000 ppm 이상일 때는 PEC의 해당 피크의 강도가 비교군인 탄산칼슘과 비슷했다. 따라서 상기 PEC에는 탄산칼슘과 프로바이오틱스가 함께 포함되어 있음을 FT-IR 결과를 통해 확인하였다.
실험예 4. PEC의 TGA 분석
PEC에 포함된 탄산칼슘과 프로바이오틱스의 함량 비율을 알기 위해 실험예 4에서 TGA(Thermogravimetric analysis) 분석을 수행하였다. 상기 실험예 4에서 칼슘 용액을 50, 100, 200, 400, 2000, 4000, 20000, 40000 또는 60000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 TGA 분석은 Thermogravimetric Analysis (TGA, TGA 7, Perkin Elmer, USA)를 이용하여 측정되었으며, 20℃/min의 승온 속도로 50-900℃ 범위 내의 중량 감소량을 측정하였다. 유기물의 비등점은 250-500℃이고, 탄산칼슘의 경우 500~820℃ 범위에서 연소한다고 알려져 있다. 따라서 칼슘농도가 낮은 용액으로 제조된 PEC일수록 250-500℃에서 중량 감소가 더 크게 나타난다. 이러한 원리로, 상기 측정한 값을 하기 식 3을 이용해서 PEC의 탄산칼슘 함량을 계산하였으며, 상기 실험예 4의 결과는 도 6에 그래프로 나타내었다.
[식 3]
(상기 식 3에서 WCO2는 CO2의 중량 감소(%)를, MWCaCO3는 CaCO3의 몰질량(g/mol)을, MWCO2는 CO2의 몰질량(g/mol)을 의미한다.)
본 실험예 4의 결과, 상기 PEC의 탄산칼슘 함량은 17~98%였으며, 보다 구체적으로 프로바이오틱스와 탄산칼슘의 중량비는 1:0.2 ~ 1:17.6으로 확인되었다. 상기 PEC의 칼슘 용액 농도에 따른 탄산칼슘 함량 및 프로바이오틱스와 탄산칼슘의 비율을 하기 표 2에 기재하였다.
실험예 5. PEC의 SEM-EDS 및 XRF 분석
5-1. SEM-EDS mapping
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 표면성분 및 모양을 확인하기 위해 실험예 5-1을 실시하였다. 상기 실험예 5-1에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 칼슘 용액 농도별로 제조한 PEC의 표면성분 및 모양은 주사전자현미경(SUPRA-40VP, FE-SEM/EDS, ZEISS) 및 Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) mapping을 사용하여 분석되었다. 상기 실험예 5-1의 결과는 도 7에 그래프로 나타내었으며, 보다 구체적으로 상기 도 7a, 7b, 7c, 7d 및 7e는 각각 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 및 40000 ppm 농도만큼 사용하여 제조한 PEC의 SEM-EDS 결과를 기재하였다.
본 실험예 5-1의 결과, 주요 검출 원소인 Ca, C, O가 탄산칼슘과 PEC에서 모두 검출되었다. 또한, 칼슘농도가 2000-40000 ppm인 용액에서 제조된 PEC의 경우 표면에 많은 양의 Ca이 균일하게 분산되어 있는 것을 확인했으나, 칼슘농도가 400 ppm인 용액에서 제조된 PEC의 표면에는 Ca이 거의 없는 것을 확인하였다. 이와 같이 PEC의 표면에 Ca의 양이 적은 이유는 상대적으로 다량의 유기물이 PEC 표면에 존재하게 되어 C와 O가 많이 보이기 때문이다.
5-2. XRF 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 성분을 확인하기 위해 실험예 5-2를 실시하였다. 상기 실험예 5-2에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 제조된 PEC는 X선 형광(X-Ray Fluorescence Spectrometer, XRF, SHIMADZU, XRF-1800)를 이용하여 분석되었다. 상기 실험예 5-2의 결과는 하기 표 3에 기재하였다.
본 실험예 5-2의 결과, PEC에 포함되어 있는 프로바이오틱스의 성분인 P, K, Na, Mn 존재가 상기 실험예 5-1의 SEM-EDS 결과에서는 검출되지 않았으나, XRF 결과에선 검출되었다. 이는 PEC 내부에 프로바이오틱스가 포함된 것을 뒷받침한다. 특히 K, Na, Mn 은 탄산칼슘의 XRF 결과에선 검출되지 않았으나 PEC에선 검출되어 프로바이오틱스가 탄산칼슘 내부에 캡슐화 되었다는 명확한 근거로 작용할 수 있다.
