CN113430145B - 一种具有耐胃酸性的植物乳杆菌的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有耐胃酸性的植物乳杆菌的制备方法及应用，属于微生物技术领域。所述具有耐胃酸性的植物乳杆菌为将非耐酸型植物乳杆菌接种于含5’‑单磷酸腺苷的培养液中，发酵培养所得。本发明5’‑单磷酸腺苷可以促进植物乳杆菌的生长、增殖，还可以促进菌株生物被膜的产生以及菌株的群集性和泳动性，分子对接技术发现植物乳杆菌的LuxS蛋白与外源核苷酸5’‑单磷酸腺苷产生了氢键等较强的相互作用。本发明外源核苷酸对提高市售产品中植物乳杆菌的存活率具有巨大的潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种具有耐胃酸性的植物乳杆菌的制备方法及应用。
背景技术
植物乳杆菌是益生菌家族的一种，具有调节肠道菌群、调节血脂、增强机体抗氧化能力、参与机体免疫应答和降低胆固醇水平等多种益生功能，在食品工业中有着广泛应用。但是植物乳杆菌在加工、运输、贮藏、销售过程中活菌数下降很快，此外，植物乳杆菌在食用后需通过胃环境，但由于胃酸的杀菌作用，致使活性植物乳杆菌大量死亡。这也使很多市售植物乳杆菌产品的活菌数降低为无效量，达不到对人体的益生效果。
核苷酸作为生物体内重要的低分子化合物，是决定生物体细胞生物学特性和蛋白质功能，控制生物体生长、发育、繁殖和遗传的物质，是机体各种营养物质的代谢调节因子。目前，核苷酸的来源主要有两种，一种是人体内生核苷酸，二是酶解等技术合成的外源核苷酸。核苷酸曾被认为是由身体自身合成的，不需要外源补充。然而，近年来的研究发现，外源核苷酸在免疫挑战、损伤、应激、饥饿、快速生长和衰老等特定生理条件下是不可缺少的营养物质。外源核苷酸可以进入各种组织，被吸收和利用，节省人体的从头合成或还原合成的消耗。长期缺乏核苷酸摄入将导致免疫系统功能、骨髓造血功能、消化吸收功能下降，此外，还可能导致组织再生功能和创面愈合的降低。
发明内容
本发明针对上述问题，提供5’-单磷酸腺苷在制备增强植物乳杆菌抵御胃酸环境能力的食品中的应用，为提高市售植物乳杆菌的存活率和营养价值提供参考。
本发明为实现上述目的，通过以下技术方案实现：
一种具有耐胃酸性的植物乳杆菌的制备方法，所述具有耐胃酸性的植物乳杆菌为将非耐酸型植物乳杆菌接种于含5’-单磷酸腺苷的液体培养基中，发酵培养所得。
进一步地，将1％(v/v)的非耐酸型植物乳杆菌接种于含1～4％质量比的5’-单磷酸腺苷的液体培养基中，发酵培养。
进一步地，所述非耐酸型植物乳杆菌接种前活化3代或以上，至植物乳杆菌处于对数生长期。
进一步地，所述液体培养基使用前用移液管分装至厌氧管中，并置于120-125℃灭菌锅中灭菌15-20min。
进一步地，所述发酵培养的条件为37-39℃培养24-26h。
进一步地，所述具有耐胃酸性的植物乳杆菌中5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌的生长、生物被膜的产生、泳动性、群集性有促进作用。
一种根据上述制备方法制备得到的具有耐胃酸性的植物乳杆菌的应用。
进一步地，在制备具有抵御胃酸环境能力的植物乳杆菌功能性食品或保健品中的应用。
发明有益效果
通过本发明，可探究外源核苷酸，即5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌生长、生物被膜的产生、泳动性、群集性的促进作用，并利用分子对接技术探究其可能的作用机制。
其目的意义在于：为发现新的能促进植物乳杆菌在胃酸环境中生长和提高存活率的产品提供思路和方法，同时为研究和开发外源核苷酸的新功效作用提供数据，有助于满足人们日益提高的生活水平的需要。
总之，本发明对今后开发利用含有外源核苷酸进行药品、保健品、功能性食品等各种产品的生产奠定了基础。
附图说明
图1为5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌生长的促进作用。
