CN107164318B - 基于3d生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏 - Google Patents

基于3d生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏，涉及组织工程、生物技术领域。此方法包括：逆向建模构建心脏三维网格模型，并将心脏三维网格模型的数据导入双喷头生物打印机，根据预先设计的CAD数字模型及选定的成形参数，驱动打印机的喷头运动，其中，打印机的喷头1装入牺牲材料用于打印支撑骨架，喷头2喷出生物墨水，得构建体。将构建体交联，清洗，三维培养形成中空状血管化心脏。生物墨水的有效成分包括：水凝胶、富血小板血浆、第三代人脐静脉内皮细胞以及SD大鼠原代心肌细胞，解决了大尺寸、中空状血管化一体化打印困难的问题。该方法制得的中空状血管化心脏具有较高的细胞活性及一定的功能。

Description

基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状 血管化心脏
技术领域
本发明涉及生物技术领域，且特别涉及一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏。
背景技术
心血管疾病具有很高的发病率与死亡率，严重威胁人类健康和生活质量，同时也造成了巨大的社会经济负担。由于成熟心肌细胞属于终末分化期永久性细胞，不具有再生能力，一旦坏死后，梗死区域炎性细胞浸润，细胞基质降解，室壁病理性重建形成纤维化的瘢痕组织，使梗死区室壁变薄，心肌收缩功能减弱，进一步导致心室扩大，最终发展为心力衰竭，甚至死亡。现有的治疗手段虽然能在一定程度上改善症状，但并不能彻底地治愈。因此对于心力衰竭晚期的患者而言，心脏移植仍然是最佳选择并且具有较好的长期疗效。遗憾的是，限于供体器官的缺乏、昂贵的手术费用、移植的排斥反应及移植器官衰竭等因素，心脏移植受到了限制，绝大多数病人在等待供体的过程中离世。因此，供体不足已成为当前医学界亟待解决的问题之一。而心肌组织工程的兴起为人类最终解决这一难题带来了希望。数年来，研究人员在心肌组织工程研究方面取得了一系列进展，初步探索出不同的种子细胞、支架材料和体外构建方法，并在动物移植实验中取得初步成绩，这些成就为人类最终战胜缺血性心血管疾病带来了希望。然而传统的组织工程化心肌组织存在较多的缺陷，仍不能满足实际需要。
近年来，3D生物打印技术已被应用到组织工程学中，希望利用该技术实现体外组织、器官的复制，由于该技术能精确控制生物材料、细胞的位置与分布，能够个性化构建工程化组织器官，同时具有最大仿生性和最小排异性等特点，在很大程度上解决了传统组织工程的诸多不足，因此其所构建的工程化心肌组织、器官更能满足实际需要。
目前，中空状血管化一体成型是心脏生物打印技术的最大挑战，也是最关键点，难度体现在现有水凝胶力学支撑效果差，易坍塌，不易成型及功能性血管网不易构建，一体化成型难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法，通过3D生物打印技术结合逆向建模技术有效解决了单纯水凝胶易坍塌的问题，故而解决了大尺寸、中空状血管化一体化打印困难的问题。
本发明的另一目的在于提供一种由上述基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，其细胞活性高。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
本发明提出一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法，其包括：
逆向建模构建心脏三维网格模型，并将心脏三维网格模型的数据导入双喷头打印机，双喷头打印机的喷头1装入牺牲材料用于打印支撑骨架，喷头2喷出生物墨水，得构建体。
将构建体交联，清洗，三维培养分化形成中空状血管化心脏。
生物墨水的有效成分包括：水凝胶、富血小板血浆、第三代人脐静脉内皮细胞以及SD大鼠原代心肌细胞。
本发明提出一种上述方法制得的中空状血管化心脏。
本发明实施例提供的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏的有益效果是：