실험예 6. PEC의 CLSM 분석
PEC 내부에 캡슐화된 프로바이오틱스의 생존 여부를 확인하기 위해 상기 실험예 6에서 CLSM 분석을 실시하였다. 상기 실험예 6에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 칼슘 용액 농도별로 제조한 PEC 내부 균의 생존여부는 Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM, LSM 800, ZEISS)를 사용하였으며, 균의 생존여부는 LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit (Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 이용하여 분석하였다. 상기 LIVE/DEAD Kit는 Syto9과 propidium iodide(PI)로 구성된다. 상기 Syto9은 막투과성이므로 세포막을 통과하여 핵산에 염색되어 녹색 형광을 나타내지만, 상기 PI는 막비투과성이므로 세포막이 손상된 균의 핵산에 염색되고 붉은 형광을 나타낸다. 따라서 Syto9과 PI를 혼합하여 염색 시 살아있는 균은 Syto9에 의해 녹색으로 염색되고, 죽은 균은 PI에 의해 붉은색으로 염색된다. 또한 상기 실험예 6에서 비교군은 상기 탄산칼슘으로 캡슐화하지 않은 프로바이오틱스를 동결건조하여 사용하였다. 상기 실험예 6의 결과는 도 8에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 6의 결과, 칼슘 용액의 농도에 상관없이 PEC 내부에 프로바이오틱스가 캡슐화된 것을 확인했으며, 전체적으로 죽은 균을 나타내는 적색(PI)은 보이지 않고 살아있는 균을 나타내는 녹색(Syto9)이 대부분 관찰되었다. 이는 캡슐화된 프로바이오틱스 대부분이 사멸하지 않고 생존한다는 것을 의미한다.
반면 대조군(control)으로 설정한 탄산칼슘으로 캡슐화하지 않고 동결건조한 프로바이오틱스는 생균:사균의 비율이 1:1 정도로 나타났다. 따라서 본 발명의 PEC에 있어서, 탄산칼슘은 프로바이오틱스 캡슐화제 역할뿐만 아니라 동결건조보호제 역할까지 했음을 보여준다.
실험예 7. PEC의 캡슐화 수율 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 캡슐화 수율을 확인하기 위해 실험예 7을 실시하였다. 상기 실험예 7에서 칼슘 용액을 50, 100, 200, 400, 2000, 4000, 10000, 20000, 40000 또는 60000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 제조한 PEC에 대해 한 시료당 2회씩 배지배양법으로 캡슐화 수율을 계산하였다. 보다 구체적으로, 상기 제조한 PEC 용액을 멸균 증류수와 1:9 (g:mL)의 비율로 혼합하여 희석한 후 아가(agar) 배지에 도말하여 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 이후, 생균 수를 측정하였으며, 상기 캡슐화 수율은 하기 식 1에 따라 계산되었다. 상기 실험예 7의 결과는 하기 표 4에 기재하였다.
[식 1]
E(%) = [ (N0-N1) ÷ N0 ] × 100
(상기 식 1에서 E(%)는 캡슐화 수율, N0는 유산균 캡슐화 공정에 사용한 세포수(CFU/g), N1은 캡슐화 후 용액에 남아있는 세포수(CFU/g), 즉 캡슐 내에 안착하지 못한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
본 실험예 7의 결과, 사용한 칼슘용액의 농도에 따라 약간의 차이는 존재하지만 모든 PEC에 대해서 97% 이상의 캡슐화 수율을 얻었다. 또한, 모든 PEC의 프로바이오틱스 함량(Log CFU/g)은 10.14-10.16이었다.
실험예 8. PEC의 장 도달률 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 장 도달률을 확인하기 위해 실험예 8을 실시하였다. 상기 실험예 8에서 칼슘 용액을 50, 100, 200, 400, 2000, 4000, 10000, 20000, 40000 또는 60000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다.
