CN101962410B - 肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法。所述制备方法包括以下步骤：1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物。本发明证实：肝素增强了bFGF对DBM的特异结合；hc-collagen/bFGF具有更高的生物活性；本发明还发现HC-DBM/bFGF在体内能促进血管化。
Description
技术领域
本发明涉及组织工程领域，特别涉及肝素、胶原材料和生长因子的交联物及其制备方法。
背景技术
组织工程被视为对治疗组织缺陷的一项很有希望的技术，但是关于组织材料(如胶原材料)的一个主要问题就是：它们不能在有效合理的时间内形成血管化。血管再生是发育，组织再生及创伤修复的基础，是创伤修复及缺血性疾病治疗的一个重要方面。因此，为了促进血管再生的进程，在治疗创伤修复时将血管诱导因子与组织材料联合应用。
碱性成纤维生长因子(bFGF)是一种有效的促细胞分裂素，也是血管内皮细胞的调节器，可促进血管内皮细胞的增殖和迁移，这些都是血管再生的重要方面。据报道，含胶原结合区的bFGF与胶原膜结合后有效的促进了血管再生。但是，bFGF在注入体内后很容易随体液流失，从而导致效用的降低，并且在周围组织中引起副作用。
脱钙骨基质(Demineralized bone matrix，DBM)是一种非常好的生物适合的胶原骨架，是一种很有前途的生物材料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种制备肝素、胶原材料和生长因子的交联物的方法。
所述方法包括以下步骤：
1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；
2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物。
上述步骤1)中将肝素与胶原材料交联的方法包括如下步骤：将肝素溶液与所述胶原材料混合，反应；所述反应的温度为30-40℃，优选为37℃，反应的时间为3-5小时，优选为4小时。
上述步骤2)中所述孵育的温度为30-40℃，优选37℃；所述孵育的时间为0.5-1.5小时，优选为1小时。
所述胶原材料为脱钙骨基质或酸性胶原；生长因子为具有肝素结合域的生长因子，所述生长因子优选为碱性成纤维生长因子。
本发明的另一目的在于提供一种由肝素、胶原材料和生长因子制备的交联物。
所述交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为(0.2-0.4)∶(800-1200)∶(0.07-0.12)，优选的质量比为0.31∶1000∶0.092。
该交联物是按照上述方法制备得到的。
本发明的另一目的在于提供肝素在促进生长因子和胶原材料结合中的应用。
所述应用包括以下步骤：
1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；
2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物。
所述步骤1)中将肝素与胶原材料交联的方法包括如下步骤：将肝素溶液与所述胶原材料混合，反应；所述反应的温度为30-40℃，优选为37℃，反应的时间3-5小时，优选为4小时。
所述步骤2)中所述孵育的温度为30-40℃，优选37℃；所述孵育的时间为0.5-1.5小时，优选为1小时。
所述胶原材料为脱钙骨基质或酸性胶原；生长因子为具有肝素结合域的生长因子，所述生长因子优选为碱性成纤维生长因子。
本发明的又一目的在于提供上述交联物在制备促进血管再生的修复材料中的应用。
本发明通过肝素使更多的生长因子与胶原材料牢固结合，得到三种物质的交联物，实验证明，用相同浓度的bFGF在相同条件下进行实验，结合了肝素的DBM(HC-DBM)要比未结合肝素的DBM结合更多的bFGF，且差异显著，表明肝素(HC)增强了生长因子bFGF对胶原材料DBM的特异结合，阻止了生长因子的扩散。
