CN105567650B - 细菌超氧化物歧化酶及其制备方法 - Google Patents

细菌超氧化物歧化酶及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备方法，所述细菌超氧化物歧化酶由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到，包括格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)的活化、种子液的制备、发酵培养以及超氧化物歧化酶的制备的步骤。该方法制备得到的超氧化物歧化酶产量高、活性好、稳定性好，制备过程简单、成本低。

Description

细菌超氧化物歧化酶及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，特别是涉及一种细菌超氧化物歧化酶及其制备方法。
背景技术
超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)是生物体防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，它可以催化超氧阴离子的歧化反应产生分子氧和过氧化氢。超氧阴离子与人类及动植物的许多疾病的发生和形成有关。因此，SOD作为一种专一性的氧自由基清除剂，可以防御超氧阴离子的毒性，维持细胞正常的生理代谢，对机体具有保护作用。超氧化物歧化酶在医药、食品、化妆品、农业方面有着广阔的应用前景，因此受到国内外普遍重视。
SOD广泛存在于动物、植物、所有好氧微生物及少数厌氧微生物体内。目前SOD主要从动物组织中提取，比如牛肝和红细胞等，产量受到很大限制，且容易受到原料来源、安全性及质量不稳定等因素的影响；微生物来源广，繁殖快，时间短，易培养，用来制备SOD具有很大潜力。
发明内容
基于此，本发明的目的之一在于提供一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法。
实现上述目的的具体技术方案如下。
一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，该细菌超氧化物歧化酶包括酶液和酶粉两种形式，由保藏编号为CCTCC M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)发酵培养制备得到，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在琼脂-M17培养基上活化；
(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于液体培养基中培养得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；
(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液接种于发酵培养基中发酵培养后，离心收集发酵湿菌体直接用于下一步超氧化物歧化酶的制备，或者将离心收集的发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；
(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的发酵湿菌体或者冻干菌粉，悬浮于pH为7.2-8.5的磷酸缓冲液中，加入溶菌酶裂解2～24h，离心，将上清液调节pH为4.0～5.6，冰冷放置1-3h，离心除沉淀，即得细菌超氧化物歧化酶酶液；或将酶液冻干即得细菌超氧化物歧化酶酶粉。
在其中一些实施例中，步骤(3)所述的发酵培养基的成分为：0.1～10wt％的碳源，0.1～10wt％的氮源，0～5wt％氮源以外的无机盐，余量为蒸馏水。
在其中一些实施例中，所述碳源选自单糖、双糖、多糖、酵母浸膏、蛋白胨、牛肉膏；所述氮源选自酵母浸膏、蛋白胨、无机铵盐、无机硝酸盐、尿素、玉米浆、豆饼粉；所述氮源以外的无机盐选自磷酸盐、钠盐、镁盐、锰盐、钙盐。
在其中一些实施例中，步骤(1)所述琼脂-M17培养基中的琼脂含量为1～2wt％，活化的时间为12h～60h，活化的温度为20℃～45℃。
在其中一些实施例中，步骤(2)所述液体培养基为M17肉汤培养基，培养的时间为12h～196h，培养的温度为20℃～45℃，培养的转速为0rpm～280rpm。
在其中一些实施例中，步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为0.1％～10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为20℃～45℃，发酵培养的时间为12h～196h，发酵培养的转速为0rpm～280rpm。
在其中一些实施例中，步骤(2)和/或步骤(3)的培养在严格厌氧的条件下进行。
在其中一些实施例中，步骤(4)所述溶菌酶的质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.1％-1％。
本发明的另一目的在于提供一种细菌超氧化物歧化酶。
具体技术方案如下：
一种细菌超氧化物歧化酶，由上述制备方法制备而得。
本发明利用格氏乳球菌(Lactococcus garvieae，保藏编号为CCTCC M 2015633)进行发酵培养制备细菌超氧化物歧化酶，本发明的制备方法制备得到的细菌超氧化物歧化酶的酶活力高(20230U/g冻干菌粉以上)，热稳定性与酸碱稳定性均很好，且该方法制备过程简单、成本低、产量高、应用广泛。且发明人对制备方法进行了优化，厌氧条件下培养更有利于格氏乳球菌的生长以及细菌超氧化物歧化酶的产生，得到的细菌超氧化物歧化酶具有更高的酶活力(达到32450U/g冻干菌粉)。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。
以下实施例中，未注明具体条件的实验方法，按本领域内常规方法和条件进行。格式乳球菌(Lactococcus garvieae)保藏在武汉大学保藏中心中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2015年10月22日，保藏编号CCTCC M 2015633。