상기 제조된 PEC가 위장을 거쳐 장에서 방출되는 생균수를 측정하기 위해 모의위액과 모의장액을 가지고 내산성(Acid tolerance) 및 내담즙성(Bile tolerance) 테스트를 연속적으로 진행하였다. 상기 모의위액은 0.2%(w/v) NaCl 용액의 pH 값을 2로 조정하는 것을 기반으로 하고 위의 단식 조건을 시뮬레이션 하기 위해 1N HCl을 첨가하여 제조하였다. 그 후 3.2g의 펩신을 첨가하여 모의위액을 제조하였다. 상기 모의장액은 0.05M KH2PO4 용액의 pH 값을 1M NaOH를 사용하여 7.2로 조정하여 제조하였다.
상기 모의위액에 PEC를 첨가한 후 37℃의 진탕 배양기에서 200rpm으로 2시간 동안 반응시켰으며, 이후 0.45 μm 멤브레인(MCE04547A, HYUNDAI Micro Co,)로 여과된 고체를 모의장액에 첨가하였다. 모의장액테스트도 모의위액테스트와 동일한 조건에서 반응시켰으며, 두가지 테스트를 연속적으로 거친 용액을 희석하여 Agar 배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 상기 장 도달률은 PEC가 위액과 담즙을 거쳐 장 내에서 방출되는 유산균의 양과 관련있으므로, 하기 식 2에 따라 계산하였다. 상기 실험예 8의 결과는 하기 표 5에 기재하였다.
[식 2]
I(%) = [ N2 ÷ (N0-N1) ] × 100
(상기 식 2에서 N2는 모의 위액 및 모의 장액 연속 테스트 후 최종 방출된 세포수(CFU/g)를 의미하고, N0-N1은 탄산칼슘으로 캡슐화한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
본 실험예 8의 결과, 칼슘농도가 400-40000 ppm인 용액을 사용하여 제조한 PEC의 장 도달률은 Log CFU/g 기준 10-17-10.43이었으며, 100억 CFU 이상의 유산균이 장에서 생균 상태로 방출됨을 확인하였다.
칼슘농도가 400-40000 ppm인 PEC에서 유산균 주입량 대비 100% 이상, 개체수로는 100억 CFU/g 이상의 프로바이오틱스가 장에서 생균 상태로 방출됨을 확인하였다. 식약처 기준, 1일 프로바이오틱스 권장 섭취량 범위가 Log CFU/g 기준, 8 내지 10 인 것을 고려할 때, 섭취량이 아닌 장 도달량이 Log CFU/g 기준, 8.17 내지 10.43에 이르는 본 결과는 본 연구에서 개발한 PEC 성능이 매우 우수함을 나타낸다.
실험예 9. PEC의 장 도달 메커니즘 분석
9-1. SEM-EDS 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 장 도달 메커니즘을 확인하기 위해 실험예 9-1에서 내산성(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 내담즙성(Simulated Intestinal Fluid, SIF) 평가 후 PEC를 SEM-EDS로 관찰하였다. 상기 실험예 9-1에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 다음으로 상기 실험예 8과 동일하게 내산성 및 내담즙성 평가를 실시하고, 상기 실험예 5-1과 동일하게 SEM-EDS로 PEC의 모양을 관찰하였다. 상기 실험예 9-1의 결과는 도 9에 그림으로 나타내었다.
본 실험예 9-1의 결과, 내산성 평가 후에는 PEC 모양의 변화가 거의 없으나, 내담즙성 평가 후에 PEC의 모양이 수산화인회석((Ca10(PO4)6(OH)2), hydroxyapatite)의 독특한 모양인 작은 바늘 모양(small needle shape)으로 변한 것을 확인하였다. 또한 EDS 분석결과를 보면, 내담즙성 평가 후 얻은 모든 고체의 겉표면에 인(P)이 고르게 분포하고 있는 것을 확인하였다.
9-2. FT-IR 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 장 도달 메커니즘을 확인하기 위해 실험예 9-2에서 내산성(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 내담즙성(Simulated Intestinal Fluid, SIF) 평가 후 PEC를 FT-IR으로 분석하였다. 상기 실험예 9-2에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 다음으로 상기 실험예 8과 동일하게 내산성 및 내담즙성 평가를 실시하고, 상기 실험예 3과 동일하게 FT-IR로 PEC의 피크를 관찰하였다. 상기 실험예 9-2의 결과는 도 10에 그림으로 나타내었다.
