CN103180437A - 细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法 - Google Patents

Abstract

一种细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，制作具有动静脉袢、且构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网。根据该制造方法，可以在细胞片内构建血管网，如果将该细胞片进行叠层化，则可简便地制作具有厚度的细胞片叠层化物。这样的具有厚度的细胞片叠层化物作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗、和/或药剂等的评价中是有用的。

Description

细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法

技术领域

本发明涉及在医学、生物、药物开发、药学等领域有用的细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法。本申请是主张2010年9月14日提出的日本申请(日本特愿2010-225200)为基础的优先权的申请。

背景技术

今天，动物细胞培养技术显著进步，以动物细胞为对象的研究开发也广泛在各种领域被实施。成为对象的动物细胞的使用方法也不仅是开发当初的将细胞本身制品化、将其产生物制品化，现在通过分析细胞和/或其细胞表层蛋白质来设计有效的药物、将患者本人的细胞在活体外再生、或者提高其功能然后送回活体内进行治疗等方式也在逐渐被实施。现在，动物细胞的培养技术、以及评价、分析、利用的技术是研究者关注的一个领域。但是，包含人细胞在内，动物细胞大多是附着依赖性的。即，要在活体外培养动物细胞时，需要使它们一次性附着于基材表面。并且，不能将培养的细胞剥离成一个一个，还需要保持在该基材表面上培养的形态使其剥离。

特别对于使患者本人的细胞在活体外再生的技术而言，近年来，将治疗困难的脏器替换成他人的脏器的脏器移植已经一般化。成为对象的脏器也实际上多样化为皮肤、角膜、肾脏、肝脏、心脏等，另外，术后恢复也特别良好，作为一种医疗技术已经逐渐被确立。作为一例列举角膜移植，约50年前日本也设立眼库开始了移植活动。然而，据说供体数尚且少，仅国内每年需要角膜移植的患者约由2万人，与此相对，实际进行移植治疗的患者仅为约1/10的2000人左右。虽然有角膜移植这样基本确立的技术，但由于供体不足这样的问题，现状是要求其他的医疗技术。基于这样的背景，开发了要将患者本人的正常细胞培养至所需大小将其移植的技术。

日本特开平02-211865号公报(专利文献1)显示了在用对水的上限或者下限临界溶解温度为0～80℃的聚合物包覆了基材表面而得的细胞培养支撑体上，将细胞在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养，然后调整到上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，从而无酶处理而剥离培养细胞的新的细胞培养法。另外，日本特开平05-192138号公报(专利文献2)记载了，通过利用该温度应答性细胞培养基材将皮肤细胞在上限临界溶解温度以下或者下限临界溶解温度以上培养，然后调整至上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，从而以低损伤剥离培养皮肤细胞。通过利用温度应答性细胞培养基材，可以对现有的培养技术谋求各种新的展开。进而，日本再表02-008387号公报(专利文献3)中发现，在用温度应答性聚合物包覆了基材表面的细胞培养支撑体上培养心肌组织的细胞，得到心肌样细胞片，然后，使培养液温度为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，使培养的多层化细胞片粘附于聚合物膜，直接与聚合物膜一起剥离，并且用规定的方法使其3维结构化，从而可以构建结构缺陷少、作为活体外(in vitro)的心肌样组织具有数种功能的细胞片、和3维结构。然而，在上述的现有技术中，心肌样细胞片的叠层化不能无限进行，3层左右为极限，强烈要求能够简便地多次叠层化的技术。

为了解决如上问题，FASEB.J.，20(6)，708-710(2006)(非专利文献1)中尝试了在活体内将细胞片叠层化，显示得到了1mm厚的心肌片叠层化物。其中，已知为了获得有厚度的细胞片叠层化物，必须向被叠层化的各细胞或者各细胞片供给营养和/或氧，但在FASEB.J.，20(6)，708-710(2006)(非专利文献1)的方法中，需要反复向活体内移植细胞片，其必须相应于其次数地将移植部位开口，是对于被移植侧强加了大的负担的方法，强烈要求解决该课题的、能够简便地多次叠层化的技术。

现有技术文献

专利文献

专利文献1:日本特开平02-211865号公报

专利文献2:日本特开平05-192138号公报

专利文献3:日本再表02-008387号公报

非专利文献

非专利文献1:FASEB.J.，20(6)，708-710(2006)

发明内容

发明要解决的课题

本发明的目的是解决如上所述的关于细胞片的叠层化的问题。即，本发明提供基于与现有技术完全不同想法创造的新的细胞片叠层化物的制造方法、由该方法得到的具有血管网的细胞片叠层化物及其利用方法。

用于解决课题的方法

本发明者们为了解决上述课题而从各种角度实施研究而进行了研究开发。其结果发现，可以制作具有动静脉袢、且构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网，从而能简便地将细胞片较厚地进行叠层化。另外，利用由该方法得到的带血管网的细胞片叠层化物，可在活体外评价药剂对活体组织的效果。本发明是基于该见解而完成的。

即，本发明提供一种细胞片叠层化物的制造方法，其特征在于，制作具有动静脉袢、构建了毛细血管网的血管床，向该血管床上叠层细胞片，相对于活体内的组织片，通过在活体外灌注培养基而在细胞片内构建血管网。进而，本发明提供利用该细胞片叠层化物的方法。认为本发明是使用由利用血管床而能够在活体外制作有厚度的细胞片叠层化物这样的在世界上没有类似的新的想法而获得的细胞结构物而首次实现的极为重要的发明。另外，在本发明中，有时将细胞片叠层化物表达为细胞片叠层体、多层化细胞片叠层体，但都表示将细胞片进行多片叠层而得的物质，并不因这些表达的不同而受到任何限制。

发明的效果

根据本发明所示的制造方法，只要在细胞片内构建血管网，将该细胞片叠层化，就可以简便地制作有厚度的细胞片叠层化物。这样的有厚度的细胞片叠层化物可以作为活体内组织样的物质进行移植，可期待成为在各种组织的再生医疗中有用的物质。另外，利用通过利用血管床得到的带有血管网的细胞片叠层化物，从而可以简便地在活体外评价药剂对活体组织的效果。这样的评价体系不仅可代替实验动物，还可得到不依赖动物的个体差异的稳定的数据。

