CN112566587A - 生物人工血管胰腺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于治疗受试者中糖尿病的组合物、系统和方法。本发明的组合物包括脱细胞血管移植物、具有可调刚性的生物相容性水凝胶套和多个细胞，例如胰岛细胞。

Description

生物人工血管胰腺

相关申请的交叉引用

本申请根据35 U.S.C.§119(e)要求于2018年6月21日提交的美国临时专利申请号62/688,141的优先权的权益，其内容通过引用以整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院(NIH)授予的HL127386的政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

胰岛细胞移植可以恢复对血糖水平的内分泌控制，和为患者提供改善的血糖控制，以避免I型糖尿病的令人衰弱的副作用。目前，唯一在临床上利用的胰岛疗法是埃德蒙顿方案，该方案涉及从供体胰腺中分离胰岛并将其注射入受体的门静脉中(Shapiro等人，NEJM 2006，355：1318-1330；Jin和Kim，Korean J of Int Med，32：62-66)。然后胰岛驻留在肝脏的血管结构中，在那里它们可以感测葡萄糖水平并相应地分泌胰岛素(Korsgren等人，Diabetologia 2008，51：227-32；Shapiro等人，Nat Rev Endocrinol 2017，13：268-277)。不幸的是，因为许多移植的胰岛由于没有得到足够的氧合和营养物而移植失败，因此不能保证胰岛移植成功(Bruni等，Diabetes，Metabolic Syndrome and Obesity：Targets andTherapy 2014，7：211-223；Narang等人，Pharm Res 2004，21：15-25；Pepper等人，WorldJournal of Transplantation 2013，3：48-53)。因此，对于单个受体，通常需要多个供体胰腺，这增加了用于移植的器官可用性的成本。

正在开发的其他胰岛递送疗法，例如胰岛微囊化以保护免受受体免疫反应，其同样遭受与皮下或腹膜内移植后胰岛缺氧和营养物转移不足相关的问题(Pepper等人，Clinical and Developmental Immunology 2013，2013：13；Barkai等人，World Journalof Transplantation 2016，6：69-90；Qi等人，Biomaterials 2010，31：4026-4031；Coronel和Stabler，Curr Opin Biotechnol 2013，24：900-8)。由于这些原因，尽管在该领域进行了三十到四十年的研究，但移植的胰岛的免疫分离尚未进展到临床实施。

发明内容

本发明提供了组合物，其包括脱细胞血管移植物、具有可调刚性的生物相容性水凝胶套(hydrogel encasement)和多个细胞。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物包括脱细胞动脉移植物。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物包括脱细胞静脉移植物。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物包括工程化的血管移植物。在一些实施方式中，水凝胶套包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原、弹性蛋白、明胶、脱乙酰壳多糖、

藻酸盐、层粘连蛋白、透明质酸素(hyaluronans)、丝、聚乙二醇、分离的细胞外基质水凝胶或其组合。在一些实施方式中，多个细胞是胰岛细胞。在一些实施方式中，多个细胞接种在水凝胶套内。在一些实施方式中，多个细胞接种在水凝胶套的表面上。在一些实施方式中，胰岛细胞是选自牛、猪、鼠科动物(murine)、家鼠(rattus)、马和人胰岛细胞的哺乳动物胰岛细胞。

本发明也提供了培养系统，其包括具有可调刚性的生物相容性基底，其中所述生物相容性基底包括脱细胞血管移植物；和水凝胶套。在一些实施方式中，水凝胶套包括多个细胞。在一些实施方式中，多个细胞包括胰岛细胞。在一些实施方式中，多个胰岛细胞是选自牛、猪、鼠科动物、家鼠、马和人胰岛细胞的哺乳动物细胞。在一些实施方式中，水凝胶套包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶或其组合。

本发明也提供了治疗患者中糖尿病的方法，包括在生物相容性水凝胶中包裹非细胞的血管移植物，其中用细胞接种生物相容性水凝胶，并将血管移植物植入受试者。在一些实施方式中，血管移植物包括动脉血管移植物。在一些实施方式中，血管移植物包括静脉血管移植物。在一些实施方式中，生物相容性水凝胶包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶或其组合。在一些实施方式中，细胞包括胰岛细胞。在一些实施方式中，受试者是人类受试者。

附图说明

当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述，其中贯穿若干视图的类似附图标记表示相应的部分。为了说明本发明的目的，在附图中示出了示例性的实施方式。然而，应当理解，本发明不限于附图所示实施方式的精确布置和手段。

图1A-1E描绘了本发明的示例性生物人工血管胰腺(BVP)的示意图。BVP的概念涉及构造可以直接与患者血流整合的胰岛移植平台。对于BVP，将脱细胞血管移植物(图1A)用作初始支架。然后以胰岛使用水凝胶涂布移植物(图1B、1D)。将BVP植入患者后，完全氧合的动脉血可能流过构建体(图1C)。这允许从血流将氧气和葡萄糖扩散出至胰岛，并且将从胰岛分泌的胰岛素扩散进入血流。图1E描绘了BVP的二维横截面。图1F描绘了示例性BVP的光学显微镜图像。图1G描绘了示例性BVP的横截面的苏木精和伊红(H&E)染色。