본 실험예 9-2의 결과, 상기 칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 탄산칼슘은 평소 칼사이트 또는 바테라이트의 형태로 존재하나, 내담즙성 평가 후 탄산칼슘과 수산화인회석으로 존재하는 것을 확인하였다. 보다 구체적으로, 칼사이트의 특징인 1386 cm-1, 878 cm-1 에서의 피크 강도가 감소하고, P-O bond에 해당하는 피크가 1048 cm-1 과 565-600 cm-1 에 나타나는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 담즙액에서 하기 식 4의 반응이 진행되면서 탄산칼슘이 수산화인회석((Ca10(PO4)6(OH)2), hydroxyapatite)로 전환되고, 탄산칼슘이 분해되는 과정에서 유산균이 방출된다고 사료된다.
[식 4]
10CaCO3(s) + 6H2PO4 - → Ca10(PO4)6(OH)2(s) + 6HCO3 - + 4CO2 + 2H2O
9-3. XRD 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 장 도달 메커니즘을 확인하기 위해 실험예 9-3에서 내산성(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 내담즙성(Simulated Intestinal Fluid, SIF) 평가 후 PEC를 XRD로 분석하였다. 상기 실험예 9-3에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 다음으로 상기 실험예 8과 동일하게 내산성 및 내담즙성 평가를 실시하고, 상기 실험예 1-1과 동일하게 PEC의 XRD을 관찰하였다. 상기 실험예 9-3의 결과는 도 11에 그림으로 나타내었으며, 도 11a는 PEC의 XRD 피크 분석 결과이고, 도 11b는 내담즙성 평가 후 PEC의 XRD 피크 분석 결과이다.
본 실험예 9-3의 결과, 내담즙성 평가 후 PEC의 탄산칼슘의 피크 강도가 감소하고, 수산화인회석((Ca10(PO4)6(OH)2), hydroxyapatite)의 피크가 나타났다.
9-4. XRF 분석
칼슘 용액을 농도별로 달리하여 제조한 PEC의 장 도달 메커니즘을 확인하기 위해 실험예 9-4에서 내산성(Simulated Gastric Fluid, SGF) 및 내담즙성(Simulated Intestinal Fluid, SIF) 평가 후 PEC를 XRF로 분석하였다. 상기 실험예 9-4에서 칼슘 용액을 400, 2000, 4000, 20000 또는 40000 ppm으로 농도별로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 다음으로 상기 실험예 8과 동일하게 내산성 및 내담즙성 평가를 실시하고, 상기 실험예 5-2와 동일하게 PEC의 XRF를 관찰하였다. 상기 실험예 9-4의 결과는 도 12에 그림으로 나타내었다.
본 실험예 9-4의 결과, PEC 제조에 사용된 칼슘용액 농도가 2000 ppm 이상인 용액에서 제조된 PEC의 P 함량은 0-1.4%인데, SIF test 후 얻은 고체의 P 함량은 11.9-15.6%로 크게 증가하였다.
상기 실험예 9-1 내지 9-4의 결과를 종합하면, 본 발명의 PEC에 포함된 탄산칼슘은 칼사이트 또는 바테라이트의 형태로 평소에 존재하나, 내산성 평가 이후에 모두 칼사이트의 형태로 존재하고, 내담즙성 평가 이후에 상기 칼사이트가 수산화인회석으로 변환된다고 사료된다. 상기 PEC의 탄산칼슘이 분해되어 수산화인회석으로 변환되면서 유산균이 방출된다.
실험예 10. PEC의 저장 안정성 평가
PEC의 저장 안정성을 평가하기 위해 실험예 10를 실시하였다. 상기 실험예 10에서 칼슘 용액을 10000, 20000 또는 40000 ppm으로 사용하여 제조한 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일하게 PEC를 제조하였다. 상기 제조한 PEC를 총 4주 동안 가혹조건(40℃, 습도 70%)에서 보관하면서 1주마다 장 도달률 테스트를 진행하여 생균수를 비교하였다. 상기 실험예 10에서 장 도달률 테스트는 상기 실험예 8과 동일하게 실시하였다. 상기 장 도달률 테스트 시, 탄산칼슘으로 캡슐화하지 않은 유산균(Control)과 탄산칼슘으로 캡슐화한 실험군으로 나누어서 실험하였다. 상기 실험예 10의 결과는 도 13에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 10의 결과, 가혹조건에서 4주 동안 보관한 후 장 도달률은 9.93-10.63 Log CFU/g 으로 저장 안정성이 전체적으로 높았다. 특히 칼슘농도가 10000 ppm 일 때, 4주 후 장 도달률이 10.63 Log CFU/g 이었는데, 이것은 주입한 모든 유산균이 가혹조건에서 4주 동안 생존한다는 의미이다.