附图说明

图1是显示实施例1的血管床制作时的概要的图。

图2是显示向实施例1中得到的血管床灌注培养基时的情况的图。

图3是显示向实施例1中使用的血管床循环的培养基的概要的图。

图4是显示实施例1的细胞片叠层化物内的血管网的情况的图。

图5是显示实施例1的细胞片叠层化物内的血管网的情况的图。

图6是显示实施例2的细胞片叠层化物的活性的图。

图7是显示将实施例3的细胞片叠层化物进一步叠层时的情况的图。

图8是显示探索促进实施例4的细胞片叠层化物的血管新生的细胞因子的结果的图。由大鼠采取血液，用ELISA法测定血清中所含有的细胞因子浓度。

图9是显示实施例5的血管床制作时的概念图的图。

图10是显示在实施例4中制作的血管床内新形成的毛细血管的图。箭头所夹的区域为新生的毛细血管。

图11是为了确认实施例4中制作的细胞片叠层化物的功能而向活体内进行再移植的图。

具体实施方式

本发明的目的是简便地制作具有厚度的细胞片叠层化物。因此，要求如上述那样在细胞片叠层化物中构建血管网。为了简便地构建该血管网，本发明的特征在于，采取具有动脉及静脉且具有血流的活体组织片，通过在活体外灌注培养基而制成血管床，通过向该血管床叠层细胞片而在细胞片内构建血管网。

血管床是在活体组织、脏器中可见的结构，是指合并了毛细血管与其周围的组织的结构。血管床介由无数地遍布于在血管床内的毛细血管的薄壁，实现交换活体组织内的氧、葡萄糖、其他营养素的功能。像二氧化碳这样的老废物向血管床的毛细血管内渗出。在活体组织中组织液相对保持一定是因为存在通过毛细血管的物质交换。本发明中，为了在细胞片内有效地构建毛细血管网，并供给营养素、氧等而利用血管床。

在本发明中利用的血管床只要是具有动脉及静脉且具有血流的活体组织片、皮瓣、或具有动脉及静脉的人工血管床，任一种均可，没有特别限定。例如，作为活体组织片，肌肉、肠系膜、大网膜等已经高度地构建有血管网，因而优选。其中，肌肉是活体组织上营养、氧充分被供给的部位，即更进一步高度地构建有血管网，因而更优选。本发明中，可以对这些组织片、皮瓣、以及具有动脉及静脉的人工血管床进一步构建血管网。对其方法没有特别限定，可举出例如：对组织片、皮瓣封闭一部分血管，在活体内进行处理直至进一步构建血管网而血流循环的方法；此时在无菌的容器内封入该组织片、皮瓣，制作与活体仅通过动静脉连接的状态，在活体内进行处理直至血管网进一步构建而血流循环的方法；施与VEGF、FGF等促进血管新生的细胞因子的方法等。对本发明中使用的血管床的动物种的来源，没有特别限制，可举出例如，人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、绒猴、兔、狗、猫、绵羊、猪、山羊、猴、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等，将本发明的细胞片叠层化物用于人的治疗的情况下，优选使用来源于人、猪、猴、黑猩猩的血管床。

动静脉袢是指构建有如下那样的流路的血管流路，即，动脉与静脉连接，使血液、培养基等液体成分由一个部位或多个部位的血管流入时，液体成分由除了流入的血管以外的一个部位或多个部位的血管流出这样的流路。对于动静脉袢的长度没有特别限定，可根据血管床的大小来适当决定。对于连接动脉与静脉的方法没有特别限定，可在动脉与静脉之间构建毛细血管网，也可以使被切断的动脉的一端与被切断的静脉的一端吻合来制作。对于在动脉与静脉之间构建毛细血管网的方法没有特别限定，例如可举出，将动脉与静脉分别连接的活体组织片用电手术刀等切离，制作出活体组织片与动脉和静脉各一根连接的状态，维持该状态在活体内留置一周左右的方法。其结果是，在动脉与静脉之间发生毛细血管的短路(动静脉袢)，构建了由动脉介由毛细血管网返回静脉的流路。

本发明中的人工血管床是指构了建毛细血管网，并将毛细血管网之间用凝胶和/或细胞填充而得的血管床样结构物。来源于活体组织的血管床，除了构成毛细血管的细胞之外，还包含来源于组织的各种细胞。因此，在来源于活体组织的血管床上灌注培养细胞片叠层化物时，有时来源于血管床的细胞代谢物也混入细胞片叠层体。混入的细胞代谢物有时对于血管床上的细胞片的维持培养是优选的，和/或促进细胞片内的血管网形成而是优选的。另一方面，混入的细胞代谢物也有时根据构成细胞片的细胞的种类不同，而给维持培养带来不良影响，和/或根据叠层化的细胞片的使用用途(例如，在移植中利用、或评价细胞片的活性的情况下)不同而不优选。选择来源于活体的血管床还是人工血管床，根据目的来选择即可，没有特别限定。

对制作具有动脉及静脉的人工血管床的方法没有特别限定，可举出例如以下方法：使被无菌的容器内分隔的区域内，内包与活体内的动脉和静脉吻合的动静脉袢，在被分隔的区域内填充凝胶，通过留置于活体内来构建毛细血管网。作为制作人工血管床的容器，只要是活体适合性基材则没有特别限定，可以使用在医疗用器具等的领域通常的材料。作为具体例，可举出聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、尼龙、聚氨酯、聚脲、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚(甲基)丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸衍生物、聚丙烯腈、聚(甲基)丙烯酰胺、聚(甲基)丙烯酰胺衍生物、聚砜、聚碳酸酯、纤维、纤维衍生物、聚硅氧烷、玻璃、陶瓷、金属等。这些材料可以单独使用，也可以组合使用。人工血管床的大小，可根据制作的细胞片叠层化物、移植的细胞片叠层化物、制作人工血管床的活体组织的部位等适当进行最优化，没有特别限定。

对填充人工血管床的凝胶没有特别限定，在为了将得到的细胞片叠层化物用于向活体内移植治疗的情况下，包含生物降解性聚合物的凝胶是适合的。另外，这种情况下，生物降解性聚合物部分在活体内消失，本发明的细胞片叠层化物与活体通过血管连接。对这样的生物降解性聚合物的种类没有特别限定，可举出胶原、纤维蛋白、凝胶、多糖类、弹性蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白、壳多糖、脱乙酰壳多糖等的单独物质、或者2种以上的混合物。

可在填充于人工血管床的凝胶中混合细胞。混合于凝胶中的细胞可举出由活体组织直接采取的细胞、直接采取并通过培养系等使其分化后的细胞、或者细胞株，对其种类没有任何限制。例如，在以心肌组织的再生、或者评价心肌功能的方法为目的的情况下，作为使用的细胞，可列举心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肝组织的再生、模拟肝组织的人工肝脏的制作、或者评价肝组织的功能的方法等为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞(Kupffer cell)、陷窝细胞(pit cell)、胆管上皮细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾组织的再生、模拟肾组织的人工肾脏的制作、或者评价肾功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、肾小管细胞、中间细胞、肾小球细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾上腺组织的再生、模拟肾上腺的人工肾上腺的制作、或者评价肾上腺功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以皮肤的再生、或者评价皮肤功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以粘膜组织的再生、或者评价粘膜组织的功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，使用从构成粘膜的组织采取的细胞。作为粘膜的种类，可列举颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等。可列举从粘膜组织采取的细胞中任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。

