CN103767804A - 一种具有微流体通道的血管化组织结构及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种具有微流体通道的血管化组织结构及其制备方法，属于组织工程及复合材料成形技术领域。该血管化组织结构包括组织结构主体、分支血管部分、毛细血管层和保护层。本发明实现稀溶液、细胞和水凝胶的复合成形。组织结构主体由含细胞的水凝胶喷射而成，水凝胶网格间分布了含或不含细胞的稀溶液；分支血管孔道由含细胞的水凝胶预留，孔道内分布了含或不含细胞的稀溶液，分支血管管壁为多孔结构；毛细血管层由合成高分子稀溶液喷涂或喷射形成，或由含细胞的稀溶液喷涂或喷射形成；支撑部分与保护层部分由合成或天然高分子溶液堆积成形；成形结构体两端有血管接口或呈开放式多通道，可用于体内移植或体外培养，促使血管化的发展。

Description

一种具有微流体通道的血管化组织结构及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有微流体通道的血管化组织结构及其制备方法，属于组织工程及复合材料成形技术领域。
背景技术
组织工程技术与器官制造技术为人类组织器官的修复再造提供了可能，其中涉及到生物学、材料学、机械学等学科。目前已经能够再造骨、软骨、皮肤、肝脏、肌肉、等组织或器官前体，但器官制造的技术尚处于发展阶段，急需解决血管化的问题，因为血管在器官中正常发挥新陈代谢的作用是器官制造的前提。
快速成形(RP,Rapid Prototyping)技术又叫增材制造(AM,Additive Manufacturing)，利用材料的逐层堆积实现结构体的成形。国外许多科研组已实现基于RP技术的含细胞三维结构体的组装或打印，如美国克莱姆森大学的三维喷墨生物打印技术[Boland T,et al.Biotechnologyjournal,2006,1(9):910]、美国亚利桑那大学的三维直写生物打印技术[Cooper GM,et al.TissueEngineering Part A,2010,16(5):1749]以及荷兰乌德勒支大学医学中心的三维纤维沉积技术[Fedorovich NE,et al.Tissue Engineering Part C,2011,18(1):33]等。国内清华大学器官制造中心(Center of Organ Manufacturing)开发出熔融挤压设备、单（双）头喷头（针头）低温沉积成形设备，并成功制备出了简单的血管网、肝组织和骨修复材料等[Wang XH,et al.Trends inBiotechnology,2007,25:505；Wang XH,et al.Tissue Engineering Part B,2010,16:189;Wang XH.Artificial organs,2012,36:591]。
快速成形技术也可用于制备宏观多孔的结构，这种镂空结构的制备大大节约了材料。国内中国科技大学和大连理工大学利用快速成形三维打印技术制备了多孔壳体（skin-framestructure），这种壳体为类桁架的镂空结构，既节约了原材料（塑料），又能保证原始性状和力学性能[Wang W,et al.ACM Transactions on Graphics(TOG),2013,32(6):177]。意大利比萨大学的Vozzi G等人利用微注射的方法，制备了六边形网格，成形结构精确[Vozzi G,et al.TissueEngineering,2002,8(6):1089-1098]。上述制备镂空结构的制备方法尚局限于合成高分子材料领域，在生物和水凝胶体系的应用少有提及；未来，镂空的水凝胶结构的应用将提高营养液在结构体中的交换速度。
微流体技术(MT,Microfluidics Technology)能在能在微观尺寸下控制、操作和检测复杂的流体，近年来在与微机械、生物工程等领域的交叉中进展迅速，芯片实验室(Lab on a chip)也应运而生。英国拉夫堡大学Capel AJ等人总结了五种快速成形技术在流体化学反应的应用，并提出制备小型反应器的制备[Capel AJ,et al.Lab on a Chip,2013,13(23):4583]。将快速成形技术与为流体技术结合是解决人造血管化组织的研究热点。美国宾夕法尼亚大学的Miller JS等人制备了三维的可溶解糖纤维支架，通入血液模拟剪切力的作用，完成了内皮细胞在血管通道的黏附，具有了初步的血管功能[Miller JS,et al.Nature materials,2012,11(9):768]。但是制备糖纤维支架费时费力，并且精度和几何复杂度也受到限制。
专利（申请号201210324600.4）提出了用旋转组合模具制备纺锤状复杂器官前体的方法，该方法通过模具的相对转动得到成形体外围的弧线，通过灌注方法得到成形体的主体，通过模具得到分支通道。但该方法的成形体外部形状难以精确保证；分支通道的路径可控性不强，分支通道的多重分支难以保证；成形体的中部未做处理，不易形成毛细血管，该方法的操作稳定性和结构复杂性有待提升。