通过三维生物打印技术、逆向建模技术以及生物墨水的互相配合，不仅解决了水凝胶力学支撑效果差，易坍塌，不易成形及功能性血管网不易构建，大尺寸、中空状血管化一体化打印困难的问题。基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏细胞存活率在打印后8小时平均大于95％，在第7和14天的细胞存活率分别平均大于为88％、80％。为解决器官移植供体严重不足问题提供了新的方法和思路，同时可用于药物筛查和毒性检测方面。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明提供的心脏重建示意图；
图2为本发明提供的心脏打印的结构示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏进行具体说明。
本发明提供一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法，该方法操作便捷，有效提高构建中空状血管化心脏的成功率，同时解决水凝胶力学支撑效果差，易坍塌，不易成型及功能性血管网不易构建的问题。
具体地，该方法包括：
a.逆向建模构建心脏三维网格模型，并将心脏三维网格模型的数据导入双喷头打印机。其中，双喷头打印机为生物双喷头打印机。
具体地，逆向建模前，将志愿者心脏薄层CT扫描数据以DICOM格式导入Mimics软件，例如Mimics10.0软件中进行三维重建，然后通过逆向建模技术重新设计，将其设计为可双喷头打印的心脏三维网格模型，生成STL格式数据，然后将其STL格式数据载入到3D生物打印机应用软件中进行处理，对心脏三维模型进行分层切片，获得多层切片的CAD数据模型。
请参阅图1，其中A为心脏的CAD模型，B为经逆向重建后的CAD模型剖面图，其中B中，浅色为PVA打印的内、外支撑骨架，深色填充部分为生物墨水，其中，C为内层与外层。
其中，薄层CT扫描过程中，例如以薄层厚度为1mm的形式进行扫描，使逆向建模得到的多层切片的CAD数据模型更为精准，其中逆向建模软件可以采用Geomagc和Catia软件等，在此不做具体限定。
b.请参阅图2，双喷头打印机的喷头1装入牺牲材料用于打印支撑骨架，喷头2喷出生物墨水，得构建体。
其中图2中，1为喷头1，用于打印内外支持骨架。2是指喷头2，用于喷出生物墨水，其中3是生物墨水的放大示意图，4为心脏。
优选地，牺牲材料为经预先灭菌处理的水溶性PVA，通过先添加后牺牲的方法实现中空状血管化心脏的中空结构。
喷头1的打印温度为160～170℃。具体地，生物墨水装入生物打印机的37℃恒温料盒中并与喷头2相连接，其中恒温料盒的底板温度＜20℃。其中，喷头1用于打印内外部的支撑骨架，喷头2将生物墨水打印在内部骨架的间隙处，优选地，打印于无菌环境中进行，防止杂菌污染。
更优选地，喷嘴1的直径分别是400μm-800μm，例如喷嘴1的直径是400μm、600μm、800μm等，更优选地，喷嘴1的直径是800μm，喷嘴2的直径为1000μm-2000μm，例如喷嘴2的直径为1000μm、1200μm、1400μm、1600μm或2000μm等，优化打印效果。
优选地，本发明较佳的实施例中，生物墨水的有效成分包括：水凝胶、富血小板血浆、第三代人脐静脉内皮细胞以及SD大鼠原代心肌细胞，其中水凝胶包括藻酸盐和琼脂糖，生物相容性好，降解产物安全无毒，不存在过敏反应或者毒性反应的潜在危险。富血小板血浆能释放多种生长因子，促进细胞增殖、生长、分化和组织的形成，提高生物墨水中目标细胞的成活率。第三代人脐静脉内皮细胞以及SD大鼠原代心肌细胞与水凝胶、富血小板血浆的相容性佳，可实现活性打印。
生物墨水的制备方法如下：将第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠原代心肌细胞与富血小板血浆混合后，接着与水凝胶混合，即得，由于富血小板血浆的流动性相比于水凝胶更佳，因此采用先与富血小板血浆混合，再与水凝胶混合的方式，可以使第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠原代心肌细胞均匀分散于该生物墨水内，不发生细胞团聚现象，提高生物墨水的质量。
