CN113430144B - 一种耐酸的和繁殖力强的干酪乳杆菌的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌的制备方法及其应用，属于微生物技术领域。本发明通过将干酪乳杆菌接种到加入了5’鸟苷酸二钠的MRS液体培养基中，在30‑37℃条件下培养10‑48h，获得耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌。所得的干酪乳杆菌生物被膜的产生及胞外聚合物的分泌增加，增强干酪乳杆菌对外界不利环境的抗性，从而增强细菌的存活率，本发明为提高干酪乳杆菌的存活率提供了一种新思路，并且扩展了干酪乳杆菌在食品和保健食品上的应用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌的制备方法及其应用。
背景技术
益生菌是通过定殖在人体内，对人体健康有重要作用的活性微生物。研究发现，益生菌在调节肠道菌群平衡、促进营养吸收、保持肠道健康等方面具有重要的作用。但是益生菌在加工销售过程中以及通过消化道时容易失活，达不到其发挥功能的剂量，因此需要寻找合适的益生元物质来促进其生长繁殖或者增强其抵御外界不良环境的能力。
核苷酸是细胞的重要组成成分，是DNA和RNA的前体，在细胞的代谢、蛋白质合成和细胞分裂等过程中起到重要作用。此外，核苷酸在一些特定条件下，如疾病、快速生长发育、营养摄入受限以及内源性合成和表达受阻时，会使核苷酸成为机体的“必需营养素”。然而，将核苷酸用于制备耐酸的和繁殖能力强的益生菌的相关研究还未见报道。
发明内容
本发明针对上述问题，提供一种耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌的制备方法及其应用。基于群体感应系统研究外源核苷酸对干酪乳杆菌耐酸和繁殖能力的影响，并以干酪乳杆菌的LuxS蛋白为靶点，探究外源核苷酸的作用机制。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌的制备方法，主要包括以下步骤：
(1)将甘油保护剂中保存的干酪乳杆菌接入MRS液体培养基中活化后连续培养2代以上，获得干酪乳杆菌菌液；
(2)向MRS液体培养基加入5’鸟苷酸二钠，混合均匀后，接种步骤(1)获得的干酪乳杆菌菌液，于30-37℃条件下培养10-48h，即得耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌。
进一步地，步骤(1)中所述的活化过程为将保存干酪乳杆菌的冷冻管于30-37℃的水浴锅中快速溶解，使用75％酒精消毒后，加入到无菌的MRS液体培养基。
进一步地，步骤(1)中所述MRS液体培养基包含有葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物、磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、乙酸钠。
进一步地，步骤(1)中所述MRS液体培养基的灭菌条件为121℃条件下灭菌15min。
进一步地，步骤(2)中所述MRS液体培养基中的5’鸟苷酸二钠的浓度为1-4g/100mL。
进一步地，步骤(2)中的接种量为MRS液体培养基体积的1％。
进一步地，步骤(2)中的培养条件为37℃条件下摇床培养，摇床转速为50-200r/min。
本发明另一方面提供一种上述方法获得的耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌在食品或保健品中的应用。
进一步地，所述应用包括将所述耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌直接或经常规处理后添加到食品或保健品中。
进一步地，所述食品或保健品具有调节肠道菌群平衡、促进营养吸收、保持肠道健康、降血压、降胆固醇和提高免疫力的作用。
本发明相对于现有技术具有的有益效果如下：
干酪乳杆菌具有的多种对人体有益的功效已被证实，但是由于易失活的特点也限制了其应用。本发明通过将外源核苷酸(5’-GMPNa2)添加到干酪乳杆菌的培养基后，干酪乳杆菌的最大比生长速率提高，延滞期缩短，促进细菌生物被膜的产生及胞外聚合物的分泌，增强细菌对外界不利环境的抗性，从而增强细菌的存活率，表明5’-GMPNa2对细菌的增殖以及对外界不利环境的抗性具有促进作用。这一发现表明5’-GMPNa2可作为优质益生元使用，对提高干酪乳杆菌活力具有重要意义。