图2为5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌生物被膜产生的影响；A为对照组；B为5’-单磷酸腺苷组。
图3为5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌泳动性和群集性的影响；A为泳动性影响；B为群集性影响。
图4为分子对接技术探究5’-单磷酸腺苷与植物乳杆菌LuxS蛋白的相互作用；A为配体-受体相互作用；B为相互作用二维图。
具体实施方式
下列实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中外源核苷酸和植物乳杆菌均可通过市售方式获得。
实施例1植物乳杆菌发酵液的制备方法
将MRS液体培养基用移液管分装到20mL厌氧管中，置于121℃灭菌锅中灭菌15min。将活化3代的1％(v/v)植物乳杆菌分别接种到含1％、2％、3％和4％质量比的5’-单磷酸腺苷培养液中，37℃培养24h，得到植物乳杆菌发酵液。
实施例2 5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌生长的促进作用
将MRS液体培养基用移液管分装到20mL厌氧管中，置于121℃灭菌锅中灭菌15min。以MRS培养基为空白对照，分别加入1～4％(质量计)的5’-单磷酸腺苷，接种活化3代的1％(v/v)植物乳杆菌，37℃培养24h，每隔3h取一次样，用MRS固体培养基(MRS固体培养基为液体MRS培养基添加1.5％琼脂)采用二倍稀释法进行样品稀释，取3个合适的稀释度，每个稀释度3个重复，37℃恒温培养48h后对植物乳杆菌进行活菌计数，绘制生长曲线。
通过测定植物乳杆菌的生长曲线来探究5’-单磷酸腺苷对其生长的促进作用。图1可以看出，植物乳杆菌在MRS培养基中增殖迅速，迟滞期较短，生长曲线呈典型的“S”型。添加5’-单磷酸腺苷的MRS培养基中的植物乳杆菌增殖更为迅速，植物乳杆菌生长的对数期提前，稳定期也延长，由此表明5’-单磷酸腺苷可以增强植物乳杆菌的代谢速率，促进植物乳杆菌的生长与增殖。
实施例3 5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌生物被膜产生的影响
植物乳杆菌按照1％(v/v)的比例接种于MRS肉汤培养基中37℃摇床培养24h(160rpm)。按1:100比例稀释后取20mL菌液加入无菌培养皿中，分别加入4.0％的5’-单磷酸腺苷、MRS肉汤(对照)。每个平板底部放有一片打磨过的锌片(0.5mm×0.5mm×0.3mm)，其作用是使生物被膜黏附于锌片上。将平板放置于37℃培养箱中静置培养48h。培养后取出锌片，分别用50％、70％、80％和90％(v/v)的乙醇浸泡10min，然后用100％的乙醇浸泡2次，每次各15min，最后用25％的己酸异戊酯浸泡2次，每次各15min。锌片干燥后喷金处理，进行扫描电镜观察。细菌产生的生物被膜在自然界中广泛存在，它能粘附于食品、食品加工设备、医疗器械甚至病理状态下的人体组织器官表面等有生命或无生命的物体表面。生物被膜可以增强细菌对不利环境的抵抗力。通过扫描电镜(图2)可以看出，不添加5’-单磷酸腺苷时，植物乳杆菌所产生的生物被膜较少，而添加5’-单磷酸腺苷后，植物乳杆菌产生了大量的致密的生物被膜，植物乳杆菌包裹在胞外聚合物中，形成复杂的生物被膜三维结构。
实施例4 5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌泳动性和群集性的影响
泳动性培养基配置：1g胰蛋白胨，0.5g氯化钠，0.3g琼脂和100mL蒸馏水。