本发明得到的肝素、生长因子与胶原材料的交联物的生物活性更高，细胞增殖实验证明，在hc-collagen/bFGF上细胞的生长速度要比在collagen/bFGF和collagen/PBS上快的多，细胞数量差异很显著；体内血管化实验证明，用本发明的HC-DBM/bFGF交联物包埋，组织中生成的血管数目明显多于DBM/PBS、DBM/bFGF，而且随着时间的增长，血管数目不会因为生长因子的流失而减少，相反能在bFGF的诱导下，诱导更多的内皮细胞迁移增殖，从而诱导更多的血管再生。另外，本发明的交联物的制备方法操作简单、成本低廉。因此，本发明的方法及交联物在组织修复中将有广阔的应用前景。
附图说明
图1为bFGF与DBM和HC-DBM的结合曲线图。
图2为成纤维细胞在collagen/PBS，collagen/bFGF和HC-collagen/bFGF上增殖情况。
图3为皮下包埋7天时，待测材料的外形图以及免疫组织化后的图片。
图4为皮下包埋7天时，统计待测材料的血管数目。
图5为皮下包埋14天时，待测材料的外形图以及免疫组织化后的图片。
图6为皮下包埋14天时，统计待测材料的血管数目。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。
下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中，所述百分含量如无特殊说明，均为质量百分含量。
实施例1、肝素、胶原材料和生长因子的交联物
一、交联物的制备
1、肝素、DBM和生长因子的交联物的制备
1)HC-DBM的制备
DBM购买于山东正海生物技术有限公司。首先，将2mg的DBM(4mm×4mm×1mm)放入96孔板中，每孔加入200μL 50mM MES buffer(pH值5.6)，过夜；然后，将20mg肝素(heparin)(购自Sigma公司，货号：H-4784)溶于含有4mg碳二亚胺/2.4mg N-羟基琥珀酰亚胺(4mg EDC/2.4mg NHS)的10mL MES buffer(50mM，pH为5.6)中，得到肝素混合液；然后，吸掉上述96孔板中的MES buffer，将肝素混合液加入到含有DBM的96孔板中，200μL/孔，在37℃反应4小时，得到heparin和DBM的交联体(HC-DBM)；最后将得到的HC-DBM分别用0.1M Na2HPO4溶液(2h内洗3次)，4M NaCl溶液(4h内洗3次)和蒸馏水洗(1h内洗3次)。然后将洗过的HC-DBM放入-80℃过夜，并冻干，作为以下实验的材料。
2)HC-DBM/bFGF的制备
将HC-DBM分别放入96孔板中，然后将按照下述方法制备的bFGF 100μL(浓度分别为：0，2，3.75，7.5，15，30，60，120μg/mL)加入到该96孔板中，在37℃孵育1h后，PBS(pH为7)洗三次，由此得到交联物HC-DBM/bFGF。其中，加入100μL的2，3.75，7.5，15，30，60，120μg/mL的bFGF的交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为0.31∶1000∶0.013，0.31∶1000∶0.028，0.31∶1000∶0.046，0.31∶1000∶0.064，0.31∶1000∶0.0745，0.31∶1000∶0.082，0.31∶1000∶0.092。
bFGF的制备方法如下：将编码bFGF的基因(GenBank：J04513)连接于pET28a(+)表达载体，使其与his-tag标签融合，在E.coli菌株BL21(DE3)系统中进行诱导表达，所得菌体低温离心收集，经超声破碎后低温高速离心，收集上清，将上清溶液经Ni亲和柱亲和纯化，除去杂蛋白，得到FGF蛋白，用于后续实验。
以DBM作为对照，直接与bFGF结合，其余步骤与步骤1中的步骤2)相同，制成DBM/bFGF。
2、肝素、酸性胶原(COLLAGEN)和生长因子的交联物的制备
1)hc-collagen系统的制备
将按下述方法制备的酸性胶原250μL加入到48孔细胞培养板中，吹干后，加入含有2mg/ml肝素的MES溶液，在37℃反应4小时，构成hc-collagen系统。
酸性胶原的制备方法如下：取新鲜大鼠尾，洗净，在酒精中浸泡15分钟消毒。将鼠尾用剪刀分成大约2cm的若干段。将鼠尾腱挤出，放于蒸馏水中，避免风干。用PBS(pH＝7.0-7.5，1.5M NaCl)浸泡尾腱，4度处理2天，换液4-6次。用预冷的0.5M乙酸浸泡，体积根据最终需要的浓度掌握。4℃酸抽提2天，4℃离心，2000g10分钟。上清即为粗制鼠尾胶原。
2)hc-collagen/bFGF的制备