优选地，本发明较佳的实施例提供的藻酸盐在生物墨水中的含量为2-3wt％，优选地，琼脂糖在生物墨水中的含量为0.8-1.3wt％，优选地，第三代人脐静脉内皮细胞在生物墨水中的密度为1×106个/ml，优选地，SD大鼠原代心肌细胞在生物墨水中的密度为1×106个/ml，优选地，富血小板血浆在生物墨水中的体积分数为10-25％。
生物墨水的溶剂为PBS溶液或去离子水，其中PBS可以有效平衡细胞渗透压、维持离子强度和pH，使细胞生长环境维持稳定。
更优选地，藻酸盐在生物墨水中的含量为2.5wt％，琼脂糖在生物墨水中的含量为1wt％，第三代人脐静脉内皮细胞在生物墨水中的密度为1×106个/ml，SD大鼠原代心肌细胞在生物墨水中的密度为1×106个/ml，富血小板血浆在生物墨水中的体积分数为20％，此比例条件下，细胞成活率更高，同时保证内部微网络流体通道的保真度也有利于心肌细胞搏动的力学环境。
上述生物墨水例如可以由以下方式制备：
制备水凝胶：由于水凝胶的使用需要提前配置，使用时按需添加即可。例如称取2.5g生物级的藻酸盐溶解于50mlPBS溶液中，室温下磁力搅拌至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜，得藻酸盐溶液；称取1g生物级低熔点琼脂糖粉末溶解于50mlPBS溶液中，加热至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜，得琼脂糖溶液；需要使用水凝胶时，将藻酸盐溶液、琼脂糖溶液混合，磁力搅拌，混合均匀，即得水凝胶。本发明中，琼脂糖均指低熔点琼脂糖。
其中，水凝胶中，藻酸盐的终浓度分别为2-4％(w/v)，例如藻酸盐的终浓度分别为2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)或4％(w/v)，琼脂糖的终浓度为1-4％(w/v)，例如琼脂糖的终浓度为1％(w/v)、1.5％(w/v)、2％(w/v)、2.5％(w/v)、3％(w/v)、3.5％(w/v)或4％(w/v)等。
接着，第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠原代心肌细胞与富血小板血浆混合后，制得生物墨水。
其中，富血小板血浆的制备为现采现用，促生长效果佳。例如根据实际需要取所需量，无菌收集外科手术中的废弃血，例如10～100ml等制备富血小板血浆。其中，富血小板血浆在生物墨水中的体积分数为10-25％，例如富血小板血浆在生物墨水中的体积分数为10％、15％、20％或25％等。
c.将构建体交联，清洗，三维培养形成中空状血管化心脏。
具体地，将制得的构建体与交联剂混合，进行交联5-15分钟后，例如进行交联5分钟、7分钟、10分钟或15分钟后使用PBS清洗，使残留于构建体表面的交联剂彻底清除。例如用PBS清洗三次，每次3-5分钟等。
本实施例中，优选交联剂为含有凝血酶和氯化钙的PBS溶液，具体地，氯化钙在交联剂中的浓度为8-12wt％，凝血酶在交联剂中的密度为9-11U/ml，交联效果优异。
同时，上述交联剂可以由以下方法制备，例如：
称取15g无水氯化钙溶解于150ml的PBS溶液中，高压灭菌，得氯化钙溶液，优选在4℃保存备用。
取2000U的凝血酶充分溶解于50ml含有10wt％的氯化钙的PBS溶液中，经0.22目过滤除菌后，得凝血酶溶液，优选在4℃保存，使用时将氯化钙溶液与凝血酶溶液混匀便是交联剂。
d.三维培养形成中空状血管化心脏。
具体地，将清洗后的构建体加入细胞培养基中培养，至牺牲材料完全溶解后每24h-48h更换一次培养液。为了加快牺牲材料的溶解速度及微管的快速通畅，因而在构建体加入细胞培养基中培养至牺牲材料完全溶解期间，优选每30分钟更换一次培养液，保证生物墨水中细胞的活性。至牺牲材料完全溶解后，构建体内便形成纵横交错的微流体通道及心脏的中空结构。细胞培养基可以为M199或/和DMEM/F12完全培养基，优选地，细胞培养基为含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12完全培养基。
优选地，本发明较佳的实施例中，牺牲材料为水溶性PVA，具有良好的生物相容性及可降解性，同时作为支撑材料便于去除，有效提高生产效率。
本发明还提供一种如上述基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏。