实施例1
本实施例的一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt％琼脂-M17培养基中进行活化，活化温度为20℃，时间为48h；
(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17肉汤培养基中有氧培养12h，培养温度为30℃，转速为100rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；
(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1％的接种量接种于发酵培养基中有氧发酵培养144h，温度为30℃，转速为100rpm；离心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分为：0.1wt％的葡萄糖，1wt％的蛋白胨，0.1wt％硫酸氢二钾，0.1wt％硫酸镁，余量为蒸馏水；
(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌粉，悬浮于pH 7.8的磷酸缓冲液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的1％)裂解24h后10000rpm离心1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到4.0，冰冷放置2h，12000rpm下离心1min除沉淀，上清液即为SOD酶液，并将上清液冻干即得SOD酶粉；测其酶活。
SOD活性测定方法：总超氧化物歧化酶(SOD)活性测定采用邻苯三酚自氧化法，以每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50％时的酶量定义为一个酶活单位(U)。
自氧化的测定:在25℃，在4.5mL 50mmol/L，pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入10μL 50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入比色皿，以Tris-HCl缓冲溶液为空白对照，在325nm波长下每隔30s测一次吸光度(A值)，共测6次,要求自氧化速率控制在0.070OD/min左右。
酶活的测定:在25℃，在4.5mL 50mmol/L，pH 8.2的Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的待测超氧化物歧化酶酶液，预热20min，加入10μL 50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入比色皿，以Tris-HCl缓冲溶液为空白对照，在325nm波长下每隔30s测一次A值,共测6次。
SOD单位活力(U/ml)＝(A0-AS)/(AS×50％)×4.5/V×N
式中:A0为自氧化速率；AS为加入待测SOD酶液后的氧化速率；V为加样体积；N为样品稀释倍数。
在步骤(3)中，1L发酵培养基得15.8g冻干菌粉，经测定步骤(4)SOD酶液冻干后质量为986mg，SOD活性为25650U/g冻干菌粉。
实施例2
本实施例的一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt％琼脂-M17培养基中进行活化，活化温度为20℃，时间为12h；
(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17肉汤培养基中厌氧培养196h，培养温度为30℃，转速为0rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；
(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为10％的接种量接种于发酵培养基,分别进行有氧和厌氧发酵培养24h，培养温度为28℃，转速为0rpm；离心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分为：10wt％的葡萄糖，1wt％的酵母浸膏，0.5wt％硫酸氢二钾，0.02wt％硫酸镁，0.1％硫酸铵，余量为蒸馏水；
(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌粉，悬浮于pH 8.5磷酸缓冲液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.1％)裂解2h后10000rpm离心1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到4.0，冰冷放置2h，8000rpm下离心10min除沉淀，上清液即为SOD酶液；测其酶活(测定方法同实施例1)；
在步骤(3)中，1L发酵培养基有氧发酵培养得15.8g冻干菌粉，经测定步骤(4)所得SOD的活性为25550U/g冻干菌粉；1L发酵培养基厌氧发酵培养得20.8g冻干菌粉，经测定步骤(4)所得SOD的活性为32450U/g冻干菌粉；由此可见，厌氧条件更有利于格氏乳球菌的生长以及SOD的产生。
实施例3
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于2wt％琼脂-M17培养基中进行活化，活化温度为37℃，时间为60h；
(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于M17肉汤培养基中厌氧培养196h，培养温度为37℃，转速为0rpm，得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；