通过以上分析，利用再生医学原理来构建体外组织器官已经成为医学和工程领域的研究热点。现有的快速成形和器官制造技术并不能制备出带微血管系统的可与人体动静脉血管直接连接的血管化组织器官结构。同时，微流体技术为分支血管和血管化的应用提供了很大可行性。这些因素促使我们利用复合多喷头快速成形技术制备具有微流体通道的血管化组织结构，实现高分子溶液、含细胞的水凝胶和含细胞的稀溶液多种材料的复合成形；分布于主体结构间和分支血管间的溶液有助于营养物质交换，毛细血管层模拟了体内毛细血管形态，本发明为制造含分支血管的器官和组织提供了参考。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有微流体通道的血管化组织结构及其制备方法，使其更好的模拟体内分支血管和毛细血管的形态，从而有助于营养物质的交换和细胞贴附。
一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述血管化组织结构包括组织结构主体、分支血管、毛细血管层和保护层；所述的分支血管分布于组织结构主体内部；所述毛细血管层位于组织结构主体内部，将组织结构主体和分支血管分为两部分，并分别与分支血管构成一体；所述保护层位于组织结构主体外部；所述的组织结构主体为逐层堆积的含细胞的天然高分子水凝胶的交叉结构，该交叉结构的网格间和层间分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含有或不含细胞，并呈微流体状态；分支血管管壁为类桁架或类碳纳米管的天然高分子水凝胶结构；分支血管孔道内分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含或不含细胞，呈层流态；分支血管含至少一个入口和至少一个出口，入口和出口与体内血管或生物反应器相连；所述的毛细血管层为含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，该细胞形成毛细血管内皮网眼结构，或为不含细胞的合成高分子溶液，经萃取有机溶剂后形成多孔结构；所述的保护层为天然或合成高分子。
上述技术方案中，所述组织结构主体交叉结构的网格间和层间分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述分支血管孔道内分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述毛细血管层的含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述毛细血管层的不含细胞的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中至少一种；该合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子溶液的质量体积浓度为0.1～10%。
本发明所述的分支血管孔径为0.01～5mm。所述毛细血管层层厚为0.01～20mm。所述的保护层的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；该合成高分子稀溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～30%。所述细胞为成体组织细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞的至少一种。
本发明提供的一种具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)利用计算机设计所述具有微流体通道的血管化组织结构的三维模型；
2)采用复合多喷头快速成形设备，成形室温度控制在40℃～-30℃；该设备喷头组件包括挤压式喷头、滴加式喷头和喷洒式喷头；将配置好的含细胞的天然高分子水凝胶、含或不含细胞的能维持细胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分别装入不同类型的喷头组件中；
3)采用挤压式喷头组件打印至少一层天然高分子水凝胶或合成高分子溶液，得到支撑部分；
4）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的交叉结构，然后采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于交叉结构的网格间和层间，得到组织结构主体；
5）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的类桁架或碳纳米管结构分支血管壁，再采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于类桁架或类碳纳米管孔道内，得到分支血管；
6）采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒不含细胞的合成高分子稀溶液，并萃取有机溶剂，或采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含细胞的且能使细胞生存的稀溶液，形成毛细血管层；