图2A和图2B描绘了大鼠胰岛的图像。图2A图示了新鲜分离的大鼠胰岛，和图2B图示了使用FDA/PI染色的胰岛，绿色指示活细胞，而红色指示死细胞。大部分胰岛都是绿色的和在分离过程中存活。

图3描绘了猪胰岛的图像。使用FDA/PI染色的分离的猪胰岛，绿色指示活细胞，而红色指示死细胞。大部分胰岛都是绿色的和在分离过程中存活。

图4A-4G图示了示例性的纤维蛋白涂布方法。使用成型方法产生BVP以用纤维蛋白/胰岛涂布脱细胞血管。图4A图示了插入脱细胞血管腔中的金属注射器。图4B描绘了转移到装有纤维蛋白和胰岛的1mL注射器中的血管。图4C描绘了允许在脱细胞血管周围固化的水凝胶，然后从塑料注射器中提取充分涂布的BVP。图4D描绘了一系列图(panel)，其展示了使用注射器制作BVP的成型方法，包括图示了从注射器移出的BVP的图。图4E描绘了示例性BVP的横截面的H&E染色。图4F描绘了BVP的双硫腙染色，其使胰岛变化(黑圈)。图4G描绘了活/死染色以显示在使用荧光素双乙酸酯(Sigma)和碘化丙啶(Invitrogen)的BVP制作方法之后的胰岛存活力。

图5描绘了MIN6葡萄糖刺激的胰岛素分泌测试的结果。将MIN6细胞与不同浓度的葡萄糖温育后20分钟，检测胰岛素水平。当暴露于较高水平的葡萄糖时，细胞表现出较高的胰岛素分泌，这与天然胰岛的行为相似。

图6图示了在纤维蛋白凝胶中MIN6存活研究的示例性结果。为了确定MIN6细胞是否可以在多种纤维蛋白组合物中长时间存活，执行了两种测定。图6中的A行图示了将活细胞染色成绿色，将死细胞染色成红色的荧光素双乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)。结果表明，大多数细胞是绿色和活的。图6中的B行图示了TUNEL染色，其将死胞核染色成绿色，而DAPI将胞核染色成蓝色。由于大多数胞核不是绿色的，因此大多数细胞在纤维蛋白凝胶中存活。

图7A和7B描绘了由在纤维蛋白中培养的胰岛的胰岛素释放实验的实验数据。图7A图示了示例性转移小室(transwell)设置中的纤维蛋白中的胰岛。图7B提供了胰岛素释放数据。在转移小室设置中的纤维蛋白内部培养胰岛。纤维蛋白中胰岛的图像(左)。采样胰岛/纤维蛋白转移小室周围的培养基，以便检测胰岛素的存在。随时间推移跟踪的胰岛素水平显示产生23.8pg/胰岛/分钟的斜率，这显示胰岛的每个胰岛每分钟释放23pg胰岛素，其接近公认的每个胰岛每分钟20pg的文献值。

图8图示了示例性BVP生物反应器设计。描绘了最初用于体外评估BVP概念性能的生物反应器设置。生物反应器设计为模拟植入BVP的体内环境。一旦植入BVP后，腔储器含有高的氧气和葡萄糖水平并表现腔的血液流动。运行泵以使培养基从腔储器流过BVP，然后流回腔储器。胞间隙储器中含有低的氧气和葡萄糖水平，以便模拟BVP一经植入后其周围的组织状况。

图9A-9C提供了MIN6 BVP生物反应器研究的实验结果。如本文所述，将涂布有纤维蛋白和MIN6细胞的脱细胞血管在图8所示的生物反应器内部培养3天。在此期间之后，将血管取出，用固定剂保存并安装在载玻片上进行分析。图9A描绘了H&E染色，其显示深蓝色的胞核以识别细胞，并且显示粉红色的蛋白质以识别蛋白质。最里面的圆圈是脱细胞血管的圆形横截面，而外部的深色虚线层是含有MIN6细胞的纤维蛋白涂层。图9B描绘了MIN6+纤维蛋白外层的特写图像。图9C描绘了横截面的DAPI/TUNEL染色。TUNEL将死胞核染色为绿色，而DAPI将所有胞核染色为蓝色。从图像中可以看到脱细胞血管周围的MIN6细胞的外环，并且大多数细胞是活的。此生物反应器设置证实BVP设置能够支持细胞存活。

图10A和10B图示了示例性体内BVP。通过使用纤维蛋白在脱细胞人脐动脉周围涂布猪胰岛来产生BVP构建体。然后将这些构建体作为动脉插入移植物(interpositiongraft)植入裸大鼠中。图10A描绘了虚线圆圈内植入后即刻的BVP。图10B描绘了在虚线圆圈内突出显示的在大鼠内2周后的BVP。如箭头所示，观察到BVP上的微血管向内生长。移植物在整个实验中均保持开放(patent)。

图11A和11B图示了在体内2周后外植的BVP的示例性H&E染色。使用H&E对外植的BVP构建体进行染色。图11A图示了血管保持开放，但腔中确实有一些血栓。图11B描绘了放大的图片，其显示了在体内2周后的纤维蛋白涂层内部胰岛存活。