将hc-collagen用PBS(pH为7.4)洗三次后，将浓度为35μg/mL的bFGF溶液加入到含有hc-collagen系统的培养(孔)板中(100μL/孔)，37℃孵育1h；然后用PBS(pH为7.4)洗三次。
二、功能检测
1、检测肝素(heparin)对bFGF与DBM结合能力的影响
通过ELISA法检测步骤一的步骤1中结合到DBM和HC-DBM上的bFGF的量，其中所用到的一抗为mouse-anti-polyhistine antibody(购自Sigma)，二抗为goatanti-mouse偶联碱磷酶(购自Sigma))。
实验设3次重复，结果如图1所示，在含有相同浓度bFGF的孔中，HC-DBM比DBM结合了更多的bFGF，这表明肝素增强了bFGF与DBM的特异结合。
2、HC-COLLAGEN/bFGF在胶原凝胶上的细胞活性检测
将250μL酸性胶原加入到48孔细胞培养板中，吹干后，加入含有不含肝素的MES溶液，构成collagen系统。将collagen用PBS(pH为7.4)洗三次后，往含有collagen系统的培养板中加入35μg/mL的bFGF溶液，每孔100μL，剩余的含有collagen系统的培养板中加入100μL的PBS(pH为7.4)。37℃孵育1h，得到collagen/bFGF和collagen/PBS两组对照，然后用PBS(pH为7.4)洗三次。
往步骤一中的步骤2得到的hc-collagen/bFGF与两组对照collagen/bFGF和collagen/PBS的三种培养板中，加入200μL含有青霉素(1000U/ml)和链霉素(1000ug/ml)的双抗溶液，37℃孵育2h；PBS(pH为7.4)洗三次后，加入成纤维细胞(上海翔升生物科技有限公司)(5000个/孔)进行培养，4天后，通过MTT法检测三种培养板中的细胞增殖情况。
MTT法的具体步骤如下：
(1)将成纤维细胞消化，按照每孔5000个细胞的数量将细胞接接种在48孔板中，含10％血清的DMEM培养基、37℃、5％CO2条件下培养过夜；第二天将培养也换成含2％血清的DMEM培养基。
(2)培养3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS，pH＝7.4配制)50μl。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液。每孔加150μl DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。
(3)比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。
实验设3次重复，结果如图2所示(A表示collagen/PBS，B表示collagen/bFGF，C表示hc-collagen/bFGF)，在培养四天后，通过MTT检测，生长在hc-collagen/bFGF的细胞要比collagen/bFGF和collagen/PBS要快的多，而且差异很显著，表明hc-collagen/bFGF具有更高的生物活性。
这说明肝素(hc)促使更多的bFGF结合到collagen上，从而促使更多的细胞增殖。
3、HC-DBM/bFGF在体内血管化检测
三组包埋材料如下：
HC-DBM/bFGF组：按照步骤一的1提供的方法将2mg的DBM与20mg的肝素制成HC-DBM，然后将100μl的120μg/ml的bFGF加入到含有该HC-DBM的96孔板中，37℃孵育1h，PBS洗去多余的PBS，在得到的交联物HC-DBM/bFGF中，肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为0.31∶1000∶0.092。
DBM/bFGF组：将100μl的120μg/ml的bFGF加入到含2mg DBM的的96孔板中，37℃孵育1h；
DBM/PBS组：2mg DBM与PBS(pH为7.4)混合，37℃孵育1h。
然后将上述三组包埋材料随机包埋到大鼠(12只体重在180g-200g的SD大鼠(北京大学医学部))后背两侧上。手术后，SD大鼠分别饲养在单独的笼子里。在手术后第7天和14天时，将三组材料取出，用甲醛固定，进行免疫组化染色。
实验设3次重复。第一次实验的结果如下：