对于上述的细胞的含有比率没有特别限定。此时，如果在人工血管床内混合血管内皮细胞、血管内皮前体细胞等，则人工血管床内的血管网的构建可高效地进行，因而优选。

可以通过在填充于人工血管床的凝胶中预先混合促进血管新生的血管生长因子等，来构建血管网。对在人工血管床中实施血管诱导的方法也没有特别限定，可举出例如，在凝胶中直接混合血管生长因子的方法；将作为血管生长因子的FGF包埋于微球，将该微球与凝胶进行混合，长时间由微球放出FGF的方法等。

对在血管床中灌注的培养基的流速没有特别限定，将不破坏血管床内的流路的程度的流速作为最大的流速，灌注的培养基向血管床内浸出、培养基可到达血管床表面的流速作为最小的流速即可。作为其数值，受到流路的大小和/或血管床的性质、大小、细胞片的大小等的因子很大影响，因此不能具体地显示。

本发明将这样操作得到的具有血管网的活体组织片、皮瓣，或具有动脉及静脉的人工血管床分离于活体外并设置于活体外的灌注培养装置中，在移植于血管床上的细胞片上构建血管网。此时，在血管床内循环的为培养基、血液、血清等，不特别限定，作为操作简便的物质可列举培养基。对于该培养基的种类，根据培养的细胞的种类按照常用方法进行适当选择即可，没有特别限定，优选适合构成在血管床上培养的细胞片的细胞的培养基。例如，如果将由心肌细胞形成的细胞片在血管床上叠层化，则优选培养心肌细胞的M199培养基等。对本发明的细胞片中使用的细胞的种类不特别限定，只要使用所得的细胞片叠层化物，并使用来自要移植的部位的细胞、或要评价的脏器或者来自组织的细胞即可。例如，在以心肌组织的再生、或者评价心肌功能的方法为目的的情况下，作为使用的细胞，可列举心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肝组织的再生、模拟肝组织的人工肝脏的制作、或者评价肝组织的功能的方法等为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞、陷窝细胞、胆管上皮细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾组织的再生、模拟肾组织的人工肾脏的制作、或者评价肾功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、肾小管细胞、中间细胞、肾小球细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以肾上腺组织的再生、模拟肾上腺的人工肾上腺的制作、或者评价肾上腺功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以皮肤的再生、或者评价皮肤功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，可列举表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞、血管内皮细胞、血管内皮前体细胞、成纤维细胞、来自骨髓的细胞、来自脂肪的细胞、间充质系干细胞的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。在以粘膜组织的再生、或者评价粘膜组织的功能的方法为目的的情况下，例如，作为使用的细胞，使用从构成粘膜的组织采取的细胞即可。作为粘膜的种类，可列举颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等。可列举从粘膜组织采取的细胞中的任1种、或者2种以上的细胞混合而成的混合物等，对于其种类没有任何限制。

对于上述的细胞的含有比率没有特别限定。此时，如果在细胞片内混合血管内皮细胞、血管内皮前体细胞等，则人工血管床内的血管网的构建能有效进行，因而优选。

本发明中使用的细胞可列举从活体组织直接采取的细胞、直接采取并用培养系等使其分化后的细胞、或者细胞株，对其种类没有任何限制。对这些的细胞的来源不特别限制，可列举例如，人、或者大鼠、小鼠、豚鼠、狨猴、兔、狗、猫、绵羊、猪、山羊、猴、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等，在将本发明的细胞片叠层化物用于人的治疗的情况下，优选使用来自人、猪、猴、黑猩猩的细胞。

对本发明中所利用的细胞不特别限定，例如可以是将细胞通过试剂、蛋白质、基因等的至少1种以上方法进行荧光染色和/或色素染色而得的细胞。在利用导入了报告基因的细胞时，只要检测由报告基因表达而形成的报告蛋白产生的荧光、或报告蛋白与特异性底物反应时放出的荧光，就可以知道细胞片或细胞片叠层体的活性。对利用的报告基因、或报告蛋白质不特别限定，可列举例如，绿色荧光蛋白质(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、DsReD、β-葡糖醛酸糖苷酶、LacZ、カエデ、萤光素酶、碱性磷酸酶等。向细胞导入基因的方法只要按照常规即可，不特别限定，可列举例如，脂质体转染法、病毒载体法、磷酸钙法、电穿孔法、DEAE葡聚糖法、微注射法等。另外，可以利用这些基因导入法，也可以利用来自报告基因已经被导入宿主基因组内的基因导入动物(转基因动物)的细胞。对于调节报告基因的表达的启动子序列不特别限定，根据报告基因表达的检测目的适宜选择即可。

本发明中的细胞片可以如下得到的：在表面包覆了水合力在0～80℃的温度范围变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在聚合物的水合力弱的温度区域培养细胞，然后，将培养基变化至形成聚合物的水合力强的状态的温度，从而将培养的细胞剥离成片状。此时，细胞在表面包覆了水合力在0～80℃的温度范围变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在聚合物的水合力弱的温度区域被培养。该温度通常优选作为培养细胞的温度的37℃。本发明中使用的温度应答性高分子可以使均聚物、共聚物的任一者。作为这样的高分子，可列举例如，日本特开平2-211865号公报所记载的聚合物。具体例如，可通过以下单体的均聚或共聚来获得。作为可使用的单体，可列举例如，(甲基)丙烯酰胺化合物、N-(或者N,N-二)烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物、或乙烯基醚衍生物，在共聚物的情况下，可以使用其中任意2种以上。进而，还可以使用与除了上述单体以外的单体类的共聚物、聚合物彼此的接枝或共聚、或聚合物、共聚物的混合物。另外，在不损害聚合物本来的性质的范围内还可以进行交联。此时，由于被培养、剥离的是细胞，因而分离在5℃～50℃的范围进行，因此作为温度应答性聚合物，可列举聚-N-正丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度21℃)、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度27℃)、聚-N-异丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度32℃)、聚-N-异丙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度43℃)、聚-N-环丙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度45℃)、聚-N-乙氧基乙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约35℃)、聚-N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约45℃)、聚-N-四氢糠基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约28℃)、聚-N-四氢糠基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度约35℃)、聚-N,N-乙基甲基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度56℃)、聚-N,N-二乙基丙烯酰胺(均聚体的下限临界溶解温度32℃)等。作为用于本发明中使用的共聚的单体，可列举聚丙烯酰胺、聚-N,N-二乙基丙烯酰胺、聚-N,N-二甲基丙烯酰胺、聚氧化乙烯、聚丙烯酸及其盐、聚甲基丙烯酸羟基乙酯、聚丙烯酸羟基乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯烷酮、纤维素、羧甲基纤维素等含水聚合物等，但不特别限制。