图12描绘了示例性的免疫荧光成像，其用于评估在主动脉移植位置从大鼠中外植BVP后的细胞存活。通过以下染色描绘免疫荧光图像：将胞核显示为蓝色(暗区)的DAPI染色，将死细胞显示为绿色(未描绘)的TUNEL染色，和将胰岛显示为红色(以箭头突出显示)的胰岛素染色。红色簇是箭头所指示的胰岛素分泌胰岛。在胰岛中没有绿色存在，这表明它们在植入宿主的持续整整2周的实验中存活。

图13图示了用于微脉管系统生长的免疫荧光成像。通过以下染色描绘免疫荧光图像：将胞核显示为蓝色的DAPI染色，将内皮细胞显示为绿色的CD31染色，和将胰岛显示为红色的胰岛素染色。可以发现胰岛嵌入纤维蛋白中，其中附近的内皮细胞生长以形成微血管，如箭头突出显示的。

图14描绘了本发明的示例性方法。

图15A描绘了在COMSOL

软件中执行有限元分析的结果。所示的建模模拟了在BVP构建体中的氧气扩散。为模拟的胰岛、无细胞的移植物和水凝胶涂层分配扩散系数值。氧气源自腔和胞间隙，并且必须扩散通过无细胞的移植物和水凝胶涂层以到达消耗氧气的胰岛。

图15B描绘了有限元分析的结果，其显示了允许胰岛存活的大于0.071mmHg的氧气和允许胰岛素完全不受抑制的分泌的大于2.13mmHg的氧气的胰岛面积百分比。

图16A描绘了用于静态胰岛素产生实验的示例性设置。将BVP放入葡萄糖(+)培养基或葡萄糖(-)培养基二者之一的皿中。当暴露于葡萄糖(+)培养基中的高葡萄糖水平时，胰岛会分泌胰岛素，而当暴露于葡萄糖(-)培养基中的低葡萄糖水平时则会停止胰岛素产生。图16B描述了胰岛素ELISA结果，表明BVP能够通过分泌胰岛素来响应葡萄糖。

图17A描绘了用链脲佐菌素处理以诱发糖尿病的大鼠的血糖水平。结果证实以65mg/kg的浓度使用药物链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病并引起长时间的高血糖症的作用。图17B图示了免疫荧光染色，其显示了链脲佐菌素注射后胰岛破坏。上图描绘了胰岛素，由箭头突出显示，而下图显示了被处理大鼠的示例性胰岛染色不具有胰岛素染色。

图18A描绘了对糖尿病大鼠执行三种类型的移植，并随时间监测血糖水平。在BVP移植大鼠中，使用1200个大鼠胰岛、无细胞的人脐动脉和纤维蛋白涂层制作BVP。然后将BVP缝合到受体大鼠的腹主动脉中作为端对端移植物。对于无流量对照(no-flow control)，没有将BVP缝合作为端对端移植物，而是将其放置在腹主动脉附近，并用将BVP连接到周围组织的2条缝线保持在适当位置。对于假对照(sham control)，仅用纤维蛋白和无细胞的人脐动脉制作BVP，然后将BVP缝合到受体大鼠的腹主动脉中作为端对端移植物。没有胰岛用于此对照。图18B描绘了血糖测量的结果。所有移植均在第7天执行。结果表明，与BVP无流量对照和假对照相比，移植的BVP在整个90天的过程内能够帮助降低大鼠血糖。

图19A描绘了对禁食过夜的大鼠进行的葡萄糖耐量测试。这些大鼠是正常裸大鼠、糖尿病裸大鼠或已接受BVP植入的糖尿病裸大鼠。在时间0，向大鼠腹膜内注射2g葡萄糖/kg的葡萄糖推注。然后以指定的时间间隔使用尾部缺口(tail nick)对血液进行采样，以生成葡萄糖耐量测试图。图19B描绘了使用曲线下面积分析的结果，以提供不同组之间的比较。小的曲线下面积表明大鼠能够快速恢复其血糖水平，而较大的曲线下面积表明大鼠的血糖在较长时间内保持较高。BVP植入物组的曲线下面积低于糖尿病组，但仍高于没有糖尿病的对照大鼠。

图20A图示了使用1200个人类胰岛构造并移植到糖尿病大鼠中的BVP。在移植人胰岛后，在大鼠血浆中检测到人胰岛素，如图20B所示。图20C描绘了BVP葡萄糖耐量测试的结果，这证实在时间0处将葡萄糖注射入大鼠后人胰岛素水平增加。

具体实施方式

定义

除非另有限定，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在实践中可以使用与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料来测试本发明，但是本文描述了优选材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。

还应理解，本文使用的术语仅出于描述具体实施方式的目的，而无意于是限制性的。

在本文中冠词“一个”和“一种”用于指代该冠词的语法对象中的一个或超过一个(即，至少一个)。举例来说，“一个元件”是指一个元件或超过一个元件。

当涉及诸如量、时间持续时间等等的可测量值时，本文所使用的“约”意指涵盖距规定值的±20％或±10％，更优选地±5％，甚至更优选地±1％，并且仍更优选地±0.1％的变化，因为这样的变化适合于执行所公开的方法。

如说明书和权利要求书中所用的，术语“包括(comprises、comprising)”、“含有”、“具有”等可以具有美国专利法赋予它们的含义，并且可以表示“包含(include、including)”等等。