在第7天时，大鼠体内血管化检测结果如图3所示(图3A为三组材料取出后，观察到的外形；图3B-D是三组材料经免疫组织化染色后观察到的血管)。
将三组材料取出，如图3A所示(1表示DBM/PBS，2表示DBM/bFGF，3表示HC-DBM/bFGF)，表明HC-DBM/bFGF组周围有很多组织侵入，将该组材料包裹。
将材料进行免疫组化染色后，结果如图3B-D所示(B：DBM/PBS；C：DBM/bFGF；D：HC-DBM/bFGF；10×40in B，C，D(是指B、C、D三幅图均放大10×40))，三组材料均可以观察到显著的血管。
计算形成血管的数目，如图4所示(A：DBM/PBS；B：DBM/bFGF；C：HC-DBM/bFGF)，HC-DBM/bFGF的血管数要比DBM/bFGF和DBM/PBS多，且差异显著。
计算血管数目的方法如下：将每组材料进行免疫组化染色后，在倒置显微镜10×40倍视野下随机拍摄10幅图片，然后统计每一视野下的所有形成血管数目，最后用分析软件统计出每组材料形成的血管数目。
在14天时，大鼠体内血管化检测结果如图5所示(图5A为三组材料取出后，观察到的外形；图5B-D是三组材料经免疫组织化染色后观察到的血管)。
将三组材料取出后，如图5A所示(1表示DBM/PBS，2表示DBM/bFGF，3表示HC-DBM/bFGF)：HC-DBM/bFGF要比DBM/PBS、DBM/bFGF大，可能是因为HC-DBM比DBM降解的慢。
通过免疫组化染色，如图5B-D所示(B：DBM/PBS；C：DBM/bFGF；D：HC-DBM/bFGF；10×40in B，C，D)，DBM/PBS、DBM/bFGF、HC-DBM/bFGF都能观察到血管。
按照上述计算血管数目的方法，统计血管数目，结果如图6所示(A：DBM/PBS；B：DBM/bFGF；C：HC-DBM/bFGF)，HC-DBM/bFGF的血管数比DBM/PBS、DBM/bFGF多，而且DBM/PBS、DBM/bFGF的血管数比七天时数目变少了。因为结合到DBM的bFGFb很容易的扩散，失活；然而HC-DBM能够吸附更多的bFGF，从而诱导更多的内皮细胞迁移增殖，诱导血管再生。
以上数据显示，HC-DBM是一种有效的bFGF传输系统，在组织再生中能够有效的促进血管化。
实施例2、肝素、胶原材料和生长因子的交联物
一、交联物的制备
1、肝素、DBM和生长因子的交联物的制备
1)HC-DBM的制备
实施例2中HC-DBM的制备与实施例1中HC-DBM的制备的区别在于DBM为3mg，反应温度是30℃，反应时间是3小时，其余步骤完全相同。
2)HC-DBM/bFGF的制备
实施例2中HC-DBM/bFGF的制备与实施例1中HC-DBM/bFGF的制备的区别在于孵育温度是30℃，孵育时间是0.5小时，其余步骤完全相同。
2、肝素、酸性胶原(COLLAGEN)和生长因子的交联物的制备
1)hc-collagen系统的制备
实施例2中hc-collagen的制备与实施例1中hc-collagen的制备的区别在于反应温度是30℃，反应时间是3小时，其余步骤完全相同。
2)hc-collagen/bFGF的制备
实施例2中hc-collagen/bFGF的制备与实施例1中hc-collagen/bFGF的制备的区别在于孵育温度是30℃，孵育时间是0.5小时，其余步骤完全相同。
二、功能检测
1、检测肝素(heparin)对bFGF与DBM结合能力的影响
方法与实施例1相同，实验设3次重复，发现在含有相同浓度bFGF的孔中，HC-DBM比DBM结合了更多的bFGF，这表明肝素增强了bFGF与DBM的特异结合。
2、HC-COLLAGEN/bFGF在胶原凝胶上的细胞活性检测
方法与实施例1相同，实验设3次重复，发现生长在hc-collagen/bFGF的细胞要比collagen/bFGF和collagen/PBS要快的多，而且差异很显著，表明hc-collagen/bFGF具有更高的生物活性。
3、HC-DBM/bFGF在体内血管化检测
方法与实施例1相同，实验设3次重复。
第7天时，HC-DBM/bFGF组周围有很多组织侵入，将该组材料包裹。将材料进行免疫组化染色后，计算形成血管的数目，HC-DBM/bFGF的血管数要比DBM/bFGF和DBM/PBS多，且差异显著。