对本发明中使用的、向上述各聚合物的基材表面的包覆方法不特别限制，可以通过例如，将基材和上述单体或聚合物通过电子线照射(EB)、γ射线照射、紫外线照射、等离子体处理、电晕处理、有机聚合反应的任一方法，或者涂布、混炼等物理性吸附等来进行。向培养基材表面的温度应答性聚合物的包覆量可以为1.1～2.3μg/cm²的范围，优选为1.4～1.9μg/cm²，进一步优选为1.5～1.8μg/cm²。当包覆量少于1.1μg/cm²时，即使给予刺激也难以剥离该聚合物上的细胞，操作效率显著变差，因而不优选。相反如果为2.3μg/cm²以上，则细胞难以附着到该区域，使细胞充分附着变得困难。这种情况下，如果在温度应答性聚合物包覆层之上进一步包覆细胞粘附性蛋白质，则基材表面的温度应答性聚合物包覆量也可以为2.3μg/cm²以上，此时的温度应答性聚合物的包覆量可以为9.0μg/cm²以下，优选为8.0μg/cm²以下，最优选7.0μg/cm²以下。如果温度应答性聚合物的包覆量为9.0μg/cm²以上，则即使在温度应答性聚合物包覆层之上进一步包覆细胞粘附性蛋白质，细胞也难以附着，因而不优选。对这样的细胞粘附性蛋白质的种类没有任何限定，可列举例如，胶原、层粘连蛋白、层粘连蛋白5、纤连蛋白、基质凝胶(Matrigel)等的单独、或者2种以上的混合物。另外，这些细胞粘附性蛋白质的包覆方法按照常规方法即可，通常采取将细胞粘附性蛋白质的水溶液涂布在基材表面，然后除去该水溶液淋洗的方法。本发明是利用温度应答性培养皿尽可能利用细胞片本身的技术。因此，温度应答性聚合物层上的细胞粘附性蛋白质的包覆量极度多是不优选的。温度应答性聚合物的包覆量、以及细胞粘附性蛋白质的包覆量的测定按照常规方法即可，可列举例如，使用FT-IR-ATR直接测量细胞附着部的方法、将预先标记化的聚合物用同样的方法固定化而通过固定化于细胞附着部的标记化聚合物量来推测的方法等，可以使用任一方法。

在本发明的方法中，培养时接种的细胞数根据使用细胞的动物种不同而不同，一般可以为0.4×10⁶～2.5×10⁶个/cm²，优选为0.5×10⁶～2.1×10⁶个/cm²，进一步优选为0.6×10⁶～1.7×10⁶个/cm²。接种浓度为0.4×10⁶个/cm²以下时，一般细胞的增殖差，所得的细胞片的功能的表达程度恶化，在实施本发明的方面不优选。在本发明中，为了从温度应答性基材剥离回收培养的细胞片，通过使培养的细胞附着的培养基材的温度为培养基材上的包覆聚合物的上限临界溶解温度以上或者下限临界溶解温度以下，而可以使其剥离。此时，可以在培养基中进行，也可以在其他等渗液中进行，可以根据目的选择。更快、更高效地剥离、回收细胞，可以单独或合并使用轻敲、摇晃基材的方法、以及使用移液器搅拌培养基的方法等。除温度以外的培养条件按照常规方法即可，不特别限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，另外，也可以是未添加这样的血清的无血清培养基。

作为温度应答性聚合物，以聚(N-异丙基丙烯酰胺)为例来说明以上内容。聚(N-异丙基丙烯酰胺)作为在31℃具有下限临界溶解温度的聚合物被已知，在游走状态下，在水中在31℃以上的温度发生脱水合而聚合物链凝集、白浊。相反在31℃以下的温度下聚合物链水合，变成溶于水的状态。在本发明中，将该聚合物包覆、固定于培养皿等的基材表面。因此，在31℃以上的温度下，基材表面的聚合物也同样地脱水合，由于聚合物链包覆、固定于基材表面，因而基材表面显示疏水性。相反，在31℃以下的温度下，基材表面的聚合物水合，由于聚合物链被包覆、固定于基材表面，因而基材表面显示亲水性。这时的疏水表面是细胞能够附着、增殖的适度的表面，另外，亲水表面成为细胞不能附着程度的表面，培养中的细胞、或者细胞片也仅通过冷却就可以使其剥离。

作为被施加了包覆的基材，可以使用通常细胞培养中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能够赋予形态的物质，例如，可以使用除上述以外的聚合物化合物、陶瓷类等所有物质。

对本发明中的培养基材的形状不特别限制，可列举例如在皿、多板、烧瓶、多孔膜上培养的细胞插入样形态的基材、或者平膜状的基材等。作为被施行包覆的基材，可以使用通常细胞培养中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物，以及一般能够赋予形态的物质，例如，可以使用除上述以外的高分子化合物、陶瓷类等所有物质。

本发明中的细胞片在培养时不会受到由以分散酶(Dispase)、胰蛋白酶等为代表的蛋白质分解酶所产生的损伤。因此，从基材被剥离的细胞片具有粘附性蛋白质，在使细胞剥离成片状时以某种程度保持细胞-细胞间的桥粒结构。由此，可以在向血管床上装载时良好地粘附，高效生着。一般关于作为蛋白质分解酶的分散酶，已知对于细胞-细胞间的桥粒结构可以以10～40％保持的状态剥离，但由于基本破坏了细胞-基材间的基底膜样蛋白质等，因而所得的细胞片强度弱。与此相对，本发明的细胞片是桥粒结构、基底膜样蛋白质共同60％以上残存的状态，因而可以获得如上所示的各种效果。

对于制作本发明中的细胞片的叠层体的方法不特别限定，例如，可通过将培养细胞以片状剥离，根据需要使用培养细胞移动夹具使培养细胞片彼此叠层化来获得。此时，关于培养基的温度，在包覆于培养基材表面的上述聚合物具有上限临界溶解温度的情况下，为该温度以下，另外在上述聚合物具有下限临界溶解温度的情况下，只要为该温度以上就不特别限制。但是，自不待言，培养细胞不增殖那样的低温域、或培养细胞死灭那样的高温域下培养是不合适的。除温度以外的培养条件按照常规方法即可，不特别限制。例如，对于使用的培养基，可以是添加了公知的胎牛血清(FCS)等的血清的培养基，另外，也可以是未添加这样的血清的无血清培养基。另外，根据需要，还可以利用用于使细胞片移动的夹具。作为这样的夹具，只要能够捕捉剥离的细胞片，则对材质、形状都没有任何限定，作为这些材质，通常，聚1,1-二氟乙烯(PVDF)、硅、聚乙烯基醇、聚氨酯、纤维素及其衍生物、壳多糖、脱乙酰壳多糖、胶原、凝胶、纤维蛋白胶等材料制成膜状、多孔膜状、无纺布状、机织布状使其与细胞片接触来使用。