如本文所用，“缓解”疾病、缺陷、紊乱或状况是指降低疾病、缺陷、紊乱或状况的一种或多种症状的严重性。

如本文所用，“自体的”是指源自随后将材料重新引入同一个体的生物材料。

如本文所用，“同种异体的”是指源自与将材料引入其中的个体相同物种的遗传上不同的个体的生物材料。

如本文所用，“生物相容的”是指当植入哺乳动物中时不会在哺乳动物中引起显著不良反应的任何材料。当将生物相容性材料引入个体时，其对该个体无毒或无害，也不会在哺乳动物中诱导材料的免疫排斥。

如本文所用，当关于聚合物使用时，术语“生物相容性聚合物”和“生物相容性”在本领域中是公认的。例如，生物相容性聚合物包括通常既不对宿主有毒，也不以在宿主中以毒性浓度产生单体或低聚亚基或其他副产物的速率降解(如果聚合物降解)的聚合物。在一个实施方式中，生物降解通常涉及宿主中聚合物的降解，例如降解成其单体亚基，其可能已知是有效无毒的。然而，由这种降解产生的中间低聚产物可能具有不同的毒理学性质，或生物降解可能涉及生成除聚合物的单体亚基以外的分子的氧化或其他生化反应。因此，在一个实施方式中，可以在一种或多种毒性分析之后确定旨在体内使用(例如植入或注射入患者体内)的生物可降解聚合物的毒理学。不必将任何主题组合物具有100％纯度视为生物相容的；实际上，仅需要主题组合物是如上所述的生物相容的。因此，主题组合物可包括包含99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％、75％或甚至更少的生物相容性聚合物的聚合物(例如包括聚合物和其他材料)以及本文所述的赋形剂，并且仍然是生物相容的。

如本文所用，术语“脱细胞的”或“脱细胞”是指如此生物结构，从该生物结构(例如，器官或器官的一部分，或组织)中去除了细胞内含物，留下了完整的无细胞的基础结构。一些器官由多种特化组织组成。器官或实质(parenchyma)的特化组织结构提供与器官相关的具体功能。器官的支撑纤维网络是基质。大多数器官具有由支撑特化组织的非特化的连接组织组成的基质框架。脱细胞方法去除了特化的组织细胞，留下了细胞外基质的复杂三维网络。结缔组织的基础结构主要由胶原组成。脱细胞的结构提供了生物相容性基底，可以在其上灌输不同的细胞群。脱细胞的生物结构可以是刚性的或半刚性的，具有改变其形状的能力。

本文使用的术语“源自(衍生自)”是指来源于指定的来源。

如本文所用，“细胞外基质组合物”包括可溶和不可溶级分或其任何部分。不可溶级分包括那些沉积在支撑物或支架上的分泌的细胞外基质(ECM)蛋白和生物组分。可溶级分是指已经在其中培养细胞的培养基和细胞分泌的活性剂(一种或多种)，并且包括那些未沉积在支架上的蛋白质和生物学组分。两种级分都可以被收集，并且任选地被进一步处理，并且可以单独地或组合地用于本文所述的多种应用中。

如本文所用，术语“凝胶”是指三维聚合结构，其本身不溶于特定液体，但能够吸收和保留大量液体，以形成稳定的——通常柔软且易曲，但始终以一种程度或另一种程度保持形状——结构。当液体是水时，该凝胶被称为水凝胶。除非另有明确说明，否则术语“凝胶”将贯穿本申请使用以指吸收了水以外的液体的聚合物结构，和指吸收了水的聚合物结构二者，根据上下文，聚合物结构仅仅是“凝胶”还是“水凝胶”对于本领域技术人员而言是显而易见的。

如本文所用，“移植物”是指植入个体通常替代、纠正或以其他方式克服细胞、组织或器官缺陷的组合物。移植物可包括支架。在某些实施方式中，移植物包括脱细胞组织。在一些实施方式中，移植物可以包括细胞、组织或器官。移植物可以由源自同一个体的细胞或组织组成；在本文中通过以下可互换的术语指代移植物：“自体移植物”、“自体移植”、“自体植入物”和“自身移植物”。本文通过以下可互换的术语指代包括来自相同物种的遗传上不同个体的细胞或组织的移植物：“同种异体移植物”、“同种异体的植入物”和“同种异体的移植物”。从个体到其同卵双胞胎的移植物在本文中称为“同种移植物”、“同系移植”、“同系植入物”或“同种同基因移植物”。“异种移植物”、“异种移植”或“异种植入物”是指从一个个体到不同物种的另一个个体的移植物。

如本文所用，术语“胰岛”是指胰腺的胰岛，其是在受试者的一个或多个胰岛中发现的多种内分泌细胞类型的簇。胰岛可以由一个或多个细胞的簇组成，其包括一个或多个α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞，并且在某些情况下，还包括周围组织的一些部分，其包括结缔组织和细胞外基质组分。

如本文所用，“胰岛细胞”是指胰岛中包含的细胞，包括α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞。如本文所用的分离和纯化的胰岛是指根据本文所述方法分离和制备的胰岛。