7）采用挤压式喷头组件打印至少一层或喷洒式喷头组件喷洒合成高分子溶液于组织结构主体外部，并萃取有机溶剂，得到保护层；
8）重复步骤4）、5）和7），成形过程结束后移除支撑部分，最终得到所述具有微流体通道的血管化组织结构。
本发明所述的制备方法，其特征在于：所述挤压式喷头喷嘴内径为10～1000μm；所述滴加式喷头喷嘴内径为10～100μm；所述喷洒式喷头喷嘴喷涂范围为0.01～10cm2。所述组织结构主体、分支血管和支撑部分的天然高分子水凝胶为质量体积浓度为0.5～10%的海藻酸钠、质量体积浓度为0.5～10%的胶原、质量体积浓度为0.5～10%的基质胶、质量体积浓度为1～20%的右旋糖、质量体积浓度为0.5～5%的纤维蛋白原和质量体积浓度为5～30%的明胶中的至少一种。
本发明所述的制备方法，其特征在于：所述支撑部分的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；合成高分子的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环；合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～40%。
本发明所述的制备方法，其特征在于：成形室温度在-30～4℃时，含细胞的天然高分子水凝胶和能维持细胞生存的稀溶液中需加入冻存剂，冻存剂为体积百分浓度为1%～20%的二甲基亚砜、体积百分浓度为1%～20%的甘油和质量体积浓度1%～20%右旋糖中的至少一种；成形后三维结构体在-80℃及其以下的温度保存，择时复苏。
本发明与现有技术相比，有以下优点及突出性的技术效果：①本发明的组织结构主体天然高分子水凝胶交叉结构网格间和层间分布有含或不含细胞且能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液形成微流体状态，便于营养物质交换；交叉结构的网格间和层间溶液在结构体内连通，有助于营养物质的交换和细胞贴附。②本发明的分支血管管壁为类桁架或类碳纳米管的天然高分子水凝胶结构，便于营养物质交换和细胞贴附；分支血管孔道内分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含或不含细胞，呈层流态，便于营养物质交换；分支血管的入口和出口能与脉动培养系统或体内血管链接。③本发明的毛细血管层与分支血管链接模拟了体内血管的交换区域，且毛细血管层的毛细血管内皮网眼结构或合成高分子多孔结构为模拟了体内毛细血管的形态，便于营养物质交换。④本发明的保护层对组织结构内部起着物理、化学和生物上的保护作用；能够维持组织结构体的稳定。
附图说明
图1为具有微流体通道的血管化组织结构的截面示意图。
图2为未移除支撑部分的具有微流体通道的血管化组织结构截面图。
图3a、图3b和为图3c分别为挤压式喷头组件、滴加式喷头组件和喷洒式喷头组件的结构示意图。
图4为组织结构主体的交叉结构。
图5为含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液。
图6a、图6b和图6c分别为分支血管、分支血管管壁的类碳纳米管结构和分支血管管壁的类桁架结构。
图7为呈多孔结构的毛细血管层。
图中：
101—组织结构主体；       102—分支血管；        103—毛细血管层；
104—保护层；             105—支撑部分；
301—挤压式喷头组件喷嘴； 302—挤出的材料；      303—滴加式喷头组件喷嘴；
304—滴加的材料；         305—喷洒式喷嘴；      306—喷洒的材料。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1为具有微流体通道的血管化组织结构的截面示意图，所述血管化组织结构包括组织结构主体101、分支血管102、毛细血管层103和保护层104；所述的分支血管102分布于组织结构主体101内部；所述毛细血管层103位于组织结构主体101内部，将组织结构主体101和分支血管102分为两部分，并分别与分支血管102构成一体；所述保护层104位于组织结构主体101外部；所述的组织结构主体101为逐层堆积的含细胞的天然高分子水凝胶的交叉结构，该交叉结构的网格间和层间分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含有或不含细胞，并呈微流体状态，如图4；分支血管102管壁为类桁架或类碳纳米管的天然高分子水凝胶结构，如图6；分支血管102孔道内分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含或不含细胞，呈层流态；分支血管102含至少一个入口和至少一个出口，入口和出口与体内血管或生物反应器相连；所述的毛细血管层103为含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，该细胞形成如图7的毛细血管内皮网眼结构，或为不含细胞的合成高分子溶液，经萃取有机溶剂后形成多孔结构；所述的保护层104为天然或合成高分子。