这样通过本发明，可得到有厚度的细胞片叠层化物。未像本发明这样构建血管网的情况下，为了叠层化的细胞片继续生存，只能叠层3层左右。根据本发明，可以将细胞片4层以上叠层化。此时，对叠层化方法不特别限定，与一次叠层化细胞片相比，优选将3层以下的细胞片分多次叠层化。另外，其叠层化时间优选为与血管床联系的血管网被充分构建时。叠层化次数适宜根据细胞片叠层化物的使用目的即可，不特别过问，优选为5层以上，更优选为10层以上，进一步优选为15层以上。如果细胞片叠层化物的厚度增加，则可以显著获得本发明的效果，另外可以在被移植位置移植大量的细胞，因而优选。另外，在本发明中，通过使2片的细胞片叠层化物的顶面彼此重合，可以获得在细胞片叠层化物的上面侧和下面侧双方具有流路的结构体，通过将该流路与活体侧连接，还可以高效地在细胞片叠层物内导入营养、氧。

作为促进细胞片叠层化物内、和细胞片叠层化物与血管床之间的毛细血管网的构建的方法，可列举在灌注于血管床的培养液、或浸渍血管床全体的培养液、或者这两方的培养液中添加促进血管新生的因子的方法。作为这里添加的因子，只要是诱导血管新生的因子即可，不特别限定。例如，血管内皮生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、促血管生成素、转化生长因子-β(TGF-β)、胎盘生长因子(PIGF)、MMP、或上述因子的家族蛋白等。作为在培养液中添加的促进血管新生的因子，可以从上述中选择一种，也可以二种以上组合。在培养液中添加的促进血管新生的因子的浓度受到细胞片所含的细胞的种类、数、细胞片的大小、血管床的种类以及各种因子较大影响，因而只要适宜最适化即可，这里不能具体显示。另外，本申请说明书中“培养液”和“培养基”这样的用语表示相同的含义。

VEGF被称为血管内皮细胞生长因子，是作为配基与一般位于血管内皮细胞表面的血管内皮细胞生长因子受体(VEGFR)结合的糖蛋白。刺激生长、游走、分化，和/或促进纤溶酶原激活物、胶原酶等蛋白酶活性、以及胶原凝胶中的血管样结构形成的所谓血管新生的全部阶段，在体内(in vivo)也促进血管新生的因子已知。VEGF具有增强微血管的血管身体性等的作用，还与单核细胞、巨噬细胞的活化有关。在本发明的情况下，作为添加于培养液中的浓度，可以是1pg/mL以上，优选10pg/mL以上，最优选20pg/mL以上。

HGF被称为指肝细胞生长因子，通常由成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等产生，是主要以作为控制上皮系细胞的生长和/或功能的旁分泌因子的作用为特征的因子。HGF不仅在肝实质细胞中，而且在血管内皮细胞中也具有促进游走能力、诱导管腔形成等的形态形成的作用、抗细胞凋亡作用、血管新生作用及免疫应答调节作用等。在本发明的情况下，作为培养液中添加的浓度，可以是15ng/mL以上，优选20Ng/mL以上，最优选25ng/mL以上。

FGF被称为成纤维细胞生长因子，是对以成纤维细胞为代表的各种细胞显示出生长活性和/或分化诱导等多种作用的多功能性细胞间信号因子。现在为止由结构上的类似性，在人中形成了由23种类组成的家族。其中，已知bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)也用于在心肌的缺血部位进行注射的冠状血管新生疗法，显示促进心脏的血管新生。在本发明的情况下，作为在培养液添加的浓度，可以添加10ng/mL以上的bFGF，优选15ng/mL以上，最优选20ng/mL以上。

PDGF被称为血小板衍生生长因子，是除了与间充质系细胞(成纤维细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞等)的游走及生长等的调节有关以外，还与胎儿的生长和/或血管新生有关的生长因子。主要由巨核细胞产生，此外在血小板的α颗粒中也含有。PDGF由上皮细胞和/或内皮细胞等各种细胞产生。PDGF中存在PDGF-A、B、C及D至少4种，A链及B链通过形成二硫键而采取同二聚体或异二聚物结构，从而具有3种同种型(PDGF-AA、AB、BB)。本领域技术人员有时将PDGF-AA表达为PDGF-aa、PDGF-AB表达为PDGF-ab、PDGF-BB表达为PDGF-bb，不能由于这些表达的不同而加以任何限制。在本发明的情况下，作为在培养液添加的浓度，PDGF-BB可以为4ng/mL以上，优选5ng/mL以上，最优选7ng/mL以上。

IGF被称为胰岛素样生长因子，是与胰岛素序列高度类似的多肽。认为IGF-2是初始的发生所要求的第一生长因子，相对于此，IGF-1的表达在之后的阶段被发现。胰岛素样生长因子1(IGF-1)主要在肝脏由生长激素(GH)的刺激的结果而分泌。人体的大部分细胞，特别是肌肉、骨、肝脏、肾脏、神经、皮肤及肺的细胞受到IGF-1的影响。还已知IGF-1促进血管新生。在本发明的情况下，作为在培养液添加的IGF-1的浓度，可以为600ng/mL以上，优选800ng/mL以上，最优选1000ng/mL以上。

可以将本发明所得的细胞片叠层化物移植到活体内的规定部位。对其方法不特别限制，可列举将设置在本发明的细胞片叠层化物中的流路与活体侧的血管连接的方法、使细胞片叠层化物表面向活体附着的方法等，此时，也可以在移植部位预先进行血管诱导，不特别限定。这里，对施行血管诱导的方法也不特别限定，可列举例如：将作为血管增殖因子的FGF包埋于微球，一边改变该微球的组成、大小、注入范围，一边对活体作用8～10天的方法；将聚对苯二甲酸乙二醇酯筛网切割成任意大小，制成袋状，在该袋的内侧加入溶解于高浓度琼脂糖溶液的FGF，8～10天后，除去该袋，从而制作血管诱导的空间的方法等。