如本文所用，术语“聚合”或“交联”是指至少一种反应，其消耗单体分子(或单体)、低聚物分子(或低聚物)或聚合物分子(或聚合物)的至少一种官能团的，以在至少两个不同的分子之间产生至少一个化学键(例如，分子间键)、在同一分子内产生至少一个化学键(例如，分子内键)或其任何组合。聚合或交联反应可消耗系统中可用的至少一种官能团的约0％至约100％。在一个实施方式中，至少一种官能团的聚合或交联导致至少一种官能团约100％的消耗。在另一个实施方式中，至少一种官能团的聚合或交联导致至少一种官能团的少于约100％的消耗。

如本文所用，“支架”是指包括生物相容性材料的结构，其提供了适合物质粘附和细胞增殖的表面。支架可以进一步提供机械稳定性和支撑。支架可以呈具体的形状或形式，以影响或界定三维形状或形式，例如由增殖细胞群所呈现的形状或形式。此类形状或形式包括但不限于薄膜(例如，二维大幅度大于第三维的形式)、带、绳、片、平盘、圆柱体、球体、三维无定形形状等。

如本文所用，“治疗”是指减少患者经历疾病、缺陷、紊乱或不良状况等症状的频率。

如本文所用，术语“组织”包括但不限于骨骼、神经组织、纤维结缔组织(包括肌腱和韧带)、软骨、硬脑膜、心包、肌肉、肺、心脏瓣膜、静脉和动脉以及其他脉管系统、真皮、脂肪组织或腺体组织。

如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，受试者优选是哺乳动物，例如非灵长目动物(例如牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)和灵长目动物(例如猴子和人)，最优选是人。

如本文所用，术语“治疗疾病或紊乱”是指减少患者经历疾病或紊乱的症状的频率。疾病和紊乱在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以或有效预防或治疗(延缓或预防发作、预防进展、抑制、减小或逆转)本文所描述或考虑的疾病或状况的量，包括减轻此类疾病或状况的症状。

本文提供的范围应理解为该范围内所有值的缩写。例如，范围1到50应该理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50(及其分数，除非上下文另有明确规定)的任何数字、数字的组合或子范围。

描述

本发明涉及用于递送胰岛细胞的组合物，制备该组合物的系统和方法以及使用该组合物的方法。具体地，本发明涉及用于开发生物人工血管胰腺(BVP)组合物的系统、生物材料、组织工程化构建体等。本发明基于在脱细胞血管移植物上接种细胞显著改善胰岛细胞功能和存活的发现。在某些实施方式中，BVP组合物提供脱细胞血管移植物或其他无细胞或非细胞类型的动脉/血管移植物，以及生物相容性水凝胶组合物。在某些实施方式中，用细胞接种生物相容性水凝胶组合物。在某些实施方式中，在不使用水凝胶载体的情况下，将细胞或胰岛附着在无细胞或非细胞血管移植物的外部。在某些实施方式中，胰岛或细胞附着在细胞动脉、静脉或细胞血管移植导管的外部。在某些实施方式中，本发明提供了用于培养胰岛细胞的系统。在某些实施方式中，本发明提供了治疗受试者的胰腺疾病(例如，I型或II型糖尿病)的方法。

BVP组合物

现在参照图1A-1G，本发明的BVP 100包括一种或多种脱细胞血管移植物120(图1A)。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物120是脱细胞动脉血管移植物，其中动脉移植物是从动脉血管分离的，该动脉血管例如是脐动脉、主动脉、腹主动脉、胸主动脉、乳腺动脉、肱动脉、桡动脉、胃网膜动脉、腹壁下动脉、脾动脉、肩胛下动脉、肠系膜下动脉、旋股外侧动脉降支、尺动脉、肋间动脉以及如本领域技术人员理解的任何其他合适的动脉组织。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物120是脱细胞静脉血管移植物，其中静脉移植物是从静脉血管分离的，该静脉血管例如是隐静脉、脐静脉或如本领域技术人员理解的任何其他合适的静脉组织。在一些实施方式中，血管移植物是自体移植物。在一些实施方式中，血管移植物是异种移植物。在一些实施方式中，血管移植物是同种异体移植物。在一些实施方式中，脱细胞血管移植物是脱细胞工程化血管移植物。在一些实施方式中，工程化血管移植物是工程化动静脉移植物。可以使用本领域中理解的任何技术来构造工程化移植物，包括但不限于：脱细胞、细胞自组装、电纺丝、相分离等。在一些实施方式中，血管移植物含有活的细胞。

使用如本领域理解的标准技术将本文所述的一种或多种血管移植物脱细胞。在一个实施方式中，本发明的脱细胞组织基本上由组织的所有或大部分区域的细胞外基质(ECM)组分组成。ECM组分可以包括以下任何一项或全部：纤连蛋白、肌原纤蛋白、层粘连蛋白、弹性蛋白、胶原家族的成员(例如、胶原I、III和IV)、糖胺聚糖、基质(groundsubstance)、网状纤维和血小板反应素，其可以保持组织为限定的结构，例如基底层。成功的脱细胞被限定为使用标准组织学染色程序在组织学切片中不存在可检测的内皮细胞、平滑肌细胞、上皮细胞和胞核。优选但非必须地，也已从脱细胞组织中去除残留的细胞碎片。