群集性培养基配置：1g蛋白胨，0.5g氯化钠，0.3g琼脂，0.5g D-果糖和100mL蒸馏水。上述培养基配置好后于121℃灭菌15min后倒平板。冷却到室温后，接种1.5μL的菌液中的培养物于泳动性和群集性平板中央。未加5’-单磷酸腺苷的菌液做为对照。将泳动性和群集性平板置于培养箱中培养24h(37℃)后测量菌株扩散距离。细菌的群集性和泳动性对于细菌生物被膜形成过程的第一阶段尤其是在物体表面的粘附及蔓延起到重要作用。如图3所示，植物乳杆菌在泳动性和群集性平板上从接种点向四周扩散运动，当添加5’-单磷酸腺苷时，细菌的移动距离呈现明显增大的趋势，由此表明，5’-单磷酸腺苷显著促进了植物乳杆菌的泳动和群集运动。
实施例5分子对接技术探究5’-单磷酸腺苷与植物乳杆菌LuxS蛋白的相互作用
LuxS蛋白是植物乳杆菌群体感应系统中产生信号分子的关键蛋白，因此通过分析配体-受体的相互作用可以阐明5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌的益生作用机制。从图4可以看出，5’-单磷酸腺苷与LuxS蛋白的关键氨基酸HISA:58、GLU A:57、CYS B:79、GLYB:78、ARGB:39、HIS B:11形成了传统氢键、pi-阴离子键等重要相互作用。在植物乳杆菌的群体感应通路中，5’-单磷酸腺苷对LuxS蛋白的亲和力较强，因此5’-单磷酸腺苷可能作为LuxS蛋白的激动剂起作用，从而触发相关基因的表达，使细菌产生特定的生理活动，如群集性、泳动性、生物被膜等现象。
实施例6人工胃液环境下5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌存活率的影响
将MRS液体培养基用移液管分装到20mL厌氧管中，置于121℃灭菌锅中灭菌15min。以MRS培养基为空白对照组，1％、2％、3％和4％质量比的5’-单磷酸腺苷为实验组，分别接种活化3代的1％(v/v)植物乳杆菌，37℃培养24h。
分别无菌吸取空白对照组和实验组的菌液9mL，用稀释涂布平板法计数。分别吸取空白对照组和实验组的菌液1mL加入9mL人工胃液中，立即震荡均匀，于37℃静置2h，稀释涂布平板法计数。空白对照组与实验组中植物乳杆菌存活率见表1。通过表1可以看出，5’-单磷酸腺苷可以很好的保护植物乳杆菌不受胃酸杀灭。
表1人工胃液环境下植物乳杆菌存活率
综上，本发明外源核苷酸，即5’-单磷酸腺苷，能促进植物乳杆菌的生长与增殖，此外，还促进了植物乳杆菌生物被膜的产生以及群集性和泳动性。分子对接技术探究5’-单磷酸腺苷可能的作用机制发现，5’-单磷酸腺苷与LuxS蛋白产生较强的相互作用，在胃酸环境下，5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌有保护作用，可以有效防止植物乳杆菌被胃酸杀灭。因此5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌的益生作用很可能跟细菌的群体感应效应有关。5’-单磷酸腺苷具有作为益生元的潜力，可作为促进植物乳杆菌生长的新型增殖因子，在改善相关产品的质量，提高产品的营养价值方面具有极大的市场潜力。
Claims (3)
1.一种具有耐胃酸性的植物乳杆菌的制备方法，其特征在于，所述具有耐胃酸性的植物乳杆菌为将非耐酸型植物乳杆菌接种于含5’-单磷酸腺苷的液体培养基中，发酵培养所得；
具体为将1%v/v的非耐酸型植物乳杆菌接种于含1~4%质量比的5’-单磷酸腺苷的液体培养基中，发酵培养；
所述非耐酸型植物乳杆菌接种前活化3代以上，至植物乳杆菌处于对数生长期；
所述发酵培养的条件为37-39 ℃培养24-26 h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基使用前用移液管分装至厌氧管中，并置于120-125℃灭菌锅中灭菌15-20min。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述具有耐胃酸性的植物乳杆菌中5’-单磷酸腺苷对植物乳杆菌的生长、生物被膜的产生、泳动性、群集性有促进作用。
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