其中，支撑骨架包括内层、外层以及内部骨架，内部骨架分别与内层、外层连接，生物墨水填充于内部骨架与内层、外层的间隙处，其中，外层设置有多个微孔，优选地，每个微孔的孔径为0.07-0.1mm，例如0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm等，相邻的任意两个微孔之间的孔间距为2-5mm，例如2mm、3mm、4mm或5mm等，使生物墨水与交联剂充分反应，促进生物墨水成形效率，同时由于微孔的孔径较小，因此有效防止生物墨水流出。优选地，中空状血管化心脏位于内层部分也具有多个上述微孔。
牺牲材料完全溶解后，中空状血管化心脏具有内部PVA骨架溶解后留下的微管道，优选地，每个微管道的孔径为0.1mm，相邻的任意两个微管道之间的孔间距为4mm。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，其由以下方法制得：
(1)心脏建模：将志愿者心脏薄层CT扫描数据的DICOM格式导入Mimics10.0软件中进行三维重建，然后通过逆向建模技术重新设计，将其设计为可双喷头打印的三维网格模型，生成STL格式数据，然后将其导入生物打印控制软件中，设置好相关参数进行切片以形成G代码。
(2)水凝胶制备：称取2.5g生物级的藻酸盐溶解于50mlPBS溶液中，室温下磁力搅拌至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜；取1g生物级低熔点琼脂糖粉末溶解于50mlPBS溶液中，加热至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜。
(3)交联剂制备：称取15g无水氯化钙溶解于150ml的PBS溶液中，高压灭菌，4℃保存备用，然后取2000U的凝血酶充分溶解于50ml含10wt％的氯化钙的PBS溶液中，经0.22目滤器过滤除菌后4℃保存，用时将两者混匀便是交联剂。
(4)生物墨水制备：无菌收集外科手术中的废弃血100ml以制备富血小板血浆，将预先培养好的第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠(1-3天新生)原代心肌细胞分别以1×106个/ml和3×107个/ml的密度与步骤(2)中的富血小板血浆充分混匀后，接着与藻酸盐溶液、琼脂糖溶液混匀，最终制得的藻酸盐、琼脂糖的浓度分别为2.5％(w/v)、1％(w/v)，富血小板血浆添加量为20％(v/v)。
(5)心脏打印：将预先灭菌的水溶性PVA装入双喷头打印机喷头1内，PVA打印温度为160～170℃，生物墨水装入生物打印机37℃恒温料盒中并与喷头2相连接，底板温度＜20℃，喷头2打印生物墨水，其中喷头1打印内外部的支撑骨架，喷头2将生物墨水打印在内部骨架的间隙处，整个过程均在无菌环境中进行。
(6)将打印好的构建体与预先准备好的交联剂进行交联10分钟，接着用PBS清洗三次每次5分钟，然后加入含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12完全培养基于生物反应器内培养，每30分钟换培养液直到PVA完全溶解后改为每24h换一次。
本实施例提供的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，长宽高分别为：50mmx40mmx60mm,其内部微管道直径约1mm，细胞存活率在打印后8小时为98.2％，在第7和14天的细胞存活率分别为90.4％、84.6％；打印后第二天可见少数单个细胞搏动，频率30次/分，第7天可大量细胞搏动，频率40次/分。
实施例2
一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，其由以下方法制得：
(1)心脏建模：将志愿者心脏薄层CT扫描数据以DICOM格式导入Mimics10.0软件中进行三维重建，然后通过逆向建模技术重新设计，将其设计为可双喷头打印的三维网格模型，生成STL格式数据，然后将其导入生物打印控制软件中，设置好相关参数进行切片以形成G代码。
(2)水凝胶制备：称取2g生物级的藻酸盐溶解于50mlPBS溶液中，室温下磁力搅拌至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜；取2g生物级低熔点琼脂糖粉末溶解于50mlPBS溶液中，加热至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜。