附图说明
图1为添加5’鸟苷酸二钠(5’-GMPNa2)后干酪乳杆菌的生长曲线。
图2为添加5’鸟苷酸二钠(5’-GMPNa2)后干酪乳杆菌的生物被膜产生情况，其中，A、MRS培养基培养后干酪乳杆菌的生物被膜产生情况(对照)，B、添加4％5’鸟苷酸二钠的MRS培养基培养后干酪乳杆菌的生物被膜产生情况。
图3为添加5’鸟苷酸二钠(5’-GMPNa2)后干酪乳杆菌的胞外聚合物分泌情况。
图4为5’鸟苷酸二钠(5’-GMPNa2)与干酪乳杆菌LuxS蛋白对接情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释说明，这些实施例应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中外源核苷酸由大连珍奥生物技术股份有限公司提供，干酪乳杆菌购自中国科学院微生物研究所菌种保藏中心。实施例中使用的主要原料和仪器设备如下：5’鸟苷酸二钠(5’-GMPNa2)、MRS液体培养基、戊二醛、吖啶橙LabRAM HR Evolution拉曼光谱仪(HORIBAScientific公司，法国)；LRH型生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；Imark酶标仪(Bio-Rad公司，美国)；型恒温振荡器(HZQ-X300C，上海一恒科技有限公司)；立式压力蒸汽灭菌器(LDZX-50FBS，上海申安医疗器械厂)。
实施例1外源核苷酸5’鸟苷酸二钠对干酪乳杆菌生长的影响
将甘油保护剂中保存的菌株在MRS液体培养基中活化后连续培养3代后，以MRS培养基为空白对照，分别加入1g/100mL、2g/100mL、3g/100mL、4g/100mL的5’鸟苷酸二钠，接种体积比为1％的干酪乳杆菌，37℃摇床培养24h，每隔4h取一次样，采用二倍稀释法对干酪乳杆菌进行活菌计数，绘制生长曲线。分别用修正的Gompetz模型、修正的Logistic模型非线描述干酪乳杆菌的生长变化规律。
(1)修正的Gompertz模型
式中，t为时间(h)，N(t)为时间t时的菌数，Nmax，N0为最大和初始菌数(CFU/g)。μmax为最大比生长速率(h-1)，λ为生长延滞时间(h)。
(2)修正的Logistic模型
式中，log(Nt)：t时的菌落数的对数值(lg CFU/mL)；log(N0)：初始菌落数(lg CFU/mL)；A是拟合参数；μmax：最大比生长速率(h-1)；λ为生长延滞时间(h)。
结果如图1所示，干酪乳杆菌的生长分为调整期、对数期、稳定期和衰亡期。干酪乳杆菌在添加5’鸟苷酸二钠的MRS培养基中较空白对照生长快，菌体迅速繁殖，很快进入对数生长期，活菌数较不添加5’鸟苷酸二钠的空白组明显提高，培养基中5’鸟苷酸二钠的浓度越高促进效果越显著，表明外源核苷酸5’鸟苷酸二钠能够加速细菌的增殖。
通过微生物生长动力学模型对细菌的生长曲线进行非线性拟合，修正的Gompertz方程和修正的Logistic方程可以较好地描述微生物的生长动态。添加5’鸟苷酸二钠后，细菌的最大比生长速率(μmax)较空白对照明显增加，延滞期(λ)明显缩短。外源核苷酸5’鸟苷酸二钠对干酪乳杆菌的生长有明显的促进作用。
实施例2外源核苷酸对干酪乳杆菌生物被膜、胞外聚合物的影响
干酪乳杆菌(1％接种量)接种于MRS肉汤培养基中摇床培养24h(37℃，160r/min)，按1:100比例稀释后，将100μL菌液和4.0％的5’鸟苷酸二钠MRS培养基加入孔板中，MRS肉汤培养基作为对照。孔板中放入无菌盖玻片和打磨过的锌片(0.5mm×0.5mm×0.3mm)，37℃静置培养48h后，用无菌水缓慢冲洗盖玻片3次，结晶紫(0.4％)染色20min，在显微镜下观察细菌生物被膜的变化。将锌片用无菌水缓慢冲洗除去未粘附的细菌。用2.5％的戊二醛固定30min后干燥30min。用拉曼光谱检测外源核苷酸对干酪乳杆菌胞外聚合物含量的影响。
细菌产生的生物被膜是细菌为了适应环境，粘附于固体或有机腔道表面，形成微菌落，并分泌胞外聚合物将自身包裹其中而形成的膜状物。添加了5’鸟苷酸二钠的MRS培养基培养后的干酪乳杆菌如图2所示，显微镜可以清楚显示干酪乳杆菌的生物被膜产生情况。其中，图片A为对照实验，图片B为添加4％的5’鸟苷酸二钠培养后的干酪乳杆菌生物被膜情况。与对照实验图片相比，干酪乳杆菌生物被膜分泌增多，细菌由较为分散的状态变得聚集，表明外源核苷酸5’鸟苷酸二钠促进干酪乳杆菌生物被膜的分泌。