所述组织结构主体交叉结构的网格间和层间分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述分支血管孔道内分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述毛细血管层的含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。所述毛细血管层的不含细胞的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中至少一种；该合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子溶液的质量体积浓度为0.1～10%。所述分支血管孔径为0.01～5mm。所述毛细血管层层厚为0.01～20mm。所述的保护层的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；该合成高分子稀溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～30%。所述细胞为成体组织细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞的至少一种。
图2为未移除支撑部分的具有微流体通道的血管化组织结构截面图，成形过程结束后移除支撑结构。所述支撑部分的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；合成高分子的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环；合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～40%。
本发明提供的一种具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：1)利用计算机设计所述具有微流体通道的血管化组织结构的三维模型；2)采用复合多喷头快速成形设备，成形室温度控制在40℃～-30℃；该设备喷头组件包括挤压式喷头、滴加式喷头和喷洒式喷头；将配置好的含细胞的天然高分子水凝胶、含或不含细胞的能维持细胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分别装入不同类型的喷头组件中；3)采用挤压式喷头组件打印至少一层天然高分子水凝胶或合成高分子溶液，得到支撑部分；4）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的交叉结构，然后采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于交叉结构的网格间和层间，得到组织结构主体；5）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的类桁架或碳纳米管结构分支血管壁，再采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于类桁架或类碳纳米管孔道内，得到分支血管；6）采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒不含细胞的合成高分子稀溶液，并萃取有机溶剂，或采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含细胞的且能使细胞生存的稀溶液，形成毛细血管层；7）采用挤压式喷头组件打印至少一层或喷洒式喷头组件喷洒合成高分子溶液于组织结构主体外部，并萃取有机溶剂，得到保护层；8）重复步骤4）、5）和7），成形过程结束后移除支撑部分，最终得到所述具有微流体通道的血管化组织结构。上述步骤3）～8）可先后或同步，以实现所述具有微流体通道的血管化组织结构的
图3a、图3b和为图3c分别为挤压式喷头组件301、滴加式喷头组件303和喷洒式喷头组件305的结构示意图。所述挤压式喷头喷嘴内径为10～1000μm；所述滴加式喷头喷嘴内径为10～100μm；所述喷洒式喷头喷嘴喷涂范围为0.01～10cm2。
本发明所述的组织结构主体、分支血管和支撑部分的天然高分子水凝胶为质量体积浓度为0.5～10%的海藻酸钠、质量体积浓度为0.5～10%的胶原、质量体积浓度为0.5～10%的基质胶、质量体积浓度为1～20%的右旋糖、质量体积浓度为0.5～5%的纤维蛋白原和质量体积浓度为5～30%的明胶中的至少一种。成形室温度在-30～4℃时，含细胞的天然高分子水凝胶和能维持细胞生存的稀溶液中需加入冻存剂，冻存剂为体积百分浓度为1%～20%的二甲基亚砜、体积百分浓度为1%～20%的甘油和质量体积浓度1%～20%右旋糖中的至少一种；成形后三维结构体在-80℃及其以下的温度保存，择时复苏。