(3)交联剂制备：称取15g无水氯化钙溶解于150ml的PBS溶液中，高压灭菌，4℃保存备用，然后取2000U的凝血酶充分溶解于50ml含10wt％的氯化钙的PBS溶液中，经0.22目滤器过滤除菌后4℃保存，用时将两者混匀便是交联剂。
(4)生物墨水制备：无菌收集外科手术中的废弃血100ml以制备富血小板血浆，将预先培养好的第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠(1-3天新生)原代心肌细胞分别以1×106个/ml和3×107个/ml的密度与富血小板血浆混合，再与步骤(2)中制得的藻酸盐溶液、琼脂糖溶液充分混匀，最终制得的生物墨水中藻酸盐、琼脂糖浓度分别为2％(w/v)、2％(w/v)，富血小板血浆添加量为20％(v/v)。
(5)心脏打印：将预先灭菌的PVA装入双喷头打印机喷头1内，PVA打印温度为160～170℃，生物墨水装入生物打印机37℃恒温料盒中并与喷头2相连接，底板温度＜20℃，喷头2打印生物墨水，其中喷头1打印内外部的支撑骨架，喷头2将生物墨水打印在内部骨架的间隙处，整个过程均在无菌环境中进行。
(6)将打印好的构建体与预先准备好的交联剂进行交联7分钟，接着用PBS清洗三次每次5分钟，然后加入含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12完全培养基于生物反应器内培养，每30分钟换培养液直到PVA完全溶解后改为每48h换一次。
本实施例提供的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，长宽高分别为：50mmx40mmx60mm,内部微管道直径约1mm，细胞存活率在打印后8小时为96.2％，在第7和14天的细胞存活率分别为89.4％、82.6％；打印后第二天可见少数单个细胞搏动，频率25次/分，第7天可见大量细胞搏动，频率35次/分。
实施例3
一种基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，其由以下方法制得：
(1)心脏建模：将志愿者心脏薄层CT扫描数据的DICOM格式导入Mimics10.0软件中进行三维重建，然后通过逆向建模技术重新设计，将其设计为可双喷头打印的三维网格模型，生成STL格式数据，然后将其导入生物打印控制软件中，设置好相关参数进行切片以形成G代码。
(2)水凝胶制备：称取3g生物级的藻酸盐溶解于50mlPBS溶液中，室温下磁力搅拌至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜；取3g生物级低熔点琼脂糖粉末琼脂糖溶解于50mlPBS溶液中，加热至完全溶解，高压灭菌后37℃培养箱过夜。
(3)交联剂制备：称取15g无水氯化钙溶解于150ml的PBS溶液中，高压灭菌，4℃保存备用，然后取2000U的凝血酶充分溶解于50ml含10％氯化钙的PBS溶液中，经0.22目滤器过滤除菌后4℃保存，用时将两者混匀便是交联剂。
(4)生物墨水制备：无菌收集外科手术中的废弃血100ml以制备富血小板血浆，将预先培养好的第三代人脐静脉内皮细胞、SD大鼠(1-3天新生)原代心肌细胞分别以1×106个/ml和3×107个/ml的密度与富血小板血浆混合，再与步骤(2)中制得的藻酸盐溶液和琼脂糖溶液充分混匀，最终制得的藻酸盐和琼脂糖浓度分别为3％(w/v)、3％(w/v)，富血小板血浆添加量为20％(v/v)。
(5)心脏打印：将预先灭菌的PVA装入双喷头打印机喷头1内，PVA打印温度为160～170℃，生物墨水装入生物打印机37℃恒温料盒中并与喷头2相连接，底板温度＜20℃，喷头2打印生物墨水，其中喷头1打印内外部的支撑骨架，喷头2将生物墨水打印在内部骨架的间隙处，整个过程均在无菌环境中进行。
(6)将打印好的构建体与预先准备好的交联剂进行交联10分钟，接着用PBS清洗三次每次5分钟，然后加入含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12完全培养基于生物反应器内培养，每30分钟换培养液直到PVA完全溶解后改为每48h换一次。