如果对人利用本发明的细胞片叠层体，则移植的细胞片叠层体在人的活体内长时间表达功能。而且，可以通过剥离的细胞片叠层体的大小、形状、或者两者来控制功能的表达量。这样的细胞片叠层体，例如如果构成的细胞为心肌细胞、成心肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞这样的构成心脏组织的细胞，则可以用于伴有选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病和扩张型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治疗。另外，例如，如果为肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞、陷窝细胞、胆管上皮细胞、间充质系干细胞这样的构成肝组织的细胞，则可用于肝酶缺陷症、血友病、凝固异常症、肝功能不全症、重症肝炎、肝硬化、肝切除患者的治疗、感染症等的治疗、或肝功能的辅助。另外，例如，如果是肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、肾小管细胞、中间细胞、肾小球细胞这样的构成肾组织的细胞，则可用于肾功能障碍、肾功能不全、肾小球肾炎的治疗、感染症等的治疗、或肾功能的辅助。另外，例如，如果作为使用的细胞为肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞这样的构成肾上腺组织的细胞，则可用于肾上腺皮质功能不全、肾上腺皮质功能低下症、库欣综合症、醛固酮症、肾上腺低形成症、肾上腺酶缺陷症的治疗、感染症等的治疗、或肾上腺功能的辅助。另外，例如，如果作为使用的细胞为表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞这样的构成表皮组织的细胞，则可用于皮肤移植、毛发移植。另外，例如，如果是由颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等组织采取的构成粘膜的细胞，可用于粘膜疾病的治疗，感染症的治疗。它们可根据使用的细胞种类适当特定被移植部位，没有特别限定。

通过利用本发明的在血管床叠层化的细胞片叠层化物，可对于药剂的效果进行评价。例如，如果作为在血管床上叠层化的构成细胞片的细胞为心肌细胞、心成肌细胞、成肌细胞、间充质系干细胞这样的构成心脏组织的细胞，可评价用于伴有选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病和扩张型心肌病中的疾患或障害的各疾患的治疗的药剂等的效果。另外，例如，如果是肝实质细胞、窦内皮细胞、库普弗细胞、星状细胞、陷窝细胞、胆管上皮细胞、间充质系干细胞这样的构成肝组织的细胞，则可进行用于肝酶缺陷症、血友病、凝固异常症、肝功能不全症、重症肝炎、肝硬化、肝切除患者的治疗、感染症等治疗的药剂等的评价。另外，例如，如果是肾细胞、颗粒细胞、集合管上皮细胞、壁层上皮细胞、足细胞、系膜细胞、平滑肌细胞、肾小管细胞、中间细胞、肾小球细胞这样的构成肾组织的细胞，则可进行用于肾功能障碍、肾功能不全、肾小球肾炎的治疗、感染症等治疗的药剂等的评价。另外，例如，如果作为使用的细胞为肾上腺髓质细胞、肾上腺皮质细胞、球状带细胞、束状带细胞、网状带细胞这样的构成肾上腺组织的细胞，则可进行用于肾上腺皮质不全、肾上腺皮质功能低下症、库欣综合症、醛固酮症、肾上腺低形成症、肾上腺酶缺损症的治疗、感染症等的治疗的药剂等的评价。另外，例如，如果作为使用的细胞为表皮角质形成细胞、黑素细胞、竖毛肌细胞、毛囊细胞这样的构成皮肤组织的细胞，可进行用于皮肤移植、毛发移植、毛发再生的药剂等的评价。另外，例如，如果是由颊粘膜、胃粘膜、肠管粘膜、嗅上皮、口腔粘膜、子宫粘膜等组织采取这样的构成粘膜的细胞，则可进行用于粘膜疾病的治疗、感染症的药剂等的评价。

对于利用本发明的在血管床叠层化的细胞片叠层化物的在活体外的药剂等的评价方法，没有特别限定，例如可举出，检测在构成叠层化的细胞片的细胞中导入的报告基因的表达的方法。作为报告基因没有特别限定，例如可举出利用恒常地表达萤光素酶基因作为报告基因的细胞。可通过在灌注培养基中添加作为萤光素酶蛋白的底物的萤光素使其发光。流入细胞片内的底物量与细胞片内所构建的毛细血管网的量成比例。通过测定荧光强度，可比较细胞片内的毛细血管网的构建程度。另外，由萤光素酶蛋白引起的发光也与细胞内的ATP量成比例地变化。即，通过比较发光量，可比较细胞的代谢。利用该原理，通过在血管床上的细胞片叠层化物中灌注添加了任意药剂等的培养基，然后灌注底物，也可评价药剂对细胞片叠层化物的效果。根据所检测的发光量的变化，可进行与细胞的代谢有关的药剂等的评价。此外，灌注添加了任意药剂的培养基进行培养之后，通过检测培养基中溶出的细胞因子和/或其他的蛋白质、细胞代谢物，可评价药剂等对细胞片叠层化物的效果，检测由细胞产生的电信号。

如果使用利用了本发明的在血管床上叠层化的细胞片叠层化物的活体外的药剂等的评价方法，则在活体外也能评价目前为止必须施与动物或人才能评价的药剂等的效果。另外，由于利用模拟任意的组织的细胞片叠层化物，因而可以在几乎不受由其他的组织带来的影响的状态下，稳定且简便地评价药剂效果。期待本发明可用于新药剂等的开发。

如果对动物移植本发明的细胞片及细胞片叠层体，则成为药品评价用动物。并且，可以通过剥离的细胞片叠层体的大小和/或形状来控制功能的表达量。这里使用的动物可列举大鼠、小鼠、豚鼠、绒猴、兔子、狗、猪、山羊、猴、黑猩猩或它们的免疫缺陷动物等，没有特别限定。这样的移植动物，例如，可以将被检物质施与该动物，用于判定该被检物质对心功能的影响的心功能评价系统等，不特别限定。

实施例

以下，根据实施例更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例限制。

实施例1

作为促进向移植叠层化心肌组织内的血管新生的手段，切开大鼠的大腿部的表皮，通过电手术刀将包含大腿动静脉的四头肌骨格肌组织以1.5cm×2.0cm见方进行切离，制作出仅大腿动静脉与1.5cm×2.0cm见方的四头肌骨格肌组织连接的状态，维持该状态下，仅缝合切开的表皮。将以1.5cm×2.0cm见方切离的四头肌骨格肌组织在活体内留置一周，由此产生毛细血管的短路(动静脉袢)，制作具有由动脉返回静脉的血管网的脏器样的血管床(图1)。将产生动静脉袢的血管床由大鼠的大腿部完全切离，分别将大腿动脉、大腿静脉与灌注培养基的管连接，制作可使培养基在血管床内循环的组织灌注生物反应器(图2)。