下面举出几个具体的实施例，以进一步理解本发明。
实施例1：制备具有微流体通道的血管化肝组织
(1)细胞的提取：提取人体脂肪干细胞(ADSC)和肝细胞(Hep)，培养传代。
(2)水凝胶的制备：将明胶和海藻酸钠粉末分别溶于培养液(DMEM,dulbecco′s modifiedeagle medium)中，得到质量体积浓度为10%的明胶溶液和质量体积浓度为2%的海藻酸钠溶液，以上述明胶溶液、海藻酸钠溶液等体积混合得到水凝胶待用。
(3)合成高分子溶液的制备：将可降解聚碳酸酯溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为2%和质量体积浓度为25%的溶液待用。
(4)含细胞的基质材料的制备：将肝细胞(Hep)、二甲基亚砜冻存剂和上述水凝胶材料溶液混合，水凝胶溶液的肝细胞(Hep)浓度为1×106个/mL，二甲基亚砜冻存剂体积浓度为10%；将脂肪干细胞(ADSC)、二甲基亚砜冻存剂和DMEM培养液混合，DMEM稀溶液的ADSC浓度为2×105个/mL，二甲基亚砜冻存剂的体积浓度为10%。
(5)成形过程：由计算机控制快速成形设备的运动，成形室温度设置为-20℃，其中一个喷头组件采用挤压式喷头组件打印含Hep的水凝胶，一喷头组件利用滴加式喷头组件滴加含ADSC的DMEM稀溶液，形成组织结构主体、分支血管和毛细血管层；一喷头组件采用挤压式喷头组件打印质量体积浓度为2%聚碳酸酯，形成保护层；一喷头组件采用挤压式喷头组件打印质量体积浓度为25%聚碳酸酯，形成支撑部分；成形结束后，解冻复苏，并利用质量体积浓度为5%的CaCl2交联海藻酸钠2min。
(6)后期培养：采用脉动反应器培养上述成形结构，采用血管化生长因子使得血管种子细胞ADSC内皮化，并在毛细血管层实现血管化。
实施例2：制备具有微流体通道的血管化脂肪组织
(1)细胞的提取：提取人体脂肪干细胞(ADSC)，培养传代。
(2)水凝胶的制备：将天然高分子材料粉末溶于DMEM培养液，得到质量体积浓度为20%的明胶溶液、质量体积浓度为1%的纤维蛋白原溶液，以上述明胶溶液、纤维蛋白原溶液等体积混合得到水凝胶材料溶液待用。
(3)合成高分子溶液的制备：将PLGA溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为2%和15%的溶液待用。
(4)含细胞的材料的制备：将脂肪干细胞(ADSC)、甘油冻存剂和上述水凝胶材料溶液混合，水凝胶溶液的ADSC浓度为5×106个/mL，甘油冻存剂的体积浓度为10%；将脂肪干细胞(ADSC)、甘油冻存剂和培养液混合，DMEM稀溶液的ADSC浓度为1×105个/mL，甘油冻存剂的体积浓度为10%。
(5)成形过程：由计算机控制快速成形设备的运动，成形室温度设置为-30℃，其中一个喷头组件采用挤压式喷头组件打印含ADSC的水凝胶，得到组织结构主体；一喷头组件利用喷洒式喷头组件喷洒质量体积浓度为2%的PLGA，并萃取形成毛细血管层；一组喷头采用挤压式喷头组件打印质量体积浓度为15%的PLGA，形成保护层；一组喷头利用利用花洒式喷头组件喷洒含ADSC的DMEM于组织结构主体间；成形结束后，解冻复苏，利用浓度为1000U的凝血酶溶液将纤维蛋白原聚合2min。
(6)后期培养：采用体内培养，将整体结构连接体内血管系统；使得部分ADSC转化为脂肪细胞，部分ADSC贴附与分支血管内壁，并在模拟毛细血管部位形成毛细血管的结构，实现血管化的稳定。
实施例3：制备具有微流体通道的血管化肺气管组织
(1)细胞的提取：提取人体脂肪干细胞(ADSC)和肺细胞(Pne)，培养传代。
(2)水凝胶的制备：将明胶材料粉末溶于DMEM培养液，得到质量体积浓度为15%的明胶溶液。
(3)合成高分子溶液的制备：将不可降解PU溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为5%的合成高分子溶液。
(4)含细胞的基质材料的制备：将肺细胞(Pne)和上述明胶粘溶液混合，得到浓度为1×106个/mL的含Pne水凝胶；将脂肪干细胞(ADSC)和培养液混合，得到ADSC浓度为1×106个/mL的DMEM悬浮稀溶液。
(5)成形过程：由计算机控制快速成形设备的运动，成形室温度设置为0℃，其中一个喷头组件采用挤压式喷头组件控制含Pne的明胶的三维堆积，使支撑部分和组织结构主体成形；一喷头组件利用喷洒式喷头组件喷洒含ADSC的DMEM稀溶液于组织结构主体网格间；一喷头组件利用喷洒式喷头组件喷洒质量体积浓度为5%的PU，形成毛细血管层；成形结束后，不需要解冻复苏，不需交联明胶，直接用DMEM培养液萃取有机溶剂四乙二醇可。
(5)后期培养：采用体外静态培养上述成形结构，采用血管细胞生长因子等使得ADSC转化为血管细胞结构，实现血管化的稳定。
实施例4：制备具有微流体通道的血管化胰岛组织
(1)细胞的提取：提取人体内皮细胞(EC)和胰岛细胞(β细胞)，培养传代。