在一些实施方式中，天然组织的脱细胞方法保留了组织的天然三维结构。即，在脱细胞方法期间和之后，包括ECM组分的组织的形态和构架得以维持。ECM的形态和构架可以通过视觉和/或组织学检查。例如，由于脱细胞，实体器官的外表面上或器官或组织的脉管系统内的基底层可能不会被去除或显著损伤。另外，ECM的原纤维可与尚未脱细胞器官或组织的原纤维相似或显著地未变化。在一些实施方式中，天然组织的机械性质基本上不受脱细胞方法的影响。

在一些实施方式中，脱细胞移植物是合成移植物。例如，合成移植物可以包括

移植物、聚四氟乙烯移植物、聚氨酯移植物等中的一种或多种。

在一些实施方式中，以水凝胶涂层130包裹一个或多个脱细胞血管移植物120(图1B和1D)。在一些实施方式中，水凝胶涂层130由一种或多种生物相容性生物分子构造。在一些实施方式中，水凝胶涂层130包括可调刚性。在一些实施方式中，水凝胶涂层130是促血管生成的。

在一些实施方式中，水凝胶涂层130是由一个或多个生物相容性生物分子，例如纤维蛋白、纤维蛋白原和凝血酶构造的构建体。在一些实施方式中，水凝胶涂层是由如本领域理解的适合形成水凝胶的任何合适的生物分子或生物分子的组合构造的构建体，例如，胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、明胶、层粘连蛋白、透明质酸素、脱乙酰壳多糖、藻酸盐、葡聚糖、果胶、角叉菜聚糖、丝、

聚赖氨酸、明胶、琼脂糖、交联的聚乙二醇、交联的合成聚合水凝胶、细胞外基质(例如用于形成水凝胶的分离的细胞外基质、纯化的细胞外基质和/或脱细胞的细胞外基质等等)和/或其组合。(参见Hennink和C.F.van Nostrum，2002，Adv.Drug Del.Rev.54，13-36和Hoffman，2002，Adv.Drug Del.Rev.43，3-12)。这些材料由线性或支链的多糖或多肽制成的高分子量主链组成。基于合成聚合物的水凝胶的实例包括但不限于(甲基)丙烯酸酯-低聚丙交酯(oligolactide)-PEO-低聚丙交酯-(甲基)丙烯酸酯、聚乙二醇(PEO)、聚丙二醇(PPO)、PEO-PPO-PEO共聚物(普兰尼克)、聚(磷腈)、聚(甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、PL(G)A-PEO-PL(G)A共聚物、聚(乙烯亚胺)等(参见A.SHoffman，2002，Adv.Drug Del.Rev，43，3-12)。在一些实施方式中，使用消化的脱细胞胰腺组织产生水凝胶。在一些实施方式中，水凝胶是通过将消化的脱细胞胰腺组织与一种或多种其他水凝胶(例如纤维蛋白水凝胶)组合制作的。在一些实施方式中，水凝胶涂层130是由纤维状支架而非水凝胶构造的构建体。例如，纤维状支架可以包括聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸、聚二

烷酮、己内酯等和/或其组合的一种或多种。在一些实施方式中，如本文所述，水凝胶涂层130是由水凝胶和非水凝胶支架材料的组合的构造的构建体。

在一些实施方式中，本发明的水凝胶涂层130在是机械上稳定的。在一些实施方式中，本发明的水凝胶涂层包括可调机械性质，例如可调刚性。在一些实施方式中，水凝胶涂层的机械性质是通过改变用于形成水凝胶涂层的一种或多种生物分子的浓度而可调的。例如，在一些实施方式中，水凝胶是使用不同浓度的纤维蛋白原和/或凝血酶形成的纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，使用不同比例的纤维蛋白原与凝血酶形成纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，纤维蛋白原与凝血酶的比例为10：1。在一些实施方式中，纤维蛋白原与凝血酶的比例为约2：1、约3：1、约4：1、约5：1、约6：1、约7：1、约8：1、约9：1、约10：1、约11：1、约12：1、约13：1、约14：1、约15：1、约16：1、约17：1、约18：1、约19：1或约20：1。在一些实施方式中，使用约1mg/mL、约2mg/mL、约3mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约9mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL或约20mg/mL的纤维蛋白原浓度形成纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，使用约5mg/mL的纤维蛋白原浓度以与凝血酶5：1的比例形成纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，使用约10mg/mL的纤维蛋白原浓度以与凝血酶5：1的比例形成纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，使用约10mg/mL的纤维蛋白原浓度以与凝血酶10：1的比例形成纤维蛋白水凝胶涂层。

在一些实施方式中，水凝胶涂层130是促血管生成的。在一些实施方式中，水凝胶涂层由支持血管生成的生物相容性生物分子构造。如本文所用的术语“血管生成”被限定为由先前存在的血管形成新的血管。在一些实施方式中，本发明的水凝胶涂层由支持新血管向内生长的一种或多种生物分子(例如纤维蛋白)构造。在一些实施方式中，水凝胶涂层由支持血管成熟和/或稳定性的一种或多种生物分子构造。在一些实施方式中，水凝胶涂层包括一种或多种血管生成因子，例如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(angiopoeitins)(Ang-1、Ang-2)、转化生长因子(TGF-β)等。在一些实施方式中，一种或多种因子被直接合并或并入到水凝胶中。在一些实施方式中，一种或多种因子通过直接方式(例如直接注射或直接接触)递送到水凝胶。在一些实施方式中，使用如本领域理解的递送方法将一种或多种因子递送至水凝胶，例如在微粒、纳米颗粒等中的缀合或封装。