与血管床生物反应器的制作并行，进行心肌细胞片的制作。心肌细胞使用由出生后0天的SD系大鼠的心脏分离培养的心肌细胞。由幼大鼠摘出心脏后，使用作为分解组织主要构成要素的胶原的酶的II型胶原酶(Worthington社制)来分离心肌细胞。将分离的心肌细胞以320×10⁴个细胞/皿的浓度接种于温度应答性培养皿(

，Dish Upcell Type-E(CellSeed社制))。4天后，心肌细胞在培养皿表面成为汇合状态时，使温度下降至20℃，从而回收片状的心肌细胞群。将该片进行3片多层化并作为心肌细胞片向连接有生物反应器的血管床移植，结果可将细胞片叠层化物在血管床上进行培养(图2)。

(使血管床内及血管床上的细胞片叠层化物内的毛细血管网成熟的方法的探索)

为了探索大鼠的血清中所含有的促进血管新生的细胞因子，在大鼠的心脏穿刺并进行采血，用ELISA法尝试检测(n=3)。其结果确认在大鼠血清中存在16pg/mL的bFGF(图4A)。因此，在用组织灌注生物反应器灌注的培养基中添加bFGF。

作为灌注液，选择添加了作为存在于血清中的浓度的1000倍量的16ng/mL的bFGF心肌细胞用培养液，进行培养(图3、4)。在血管床上移植细胞片叠层化物进行72小时培养后，为了确认血管新生及管腔结构，灌注墨汁代替培养基确认被染黑的区域(图4B)，其结果是，添加了bFGF培养而得的细胞片，与不添加bFGF进行灌注培养而得的细胞片叠层化物相比，在血管床内及细胞片叠层化物内大范围地观察到被染黑的区域。由该结果明确，如果在培养基中添加bFGF，则在血管床及细胞片叠层化物内构建了伴有管腔形成的毛细血管网(图4B)。

为了详细确认在心肌细胞片与血管床之间是否介由毛细血管而形成了连接，使用组织灌注生物反应器以30μL/分钟的流速进行墨汁或血液的灌注。其结果是，移植于血管床上的心肌细胞片的一部分被墨(图5上段)或血液(图5下段)强染色(图5)。另外，在H.E染色及Azan染色的组织切片的观察中也明确了墨流入了血管床上的心肌细胞片内部(图5)。进而通过使用CD31与心肌肌钙蛋白T抗体的免疫组织染色，可知在墨或红血球流入的周边部，血管内皮细胞形成管状的结构，从而明确了通过血管供给营养、氧(图5)。即，明确了即使不进行如FASEB.J.，20(6)，708-710(2006)(非专利文献1)所试验的在活体内的细胞片的叠层化，在体外条件下，也可以向心肌细胞片内进行血管诱导。

实施例2

(利用血管床上的心肌细胞片叠层体的药剂效果的测定方法)

在血管床上叠层化的细胞片，使用了由导入有萤光素酶基因的转基因大鼠出生后0天的心脏分离的细胞。通过与实施例1同样的方法，在血管床上叠层化细胞片，以添加FGF(16ng/mL)、不添加的方式进行灌注培养，72小时后，代替培养基，灌注含有作为萤光素酶蛋白的底物的萤光素的培养基，用图像分析仪测定荧光强度(图6)。荧光强度通过伪色彩表现，越为暖色则表示荧光强度越强(图6A、C)。依赖于底物及ATP浓度发荧光，荧光越强，表示细胞活性越高。将荧光强度图形化为图6B及D。如果添加FGF进行灌注培养，则与不添加进行灌注培养的相比，发现荧光强度强的倾向。由此可知，添加FGF进行灌注培养而得的细胞片叠层化物，与不添加进行灌注培养而得的相比，可诱导成熟的血管网，流入细胞片的培养基的量增加，显示高的细胞活性。

使用萤光素酶成像法尝试对于心肌细胞片叠层化物的药剂的评价。通过萤光素酶产生的荧光强度，如前述那样依赖于细胞活性和流入细胞片的萤光素浓度。叠层化的心肌片叠层化物，在血管床上也维持搏动，配合搏动，细胞片叠层化物内的毛细血管进行收缩、舒张。因此，在收缩时，灌注的培养基的量暂时减少。通过萤光素酶成像法经时观察荧光强度，结果明确了荧光强度增减。利用该发现，测定影响心肌细胞的药剂的效果。作为药剂使用β受体阻滞剂。β受体阻滞剂是在交感神经的肾上腺素受体中仅对β受体显示阻滞作用的药剂，临床上对降压药、和/或劳累性心绞痛患者的心绞痛状预防、心律不齐(心房纤维性颤动、窦性心动过速、期外收缩时的心跳数降低)、心力衰竭患者的心功能改善、和/或突然死亡、心肌梗塞等循环器官疾病使用。使用添加β受体阻滞剂的灌注培养基和不添加的培养基，作为通过实施例1所示的方法制作的细胞片叠层化物的灌注培养基，进行培养72小时。然后，灌注添加了萤光素的培养基，通过萤光素酶成像法，经时地观察荧光强度的变化。其结果是，添加了对照药剂的心肌细胞片的搏动的强度、发光次数、发光间隔几乎不受影响，用添加了β受体阻滞剂的培养基进行灌注培养的心肌细胞片叠层化物，发现荧光强度降低、发光次数减少、发光间隔延迟。由此明确了，根据本发明，通过利用心肌细胞片叠层化物，可以在体外简便而且定量地评价影响心肌功能的药剂的影响。

实施例3

(使心肌细胞片肥厚化的方法的探索)

向得到的构建了血管网的细胞片层上进一步移植3层的心肌细胞片，进而进行6天培养。其结果可知，在灌注液速度为30μL/分钟、50μL/分钟的任一情况下，后安放的细胞片生存，并在细胞片内构建了血管网(图7)。但是，以30μL/分钟灌注培养的细胞片，第1次叠层的区域的染色弱，以50μL/分钟灌注培养时第1次、第2次共同叠层的区域的染色强，因此在构建厚的细胞片叠层化物时，加快灌注液的流速较好。根据这些结果可确立以下方法：通过利用血管床作为血管新生的场所，在心肌片叠层化物的内部构建毛细血管网。

实施例4

(促进细胞片叠层化物内的血管新生的细胞因子的探索)

通过实施例1明确了，在利用血管床通过灌注生物反应器将细胞片进行叠层化的方法中，通过在灌注的培养液中添加bFGF，心肌细胞片内、及血管床与细胞片之间的毛细血管形成被促进。在实施例1中，作为由大鼠的采血方法使用对心脏的穿刺法。因此，通过穿刺施加刺激，诱导炎症反应等，考虑可能影响血中细胞因子浓度。因此，作为不进一步诱导刺激的采血方法，采用断头采血法进行采血。