(2)水凝胶的制备：将明胶粉末溶于DMEM培养液，得到质量体积浓度为10%和20%的明胶溶液；将胶原溶于醋酸溶液，得到质量体积浓度为0.01%的胶原溶液，调节PH值至6.8。
(3)合成高分子溶液的制备：将PLGA溶于四乙二醇中得到体积浓度为5%的溶液。
(4)含细胞的基质材料的制备：将胰岛细胞(β细胞)和上述明胶溶液混合，得到β细胞浓度为1×106个/mL的水凝胶；将内皮细胞(EC)和DMEM培养液混合，得到浓度为1×107个/mL的内皮细胞溶液。
(5)成形过程：成形室温度设置为5℃，其中挤压式喷头控制β细胞的质量体积浓度为20%水凝胶的主体部分三维堆积，另一挤压式喷头组件打印10%水凝胶，形成支撑部分和组织结构主体，滴加式喷头组件滴加含EC的DMEM稀溶液，使溶液分布于组织结构主体和分支血管内；喷洒式喷头组件喷洒质量浓度为5%的PLGA，并萃取，得到毛细血管层；成形结束后，用DMEM培养液萃取PLGA中的四乙二醇。
(6)后期培养：采用体外静态培养上述成形结构，在组织结构主体、分支血管和毛细血管层形成内皮化结构。
实施例5：制备具有微流体通道的血管化心肌组织
(1)细胞的提取：提取人体脂肪干细胞(ADSC)、内皮细胞（EC）和心肌细胞(CMC)，培养传代。
(2)水凝胶的制备：将明胶粉末溶于DMEM培养液，得到质量体积浓度为10%的明胶溶液。
(3)合成高分子溶液的制备：将可降解PCL溶于四乙二醇中得到质量体积浓度为1%的溶液待用。
(4)含细胞的基质材料的制备：将心肌细胞(CMC)和上述明胶材料混合，得到CMC浓度为1×105个/mL的水凝胶；将脂肪干细胞(ADSC)、内皮细胞(EC)和培养液(DMEM)混合，得到ADSC和EC浓度均为1×106个/mL的DMEM溶液。
(5)成形过程：
由计算机控制快速成形设备的运动，一个喷头组件采用挤压式喷头组件控制含CMC的明胶的三维堆积，使支撑部分和组织结构主体成形；一喷头组件利用喷洒式喷头组件喷洒含ADSC和EC的DMEM稀溶液于组织结构主体网格间和层间；一喷头组件利用喷洒式喷头组件喷洒质量体积浓度为5%的PCL，形成毛细血管层；成形结束后，不需要解冻复苏，不需交联明胶，直接用DMEM培养液萃取有机溶剂四乙二醇可。
(6)后期培养：采用外脉动反应器培养上述成形结构，采用血管化生长因子使得血管种子细胞ADSC内皮化，并在模拟毛细血管部位形成毛细血管的结构，实现血管化的稳定。

Claims (14)

1.一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述血管化组织结构包括组织结构主体(101)、分支血管(102)、毛细血管层(103)和保护层(104)；所述的分支血管(102)分布于组织结构主体(101)内部；所述毛细血管层(103)位于组织结构主体(101)内部，将组织结构主体(101)和分支血管（102）分为两部分，并分别与分支血管（102）构成一体；所述保护层(104)位于组织结构主体(101)外部；所述的组织结构主体(101)为逐层堆积的含细胞的天然高分子水凝胶的交叉结构，该交叉结构的网格间和层间分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含有或不含细胞，并呈微流体状态；分支血管(102)管壁为类桁架或类碳纳米管的天然高分子水凝胶结构；分支血管(102)孔道内分布有能维持细胞生存的稀溶液，该稀溶液含或不含细胞，呈层流态；分支血管(102)含至少一个入口和至少一个出口，入口和出口与体内血管或生物反应器相连；所述的毛细血管层(103)为含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，该细胞形成毛细血管内皮网眼结构，或为不含细胞的合成高分子溶液，经萃取有机溶剂后形成多孔结构；所述的保护层(104)为天然或合成高分子。
2.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述组织结构主体交叉结构的网格间和层间分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。
3.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述分支血管孔道内分布的能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。
4.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述毛细血管层的含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液为磷酸盐缓冲液、细胞培养基、生理盐水和体液中的至少一种。
5.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述毛细血管层的不含细胞的合成高分子溶液的溶质为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中至少一种；该合成高分子溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子溶液的质量体积浓度为0.1～10%。