在一些实施方式中，如图1B和1D所示，本发明的水凝胶涂层130接种有多个细胞140。在一些实施方式中，细胞140包括胰岛细胞。在一些实施方式中，细胞140包括α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞和/或ε细胞。在一些实施方式中，细胞140是完整的胰岛，例如分离的完整的胰岛。在一些实施方式中，分离的完整胰岛是从哺乳动物来源分离的，包括例如牛、猪、鼠科动物和/或人胰岛。在一些实施方式中，细胞是转化细胞，例如永生化细胞，例如胰岛瘤细胞、转基因细胞、敲除细胞、敲入细胞或以其他方式遗传修饰的细胞。在一些实施方式中，对细胞进行修饰以产生和/或分泌升高水平的胰岛素、胰岛素原、C肽等。在一些实施方式中，这些细胞是干细胞，其包括胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(IPSC)等。在一些实施方式中，这些细胞是从ESC或IPSC分化的祖细胞。在一些实施方式中，水凝胶涂层130接种有能够分泌有用化合物的其他细胞类型。在一些实施方式中，这些细胞是外分泌细胞。在一些实施方式中，这些细胞是内分泌细胞。在一些实施方式中，这些内分泌细胞是滤泡细胞、神经内分泌细胞或甲状旁腺细胞。在一些实施方式中，接种的细胞是同种异体移植物细胞。在一些实施方式中，接种的细胞是自体移植物细胞。在一些实施方式中，接种的细胞是异种移植物细胞。

在一些实施方式中，水凝胶涂层130接种有多个分离的细胞。在一些实施方式中，水凝胶涂层接种有多个完整的胰岛。在一些实施方式中，水凝胶涂层接种有约25,000个细胞、约50,000个细胞、约75,000个细胞、约100,000个细胞、约500,000个细胞、约1,000,000个细胞、约10,000,000个细胞、约100,000,000个细胞、约500,000,000个细胞、约1,000,000,000或约10,000,000,000个细胞。在一些实施方式中，水凝胶涂层接种有约50个胰岛至约100个胰岛、约100个胰岛至约500个胰岛、约500个胰岛至约1,000个胰岛、约1,000个胰岛至约5,000个胰岛、约5,000个胰岛至约10,000个胰岛、约10,000个胰岛至约50,000个胰岛、约50,000个胰岛至约100,000个胰岛、约100,000个胰岛至约500,000个胰岛、约500,000个胰岛至约1,000,000个胰岛或约1,000,000个胰岛至约5,000,000个胰岛。

培养系统

在某些方面，本发明提供了一种用于培养分离的胰岛细胞的系统。可在分离后使用本领域已知的多种方法培养胰岛，包括悬浮培养、在聚苯乙烯皿中或在其上培养、在转移小室(transwell insert)中培养、在中空纤维流动设备中培养等。在一些情况下，胰岛可以存在于水凝胶中时进行培养。在一些实施方式中，培养系统包括一种或多种如本文所述的BVP组合物100，其连接至一个或多个灌注系统，例如图8所示的生物反应器系统800。在一些实施方式中，反应器系统800包括一个或多个元件，其包括一个或多个胞间隙储器810、一个或多个泵820以及一个或多个腔储器830，其中一个或多个元件与一个或多个长度的管道840流体连接。

一个或多个胞间隙储器810可以是如本领域中理解的任何合适的储器容器，其用于容纳具有合适条件的本发明的一个或多个BVP。在一些实施方式中，储器容器包括用于将一个或多个BVP的腔流体连接至灌注液的一个或多个端口。在一些实施方式中，一个或多个端口的内部部件流体连接到储器810的内部上的一个或多个BVP的每一端。在一些实施方式中，并且一个或多个端口的外部部件流体连接到储器810外部的一个或多个长度的管道840。一个或多个端口可以包括本领域中已知的任何合适的连接器或配件，例如，滑动配件、倒钩配件、螺纹配件、其他基于摩擦的配件等。在一些实施方式中，使用诸如缝合等技术将一个或多个BVP固定或紧固到一个或多个端口。在一些实施方式中，端口可以由包括玻璃和/或塑料在内的任何合适的可灭菌生物相容性材料构造。在一些实施方式中，端口由与储器810相同的材料形成。例如，在一些实施方式中，端口从作为储器的样品材料单元中挤出。在一些实施方式中，端口是附接到储器810的分离的材料单元。胞间隙储器810可以由如本领域中理解的包括玻璃和/或塑料在内的任何合适的可灭菌生物相容性材料构造。在一些实施方式中，胞间隙储器810包括一个或多个感测探针，例如氧感测探针、氨感测探针等。在一些实施方式中，胞间隙储器810包括一个或多个采样端口，其用于从储器内部收集流体或将一种或多种另外的因子(例如蛋白质或葡萄糖)注射入储器中。在一些实施方式中，胞间隙储器810包括用于调节储器810内部的氧气水平的一个或多个部件。例如，在一些实施方式中，胞间隙储器包括用于喷雾储器810的一个或多个导管。在一些实施方式中，胞间隙储器包括用于使储器810脱气的一个或多个导管。胞间隙可以含有流动或灌注的流体或培养基。胞间隙可以含有用于测量压力、氧气、葡萄糖水平、氨水平等的一个或多个传感器。