本实施例提供的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法制得的中空状血管化心脏，长宽高分别为：50mmx40mmx60mm，内部微管道直径约1mm，细胞存活率在打印后8小时为95.2％，在第7和14天的细胞存活率分别为88.4％、80.6％；打印后第二天可见少量单个细胞搏动，频率20次/分，第14天可见大量细胞搏动，频率35次/分
综上，本发明实施例的基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法及中空状血管化心脏，解决了大尺寸、中空状血管化一体化打印困难的问题，同时本发明将进一步推动了三维生物打印技术在心脏再生医学领域的应用前景，给等待心脏或其他组织器官移植的患者带来了巨大的希望，这为解决器官移植供体严重不足问题提供了新的方法和思路，同时还可用于药物筛查和毒性检测，具有优异的经济推广价值。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (11)

1.基于3D生物打印技术构建中空状血管化心脏的方法，其特征在于，包括：
逆向建模构建心脏三维网格模型，并将所述心脏三维网格模型的数据导入双喷头打印机，双喷头打印机的喷头1装入牺牲材料用于打印内外部的支撑骨架，喷头2将生物墨水打印在内部骨架的间隙处，得构建体；
将构建体交联，清洗，将清洗后的构建体加入细胞培养基中培养，至牺牲材料完全溶解后每24h-48h更换一次培养液，形成大尺寸中空状血管化心脏；
所述生物墨水的有效成分包括：水凝胶、富血小板血浆、第三代人脐静脉内皮细胞以及SD大鼠原代心肌细胞；所述生物墨水的制备方法如下：将所述第三代人脐静脉内皮细胞、所述SD大鼠原代心肌细胞与所述富血小板血浆混合后，接着与所述水凝胶混合，即得；所述水凝胶包括藻酸盐和琼脂糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述藻酸盐在所述生物墨水中的含量为2-3wt％，所述琼脂糖在所述生物墨水中的含量为0.8-1.3wt％，所述第三代人脐静脉内皮细胞在所述生物墨水中的密度为1×106个/ml，所述SD大鼠原代心肌细胞在所述生物墨水中的密度为1×106个/ml，所述富血小板血浆在所述生物墨水中的体积分数为10-25％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物墨水的溶剂为PBS溶液或去离子水。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述藻酸盐在所述生物墨水中的含量为2.5wt％，所述琼脂糖在所述生物墨水中的含量为1wt％，所述第三代人脐静脉内皮细胞在所述生物墨水中的密度为1×106个/ml，所述SD大鼠原代心肌细胞在所述生物墨水中的密度为1×106个/ml，所述富血小板血浆在所述生物墨水中的体积分数为20％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将所述构建体与交联剂进行交联5-15分钟后，使用PBS清洗。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述交联剂为含有凝血酶和氯化钙的PBS溶液，所述氯化钙在所述交联剂中的浓度为8-12wt％，所述凝血酶在所述交联剂中的密度为9-11U/ml。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞培养基为含15％胎牛血清、1％双抗的DMEM/F12完全培养基。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牺牲材料为水溶性PVA。
9.如权利要求1-8任意一项所述的方法制得的中空状血管化心脏。
10.根据权利要求9所述的中空状血管化心脏，其特征在于，所述支撑骨架包括内层、外层以及内部骨架，所述内部骨架分别与内层、外层连接，所述生物墨水填充于所述内部骨架的间隙处，所述外层设有多个微孔。
11.根据权利要求10所述的中空状血管化心脏，其特征在于，每个微孔的孔径为0.07-0.1mm，相邻的任意两个微孔之间的孔间距为2-5mm。
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