胞外聚合物是细菌在一定环境条件下分泌的一些高分子聚合物。细菌包裹于这些聚合物中来抵御杀菌剂和其他有毒物质对细菌造成的侵害。通过拉曼光谱研究5’鸟苷酸二钠对干酪乳杆菌胞外聚合物的影响。如图3所示，图片A为对照，图片B为添加了4％外源核苷酸后干酪乳杆菌的胞外聚合物变化情况。可以看出，添加5’鸟苷酸二钠后，干酪乳杆菌胞外聚合物的拉曼光谱峰强度增加，拉曼光谱特征峰所对应的物质增加，表明外源核苷酸可以明显增加干酪乳杆菌分泌胞外聚合物的含量。
实施例3分子对接研究5’鸟苷酸二钠的作用机制
干酪乳杆菌的生物被膜、胞外聚合物能够被诱导物-2(AI-2)提高，AI-2是通过甲基循环合成的一种信号分子，Lux S蛋白是AI-2合成的关键酶，因此研究5’鸟苷酸二钠和lux S的相互作用具有重要意义。分子对接主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法，近年来，分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。本实施例通过研究5’鸟苷酸二钠、AI-2型信号分子与干酪乳杆菌LuxS受体蛋白活性部位的氨基酸的相互作用。结果如图4所示，图A为AI-2型信号分子与干酪乳杆菌LuxS受体蛋白活性部位的氨基酸的相互作用；图B为5’鸟苷酸二钠与干酪乳杆菌LuxS受体蛋白活性部位的氨基酸的相互作用；图C和D分别为AI-2、5’鸟苷酸二钠与干酪乳杆菌LuxS受体蛋白相互作用二维图。可以看出，5’鸟苷酸二钠对接到了LuxS蛋白的活性口袋中，与其关键氨基酸形成了重要的相互作用。5’-GMPNa2与LuxS蛋白的关键氨基酸CYS74、ASP73以及SER 123形成传统氢键等相互作用；AI-2与LuxS的关键氨基酸CYS 79、HIS11、CYS 124、SER 123形成传统氢键，其他的相互作用主要是范德华力。
AI-2型信号分子作为细菌种间交流的通用信号分子，可以同时被不同种间(内)的微生物的受体所识别。在AI-2型QS系统中，luxS基因是关键的调控基因并参与AI-2型信号分子的合成。AI-2型信号分子与LuxS分子对接的得分低于5’-GMPNa2，因此可知5’-GMPNa2对干酪乳杆菌生长的促进作用机制是作为LuxS蛋白的激动剂起作用，促进了AI-2型信号分子的分泌，从而触发QS系统相关基因的表达，使干酪乳杆菌产生特定的生理活动，如生物被膜、胞外聚合物分泌增多等。
实施例4含5’鸟苷酸二钠的培养基培养后的干酪乳杆菌对胃酸的耐受性
将实施例1培养后获得的干酪乳杆菌，在4000rpm离心20min，弃去上清液，沉淀菌体用灭菌的MRS液体培养基洗涤3次，将菌体重悬于MRS液体培养基中并调整菌悬液浓度为3.0×108cfu/mL。然后使用浓度为1mol/L的HCl将菌液的pH调整为2、3，放入37℃恒温培养箱中，2h后取出，立即进行梯度稀释，选择合适的稀释度吸取1mL稀释涂布MRS平板，37℃恒温培养箱中培养48h，记录菌落数，以未加入HCl的干酪乳杆菌实验组存活率为100％，计算其存活率，每组进行3个平行试验获得平均值，实验结果见表1。
表1.实施例1获得的干酪乳杆菌对胃酸的耐受性结果
由上述结果可知，本发明培养后获得的干酪乳杆菌能够在强酸的环境中保持非常高的存活率，表明5’-GMPNa2可作为优质益生元使用，对提高干酪乳杆菌活力具有重要意义。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (1)
1.一种耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：
（1）将保存干酪乳杆菌的冷冻管于30-37℃的水浴锅中快速溶解，使用75%酒精消毒后，加入到无菌的液体培养基中活化，然后连续培养2代以上，获得干酪乳杆菌菌液；
（2）向液体培养基加入5’ 鸟苷酸二钠，混合均匀后，接种步骤（1）获得的干酪乳杆菌菌液，接种量为液体培养基体积的1%，于30-37℃条件下摇床培养10-48h，摇床转速为50-200r/min，即得耐酸的和繁殖能力强的干酪乳杆菌；
所述液体培养基的灭菌条件为121℃条件下灭菌15min；
步骤（2）中所述液体培养基中的5’ 鸟苷酸二钠的浓度为1-4g/100mL。
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