실험예 11. PEC의
in vivo
효능 검증
PEC의 효능을 in vivo 동물 실험을 통해 검증하기 위해 실험예 11을 실시하였다. 보다 구체적으로, 로페라마이드(loperamide)에 의해 유도된 변비 동물 모델에서 PEC가 배변 개수, 배변 중량, 수분함량, 소화관 이동률에 미치는 영향을 확인하기 위해, 변비 유도 전과 후에 PEC 투여가 각 변수에 미치는 영향을 확인하였다.
11-1. PEC가 배변 개수에 미치는 영향 분석
로페라마이드는 배변의 배출 시간 연장을 촉진시키고 장의 수분 분비를 억제시켜 결과적으로 배변 개수 및 배변 중량을 감소시킨다고 알려져 있다. 이에, 로페라마이드에 의해 유도된 변비 동물 모델에서, PEC가 배변 개수에 미치는 영향을 확인하기 위해, 변비 유도 전과 후의 PEC 투여로 인한 배변 개수 변화를 확인하였다.
실험동물은 특정 병원균이 없는 SPF(Specific-pathogen free) 상태의 6주령의 SD 수컷 쥐를 분양받아 7일간 순화시켜 사용하였다. 순화 기간 중 식이는 일반 고형사료를 공급하였으며, 음수는 필터링된 음용수를 자유롭게 섭취하도록 하였다. 순화기간이 끝난 실험동물은 체중 값을 기준으로 난괴법을 사용하여 군간 평균값이 균일하도록 분리하였다. 상기 실험예 11-1에서는 실험동물을 정상군(Normal group), 대조군(Control group), PEC 15 mg/kg 투여군(PEC-15), PEC 50 mg/kg 투여군(PEC-50) 및 PEC 150 mg/kg 투여군(PEC-150)으로 구분하여 군당 10마리씩 사용하였다.
상기 실험동물 군 별로 PEC 시료를 6주간 전처리한 후 8일간 로페라마이드를 3 mg/kg 농도로 1일 2회 투여하였고, PEC는 농도별로 1일 1회씩 경구 투여하여 변비 유도 동물 모델을 제작하였다. 상기 변비 유도 동물 모델 제작 방법을 도 14에 그림으로 나타내었다.
6주의 전처리 기간에는 주 1회마다 1일간의 배변 개수를 측정하였고, 로페라마이드를 투여하는 변비 유도 기간에는 2일 간격으로 1일간의 배변 개수를 측정하였다. 상기 실험예 11-1의 결과는 도 15에 그래프로 나타내었다.
이하, 본 실험예 11-1의 결과를 상세히 설명한다.
시료 전처리에 따른 실험군별 배변 수는 정상군이 50.3±2.1개, 대조군이 50.2±3.4개, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 48.5±0.9개, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 48.9±0.6개, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 55.0±1.0개로 나타났다. 즉, PEC-150 군에서 가장 배변 개수가 많았다.
반면, 실험 종료 시점인 8일차의 실험군별 배변 수는 정상군이 53.3±0.2개, 대조군이 25.3±1.4개, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 34.3±1.1개, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 40.6±0.8개, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 43.9±2.4개로 나타났다.
즉, 대조군은 변비 유도로 인해 배변 개수가 시간이 지날수록 감소되는 반면, PEC를 투여한 실험군은 변비 유도 기간동안 대조군의 배변 개수에 비해 모두 유의하게 높은 것으로 확인되었다(도 15).
11-2. PEC가 배변 중량에 미치는 영향 분석
로페라마이드에 의해 유도된 변비 동물 모델에서, PEC가 배변 중량에 미치는 영향을 확인하기 위해, 변비 유도 전과 후의 PEC 투여로 인한 배변 중량 변화를 확인하였다.
실험예 11-2에서는 상기 실험예 11-1과 동일하게 실험을 진행하였다. 단, 실험예 11-2에서는 배변 중량을 측정하였고, 이외의 실험 방법은 모두 실험예 11-1과 동일하다. 상기 실험예 11-2의 결과는 도 16에 그래프로 나타내었다.
이하, 실험예 11-2의 결과를 상세히 설명한다.