用ELISA法测定血清中所含的与血管形成促进有关的细胞因子浓度(图8)。其结果判明，除了通过心脏穿刺法不能检测出的与血管新生有关的VEGF(22±23pg/ml)以外，还包含bFGF(21±9pg/ml)、HGF(33500±15218pg/ml)、PDGF-bb(7345±2976pg/ml)、IGF-1(1065565±384348pg/ml)，预测这些细胞因子恒常地促进血管新生。

因此，与实施例1同样，将心肌细胞片移植于血管床，使用图2所示的组织灌注生物反应器，使用分别含有VEGF为22pg/ml、bFGF为21pg/ml、HGF为33500pg/ml、PDGF-bb为7345pg/ml、IGF-1为1065565pg/ml、或不含有它们的心肌细胞培养液，以50μL/分钟的流速进行72小时灌注培养。其结果明确了，用分别添加了VEGF、bFGF、HGF、PDGF-bb、IGF-1的培养液进行灌注培养的情况下，与不添加细胞因子的培养液相比，在细胞片内、及血管床与细胞片之间毛细血管形成被促进。

实施例5

(在硅腔室内形成动静脉袢的人工血管床、及利用该人工血管床的细胞片叠层化物的制作方法)

作为在活体外制作细胞片叠层化物的血管床，制作利用硅腔室的人工血管床(图9)。

切开大鼠的表皮，仅将大腿动脉和大腿静脉由活体组织剥离。切断大腿动脉及大腿静脉，使大腿动脉与大腿静脉的切断面彼此吻合，制作动静脉袢(A-V loop)。在长1.5cm、宽1.5cm、厚度3mm的硅制的容器中，在以0.1mm厚的硅膜覆盖的硅腔室内，插入使活体内的动脉与静脉吻合而制作的动静脉袢，将其周围用2%去端肽胶原、10⁶个血管内皮细胞与成纤维细胞的混合物来填充。然后，缝合切开的表皮，将内包了动静脉袢的硅腔室在活体内留置2周(图9)。其结果是，由硅腔室内的动静脉袢新生了毛细血管网(图10)。图10显示，由利用硅腔室制作的血管床的动脉侧，以墨汁代替培养液来灌注而得的组织切片。黑色区域显示血管区域。箭头所夹的区域显示由静脉部分新生的血管。

2周后，再次切开大鼠的大腿部，切断连接于硅腔室内的大腿动脉及大腿静脉，由活体切离用硅腔室制作的人工血管床。除去硅腔室的以0.1mm厚覆盖的一面，代替图2所示的由活体组织片构成的血管床，将连接于硅腔室内的大腿动脉及大腿静脉与循环生物反应器的培养基的管结合。在用硅腔室制作的人工血管床上将细胞片进行叠层化，与实施例1同样地进行灌注培养。其结果与利用活体组织的血管床制作的细胞片叠层化物同样，在细胞片内、及血管床与细胞片之间形成毛细血管，可制作具有厚度的细胞片叠层化物。

实施例6

(用于确认细胞片叠层化物的功能的向活体的再移植)

通过移植于大鼠，来确认利用血管床制作的心肌细胞片叠层化物在移植时是否也具有功能(图11)。

使与实施例1中制作的叠层化有心肌细胞片的血管床连接的左大腿动脉与左内颈动脉吻合，使血管床的左大腿静脉与左外颈静脉吻合。其结果确认了血液正确地流入细胞片叠层化物。另外，确认了心肌细胞片的搏动被维持，从而确认了通过该方法制作的细胞片叠层化物在移植时也维持功能。

产业可利用性

根据本发明所示的制造方法，可以在细胞片内构建血管网，如果将该细胞片进行叠层化，则可简便地制作具有厚度的细胞片叠层化物。这样的具有厚度的细胞片叠层化物作为活体内组织样的物质，在各种组织的再生医疗中是有用的，同时在评价以治疗为目的的药剂的效果中是有用的。

Claims (18)

1.细胞片叠层化物，其特征在于，在具有动静脉袢、且构建有毛细血管网的血管床上叠层细胞片，构建通过在活体外灌注培养基而得到的毛细血管网。

2.根据权利要求1所述的细胞片叠层化物，其中，血管床为活体组织片。

3.根据权利要求2所述的细胞片叠层化物，其中，活体组织片为皮瓣。

4.根据权利要求2或3所述的细胞片叠层化物，其中，活体组织片来源于肌肉。

5.根据权利要求1所述的细胞片叠层化物，其中，血管床在被活体适合性基材分隔的区域内内包动静脉袢，在分隔的区域内填充凝胶，通过留置于活体内来构建毛细血管网。

6.根据权利要求5所述的细胞片叠层化物，其中，凝胶包含生物降解性聚合物和/或细胞。

7.根据权利要求1～6的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，培养基包含与血管新生促进有关的细胞因子。

8.根据权利要求1～7的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，细胞片是如下获得的：在表面包覆了在0～80℃的温度范围内水合力变化的聚合物的细胞培养支持体上，在聚合物的水合力弱的温度区域培养细胞，然后，使培养液变化至形成聚合物的水合力强的状态的温度进行培养，将培养而得的细胞以片状剥离。

9.根据权利要求1～8的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，在0～80℃的温度范围内水合力变化的聚合物为聚(N-异丙基丙烯酰胺)。

10.根据权利要求9所述的细胞片叠层化物，其中，细胞片被叠层化的次数为4以上。

11.根据权利要求1～10的任一项所述的细胞片叠层化物，其中，细胞为分别构成心脏组织、肝组织、肾组织、肾上腺组织、皮肤组织、粘膜组织的细胞，且在各个组织中，混合有任1种或2种以上的细胞。

12.根据权利要求11所述的细胞片叠层化物，其包含血管内皮细胞。

13.权利要求1～12的任一项所述的细胞片叠层化物的利用方法，其特征在于，将得到的细胞片叠层化物向活体内移植。

14.根据权利要求13所述的细胞片叠层化物的利用方法，其目的是向心肌组织移植，治疗选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥厚型心肌病、扩张期肥厚型心肌病和扩张型心肌病中的至少1种心脏疾患或障害。

15.药剂的评价方法，其中，利用权利要求11～14的任一项所述的细胞片叠层化物。

16.根据权利要求15所述的药剂的评价方法，其中，在构成细胞片叠层化物的细胞中导入有报告基因。

17.根据权利要求16所述的药剂的评价方法，其中，报告基因为萤光素酶基因。

18.根据权利要求17所述的药剂的评价方法，其中，评价的药剂为与心脏疾病有关的药剂。

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