6.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述分支血管孔径为0.01～5mm。
7.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述毛细血管层层厚为0.01～20mm。
8.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述的保护层的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；该合成高分子稀溶液的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环，合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～30%。
9.如权利要求1所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构，其特征在于：所述细胞为成体组织细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞的至少一种。
10.一种如权利要求1所述具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
1)利用计算机设计所述具有微流体通道的血管化组织结构的三维模型；
2)采用复合多喷头快速成形设备，成形室温度控制在40℃～-30℃；该设备喷头组件包括挤压式喷头（301）、滴加式喷头（303）和喷洒式喷头（305）；将配置好的含细胞的天然高分子水凝胶、含或不含细胞的能维持细胞生存的稀溶液和合成高分子溶液分别装入不同类型的喷头组件中；
3)采用挤压式喷头组件打印至少一层天然高分子水凝胶或合成高分子溶液，得到支撑部分；
4）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的交叉结构，然后采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于交叉结构的网格间和层间，得到组织结构主体；
5）采用挤压式喷头组件打印至少一层所述含细胞的天然高分子水凝胶，得到水凝胶的类桁架或碳纳米管结构分支血管壁，再采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含或不含细胞的且能维持细胞生存的稀溶液，使该稀溶液分布于类桁架或类碳纳米管孔道内，得到分支血管；
6）采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒不含细胞的合成高分子稀溶液，并萃取有机溶剂，或采用滴加式喷头组件滴加或喷洒式喷头组件喷洒含细胞的且能使细胞生存的稀溶液，形成毛细血管层；
7）采用挤压式喷头组件打印至少一层或喷洒式喷头组件喷洒合成高分子溶液于组织结构主体外部，并萃取有机溶剂，得到保护层；
8）重复步骤4）、5）和7），成形过程结束后移除支撑部分，最终得到所述具有微流体通道的血管化组织结构。
11.如权利要求10所述的具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于：所述挤压式喷头喷嘴内径为10～1000μm；所述滴加式喷头喷嘴内径为10～100μm；所述喷洒式喷头喷嘴喷涂范围为0.01～10cm2。
12.如权利要求10所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于：所述组织结构主体、分支血管和支撑部分的天然高分子水凝胶为质量体积浓度为0.5～10%的海藻酸钠、质量体积浓度为0.5～10%的胶原、质量体积浓度为0.5～10%的基质胶、质量体积浓度为1～20%的右旋糖、质量体积浓度为0.5～5%的纤维蛋白原和质量体积浓度为5～30%的明胶中的至少一种。
13.如权利要求10所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于：所述支撑部分的合成高分子为聚氨酯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚酯和聚羟基酸酯中的至少一种；合成高分子的溶剂为四乙二醇或1,4-二氧六环；合成高分子稀溶液的质量体积浓度为0.1～40%。
14.如权利要求10所述的一种具有微流体通道的血管化组织结构的制备方法，其特征在于：成形室温度在-30～4℃时，含细胞的天然高分子水凝胶和能维持细胞生存的稀溶液中需加入冻存剂，冻存剂为体积百分浓度为1%～20%的二甲基亚砜、体积百分浓度为1%～20%的甘油和质量体积浓度1%～20%右旋糖中的至少一种；成形后三维结构体在-80℃及其以下的温度保存，择时复苏。
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