시료 전처리 기간동안의 배변 중량은 6주차를 기준으로 정상군이 11.3±0.2 g/day, 대조군이 13.1±1.4 g/day, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 11.8±0.7 g/day, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 13.3±0.7 g/day, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 12.4±0.8 g/day로 나타났다. 시료 전처리 기간동안은 실험군간 배변 중량이 유의한 차이를 보이지는 않았다.
반면, 실험 종료 시점인 8일차의 실험군별 배변 수는 정상군이 13.5±0.1 g/day, 대조군이 8.2±0.4 g/day, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 10.0±0.3 g/day, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 10.7±0.2 g/day, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 12.4±0.5 g/day로 나타났다.
즉, 대조군의 배변 중량이 가장 낮았으며, PEC를 투여한 실험군 모두에서 대조군에 비해 배변 중량이 유의하게 높은 것으로 확인되었다(도 16).
11-3. PEC가 배변 수분 함량에 미치는 영향 분석
로페라마이드에 의해 유도된 변비 동물 모델에서, PEC가 배변 수분 함량에 미치는 영향을 확인하기 위해, 변비 유도 전과 후의 PEC 투여로 인한 배변 수분 함량 변화를 확인하였다.
실험예 11-3에서는 상기 실험예 11-1과 동일하게 실험을 진행하였다. 단, 실험예 11-3에서는 배변 수분 함량을 측정하였고, 이외의 실험 방법은 모두 실험예 11-1과 동일하다. 상기 배변 수분 함량은 식 5와 같이 회수된 변을 70℃ 건조기에 24시간 동안 건조시킨 뒤, 상기 건조한 변의 중량을 측정하여 수분함량을 계산하였다. 상기 실험예 11-3의 결과는 도 17에 그래프로 나타내었다.
[식 5]
배변 수분 함량(%) = (배변 중량 - 건조된 배변 중량)/배변 중량 × 100
이하, 실험예 11-3의 결과를 상세히 설명한다.
본 실험예 11-3의 결과, 변비 유도 전후에 따른 배변 수분 함량은 현저한 차이를 보였다. 실험 종료 시점인 8일차에 각 실험군의 배변 수분 함량은 정상군이 58.9±0.7%, 대조군이 38.3±2.0%, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 45.7±2.7%, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 46.2±2.4%, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 49.7±2.4%로 나타났다. 즉, 대조군에 비해 모든 PEC 투여군의 배변 수분 함량이 유의하게 높았다(도 17).
11-4. PEC가 소화관 이동률에 미치는 영향 분석
로페라마이드에 의해 유도된 변비 동물 모델에서, PEC가 소화관 이동률에 미치는 영향을 확인하기 위해, 변비 유도 전과 후의 PEC 투여로 인한 소화관 이동률을 확인하였다. 실험예 11-4에서는 상기 실험예 11-1과 동일하게 실험 동물을 준비하고, PEC를 투여하고, 변비 유도 모델을 준비하였다.
상기 실험동물은 소화관 이동률 측정을 위해 16시간 절식 후 10% 황산바륨을 경구 투여하였으며, 70분이 경과된 시점에 부검을 실시하였다. 부검시 장을 적출하여 소화관 이동률을 분석하였다. 상기 실험예 11-4의 결과는 도 18에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 11-4의 결과, 각 실험군별 소화관 이동률은 정상군이 86.16+0.97%, 대조군이 71.70±2.99%, 유산균 저농도 투여군(PEC-15)이 74.93±1.43%, 유산균 중농도 투여군(PEC-50)이 79.80±2.77%, 유산균 고농도 투여군(PEC-150)이 83.11±2.10%로 나타났다. 즉, PEC를 투여한 실험군에서 소화관 이동률이 대조군에 비해 증가하였으며, PEC-150군의 경우 정상군과 유사한 수치를 보여 장내 운동성이 로페라마이드를 투여하지 않은 실험군 수준으로 회복되는 것을 확인하였다(도 18).
실시예 2. 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 포함하는 액상 제제의 제조
탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스(Probiotics encapsulated with calcium carbonate, PEC)를 포함하는 액상 제제를 제조하기 위해 실시예 2를 실시하였다. 먼저, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 PEC를 제조하였다. 상기 실시예 2에서 사용한 액상 제제는 2가지로, 우유와 pH를 7.5로 조절한 우유를 사용하였다. 상기 pH를 7.5로 조절한 우유는 우유에 0.125 wt%의 탄산칼슘을 첨가하여 pH를 7.5로 조절하였다. 상기 2가지 액상 제제에 각각 1 wt%(0.1g PEC/10mL 용액)의 PEC를 투입하고, 2~10℃의 저온에서 10분간 교반하여 4℃ 냉장고에 4주 동안 보관하였다.