(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为1％的接种量接种于发酵培养基中厌氧发酵培养196h，培养温度为37℃，转速为0rpm；离心收集发酵湿菌体并把发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分为：0.5wt％的蔗糖，10wt％的酵母浸膏，0.8wt％硫酸氢二钾，0.1wt％硫酸镁，0.1％硫酸铵，余量为蒸馏水；
(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的冻干菌体，悬浮于pH 8.5磷酸缓冲液中，加入溶菌酶(质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.2％)裂解4h后10000rpm离心1min，得到的上清液用10mmol/L的盐酸调pH到5.5，冰冷放置2h，10000rpm下离心5min除沉淀，上清液即为SOD酶液；测其酶活(方法同实施实例1)；
在步骤3中，1L发酵培养基得28.2g冻干菌粉，经测定步骤(4)所得SOD活性为20230U/g冻干菌粉。
实施例4
取实施例1中的SOD酶液0.5ml，分别置于pH 4，5，6，7，8，9的磷酸缓冲液3.5ml中，在35℃下测定SOD活力分别为24600，25000，24000，24300，25800，23800U/g冻干菌粉(测定方法同实施例1)，因此该SOD的最适反应pH是8。
实施例5
取实施例1中的SOD酶液0.5ml,与3.5ml pH 8的磷酸盐缓冲液混合，在30，35，40，45，50，55，65℃下分别测得SOD活力为23000，25800，25000，24100，23700U，23100，22000U/g冻干菌粉(测定方法同实施例1)，因此该SOD的最适反应温度为35℃。
实施例6
取实施例1中的SOD酶液0.5ml，与3.5ml pH 8的磷酸盐缓冲液混合，在45，50，55，65，70，75下保温24h后，在35℃分别测得相对酶活(与未做处理的SOD酶液相比)为100％、98％、96％、96％、95％、95％(测定方法同实施例1)，表明该SOD有良好的热稳定性。
实施例7
取实施例1中的SOD酶液0.5ml，与3.5ml pH 3，4，5，6，7，8，9，10，11的磷酸盐缓冲液混合放置4h后，在35℃分别测得相对酶活(与未做处理的SOD酶液相比)为90％、95％、96％、96％、99％、100％，99％，94％，90％(测定方法同实施例1)，表明该SOD有良好的pH稳定性。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (6)

1.一种细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，该细菌超氧化物歧化酶包括酶液和酶粉两种形式，由保藏编号为CCTCC NO:M 2015633的格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)发酵培养制备得到，包括以下步骤：
(1)格氏乳球菌的活化：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)在琼脂-M17培养基上活化；
(2)格氏乳球菌种子液的制备：将活化后的格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)接种于液体培养基中培养得到格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液；所述液体培养基为M17肉汤培养基；
(3)格氏乳球菌的发酵培养：将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液接种于发酵培养基中发酵培养后，离心收集的发酵湿菌体直接用于下一步超氧化物歧化酶的制备，或者将离心收集的发酵湿菌体冻干得到冻干菌粉；所述发酵培养基的成分包括：0.1～10wt％的碳源，0.1～10wt％的氮源，0～5wt％氮源以外的无机盐；其中，所述碳源选自0.1～10wt％葡萄糖、0.5wt％蔗糖，氮源选自1wt％蛋白胨、1～10wt％酵母浸膏，氮源以外的无机盐选自0.1～0.8wt％硫酸氢二钾、0.02～0.1wt％硫酸镁、0.1wt％硫酸铵；
(4)超氧化物歧化酶的制备：将步骤(3)收集的发酵湿菌体或者冻干菌粉，悬浮于pH为7.2-8.5的磷酸缓冲液中，加入溶菌酶裂解2～24h，离心，将上清液调节pH为4.0～5.6，冰冷放置1-3h，离心除沉淀，即得细菌超氧化物歧化酶酶液；或将酶液冻干即得细菌超氧化物歧化酶酶粉。
2.根据权利要求1所述的细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述琼脂-M17培养基中的琼脂含量为1～2wt％，活化的时间为12h～60h，活化的温度为20℃～45℃。
3.根据权利要求1所述的细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述液体培养基为M17肉汤培养基，培养的时间为12h～196h，培养的温度为20℃～45℃，培养的转速为0rpm～280rpm。
4.根据权利要求1所述的细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)将格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)种子液按体积比为0.1％～10％的接种量接种到发酵培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为20℃～45℃，发酵培养的时间为12h～196h，发酵培养的转速为0rpm～280rpm。
5.根据权利要求1所述的细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(2)和/或步骤(3)的培养在严格厌氧的条件下进行。
6.根据权利要求1所述的细菌超氧化物歧化酶的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述溶菌酶的质量为步骤(3)所得发酵湿菌体质量的0.1％-1％。
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