第14天时，HC-DBM/bFGF组要比DBM/PBS组、DBM/bFGF组大，可能是因为HC-DBM比DBM降解的慢。通过免疫组化染色，统计血管数目，发现HC-DBM/bFGF的血管数比DBM/PBS、DBM/bFGF多，而且DBM/PBS、DBM/bFGF的血管数比七天时数目变少了。
实施例3、肝素、胶原材料和生长因子的交联物
一、交联物的制备
1、肝素、DBM和生长因子的交联物的制备
1)HC-DBM的制备
本实施例中HC-DBM的制备与实施例1中HC-DBM的制备的区别在于反应温度是40℃，反应时间是5小时，其余步骤完全相同。
2)HC-DBM/bFGF的制备
本实施例中HC-DBM/bFGF的制备与实施例1中HC-DBM/bFGF的制备的区别在于孵育温度是40℃，孵育时间是1.5小时，其余步骤完全相同。
2、肝素、酸性胶原(COLLAGEN)和生长因子的交联物的制备
1)hc-collagen系统的制备
本实施例中hc-collagen的制备与实施例1中hc-collagen的制备的区别在于反应温度是40℃，反应时间是5小时，其余步骤完全相同。
2)hc-collagen/bFGF的制备
本实施例中hc-collagen/bFGF的制备与实施例1中hc-collagen/bFGF的制备的区别在于孵育温度是40℃，孵育时间是1.5小时，其余步骤完全相同。
二、功能检测
1、检测肝素(heparin)对bFGF与DBM结合能力的影响
方法与实施例1相同，实验设3次重复，发现在含有相同浓度bFGF的孔中，HC-DBM比DBM结合了更多的bFGF，这表明肝素增强了bFGF与DBM的特异结合。
2、HC-COLLAGEN/bFGF在胶原凝胶上的细胞活性检测
方法与实施例1相同，实验设3次重复，发现生长在hc-collagen/bFGF的细胞要比collagen/bFGF和collagen/PBS要快的多，而且差异很显著，表明hc-collagen/bFGF具有更高的生物活性。
3、HC-DBM/bFGF在体内血管化检测
方法与实施例1相同，实验设3次重复。
第7天时，HC-DBM/bFGF组周围有很多组织侵入，将该组材料包裹。将材料进行免疫组化染色后，计算形成血管的数目，HC-DBM/bFGF的血管数要比DBM/bFGF和DBM/PBS多，且差异显著。
第14天时，HC-DBM/bFGF组要比DBM/PBS组、DBM/bFGF组大，可能是因为HC-DBM比DBM降解的慢。通过免疫组化染色，统计血管数目，发现HC-DBM/bFGF的血管数比DBM/PBS、DBM/bFGF多，而且DBM/PBS、DBM/bFGF的血管数比七天时数目变少了。
Claims (6)
1.一种制备肝素、胶原材料和生长因子的交联物的方法，包括以下步骤：
1)将肝素与胶原材料交联，得到肝素与胶原材料的交联体；
2)将生长因子与步骤1)中得到的交联体混合，孵育，得到肝素、胶原材料和生长因子的交联物；
所述步骤1)中将肝素与胶原材料交联的方法包括如下步骤：将肝素溶液与所述胶原材料混合，反应；所述反应的温度为30-40℃，反应的时间为3-5小时；
所述步骤2)中所述孵育的温度为30-40℃；所述孵育的时间为0.5-1.5小时；
所述胶原材料为脱钙骨基质或酸性胶原；所述生长因子为碱性成纤维生长因子；
所述交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为(0.2-0.4)∶(800-1200)∶(0.07-0.12)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，所述反应的温度为37℃，反应的时间为4小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，所述孵育的温度为37℃；所述孵育的时间为1小时。
4.一种由肝素、胶原材料和生长因子制备的交联物；
所述交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为(0.2-0.4)∶(800-1200)∶(0.07-0.12)；
所述交联物是由权利要求1-3任一所述的方法制备得到的。
5.根据权利要求4所述的交联物，其特征在于：所述交联物中肝素、胶原材料和生长因子的质量之比为0.31∶1000∶0.092。
6.权利要求4或5所述的交联物在制备促进血管再生的修复材料中的应用。
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