실험예 12. PEC를 포함하는 액상 제제의 pH 및 장 도달률 변화
상기 실시예 2에서 제조한 PEC를 포함하는 액상 제제의 보관 기간에 따른 pH 및 장 도달률의 변화를 알아보기 위해 실험예 12를 실시하였다. 상기 장 도달률은 상기 실험예 8과 동일한 방법으로 측정되었으며, 상기 실험예 12의 결과는 도 19에 그래프로 나타내었다.
본 실험예 12의 결과, 4주가 경과함에도 불구하고 대부분의 프로바이오틱스가 생존하였으며, 액상 제제 종류에 따른 장 도달률 차이는 거의 없었다. 또한, 상기 PEC를 포함하는 액상 제제를 4℃에서 4주 동안 보관했을 때 11.6 내지 11.9 Log CFU/g의 생균이 장에서 방출된 결과로 보아, 상기 PEC를 액상 제제에 넣어서 산업화하기에 적합함을 확인하였다.
이상 설명으로부터, 본 발명에 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다.
Claims (16)
- 탄산칼슘; 및 프로바이오틱스;를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 프로바이오틱스는
Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는
입자 크기가 0.9 내지 9.2 μm인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는
탄산칼슘의 함량이 17 내지 98%인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는
장 도달 개체수가 8 내지 11 Log CFU/g인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘은
담즙과 반응하여 수산화인회석(hydroxyapatite)으로 전환되는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
- 제1항에 있어서,
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스는
캡슐화 수율이 96 내지 100%인 것을 특징으로 하고,
상기 캡슐화 수율은 하기 식 1로 계산되는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스.
[식 1]
E(%) = [ (N0-N1) ÷ N0 ] × 100
(상기 계산식에서 E(%)는 캡슐화 수율, N0는 유산균 캡슐화 공정에 사용한 세포수(CFU/g), N1은 캡슐화 후 용액에 남아있는 세포수(CFU/g), 즉 캡슐 내에 안착하지 못한 세포수(CFU/g)를 의미한다.)
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조한 프로바이오틱스 분말.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 액상 제제에 첨가한 프로바이오틱스 액상 제제.
- 프로바이오틱스를 배양하는 단계; 및
칼슘 소스, 탄산 소스 및 상기 배양한 프로바이오틱스를 혼합하고 반응시켜 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 제조하는 단계;를 포함하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법은
상기 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스를 동결건조하여 분말화하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 칼슘 소스는
CaCl2, Ca(NO3)2, CaO 및 유기산칼슘으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 칼슘 소스인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 탄산 소스는
Na2CO3, K2CO3, (NH4)2CO3 및 CO2(g)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 탄산 소스인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 프로바이오틱스는
Lactiplantibacillus plantarum subsp.plantarum (KCTC3108), Lacticaseibacillus casei (KCTC3110), Limosilactobacillus fermentum (KCTC3112), Bifidobacterium longum subsp. longum (KCTC3128), Lactobacillus gasseri (KCTC3144), Lactobacillus acidophilus (KCTC3164), Lactobacillus paragasseri (KCTC3172), Lacticaseibacillus rhamnosus (KCTC3237), Bifidobacterium breve (KCTC3419), Limosilactobacillus reuteri (KCTC3594), Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (KCTC3635), Lactococcus lactis subsp.lactis (KCTC3769), Enterococcus faecalis (KCTC5191), Bifidobacterium animalis subsp.lactis (KCTC5854), Enterococcus faecium (KCTC13225) 및 Lactobacillus helveticus (KCTC15060)으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물을 포함하는 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 칼슘 소스는
농도가 50 내지 60000 ppm인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
- 제10항에 있어서,
상기 탄산 소스는
농도가 50 내지 60000 ppm인 것을 특징으로 하는 탄산칼슘으로 캡슐화된 프로바이오틱스의 제조방법.
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| KR20150056107A (ko) | 2013-11-14 | 2015-05-26 | 주식회사농심 | 코팅 유산균의 제조방법 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024071829A1 (ko) | 2024-04-04 |
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