如本领域中所理解的，一个或多个泵820可以是用于产生流体流的任何合适的泵。例如，如本领域中所理解的，一个或多个泵820可以是一个或多个蠕动泵。在一些实施方式中，如本领域技术人员所理解的，泵820可以是一个或多个合适的正电压排出泵、脉冲泵、速度泵、重力泵、蒸汽泵或无阀泵。

如本领域中所理解的，一个或多个腔储器830可以是任何合适的储器容器，用于适当地容纳具有优选的氧气和葡萄糖浓度的灌注液。腔储器830可以具有一个或多个端口、孔或连接，包括例如端口、孔或连接用于向和/或从灌注液供应空气、氧气、葡萄糖、蛋白质等、用于使腔储器830减压和和/或通风，和/或用于接收一个或多个长度的管道840。腔储器830可以由如本领域中已知的任何合适的可灭菌生物相容性材料构造。

如本文所述的一个或多个长度的管道840可以是如本领域中所理解的任何合适的生物相容性的可灭菌管道。例如，如本领域中所理解的，管道840可以是硅氧烷管道、

管道、

管道、聚醚醚酮或任何其他合适的生物相容性可灭菌的热塑性弹性体管道。在一些实施方式中，管道具有约0.03mm、0.06mm、0.12mm、0.19mm、0.25mm或0.31mm的内径。如本文所述的生物反应器系统800可以用于模拟植入的BVP组合物的环境条件。例如，在一些实施方式中，一个或多个腔储器830含有灌注液832，其中灌注液832包括配制有高氧气和葡萄糖水平的培养基。在一些实施方式中，培养基是如本领域中理解的任何合适的细胞培养基础培养基，例如罗斯威尔公园纪念研究所培养基(Roswell ParkMemorial Institute media)(RPMI)、杜氏改良伊格尔培养基(DMEM)、培养基199(M199)等。在一些实施方式中，灌注液832包括与灌注植入的BVP组合物100的血液条件类似的葡萄糖和氧气条件。例如，在一些实施方式中，灌注液832含有约450mg/dL的葡萄糖。在一些实施方式中，灌注液832含有约100mg/dL、约200mg/dL、约300mg/dL、约350mg/dL、约400mg/dL、约450mg/dL、约500mg/dL、约550mg/dL或约600mg/dL的葡萄糖。在一些实施方式中，灌注液832含有约100mmHg的氧气。在一些实施方式中，灌注液832含有约40mmHg、约60mmHg、约80mmHg、约90mmHg、约100mmHg、约110mmHg、约130mmHg、约150mmHg、约170mmHg或约190mmHg的氧气。

在一些实施方式中，胞间隙储器810含有具有低氧气和葡萄糖水平的培养基812。在一些实施方式中，培养基812包括与其中植入BVP组合物100的组织微环境中的条件类似的条件。例如，在一些实施方式中，培养基812含有约20mg/dL的葡萄糖。在一些实施方式中，培养基812含有至少10mg/dL的葡萄糖，例如，在一些实施方式中，培养基812含有约12mg/dL、约15mg/dL、约20mg/dL、约22mg/dL、约25mg/dL、约30mg/dL、约35mg/dL、约40mg/dL、约45mg/dL、约50mg/dL、约55mg/dL、约60mg/dL、约65mg/dL、约70mg/dL、约75mg/dL、约80mg/dL、约85mg/dL、约90mg/dL、约95mg/dL或约100mg/dL的葡萄糖。在一些实施方式中，灌注液812含有约40mmHg的氧气。在一些实施方式中，灌注液832含有约10mmHg、约20mmHg、约30mmHg、约40mmHg、约50mmHg、约60mmHg、约80mmHg、约100mmHg、约120mmHg、或约140mmHg的氧气。

在一些实施方式中，一个或多个BVP 100定位在胞间隙储器810的内部空间内。BVP100的外表面与培养基812直接流体接触。BVP 100流体连接到管道840，使得BVP 100的腔被灌注液832流体密封。在一些实施方式中，灌注液832经过腔并且直接接触BVP 100的内部腔。

在一些实施方式中，泵840递送灌注液832通过生物反应器800。在一些实施方式中，将灌注液832从腔储器830泵送通过BVP 100的腔，然后将灌注液832返回腔储器830。在一些实施方式中，储器810的一个或多个端口将管道840流体密封至BVP 100的腔。进入的灌注液832经过BVP 100的腔，从培养基812分离，并通过管道840离开。在一些实施方式中，灌注液832穿过BVP 100的脱细胞移植物朝向水凝胶涂层130内的多个细胞140扩散。在一些实施方式中，灌注液832以与胰腺循环中的流速类似的流速被泵送通过管道840。在一些实施方式中，灌注液832以与肝循环中的流速类似的流速被泵送。在一些实施方式中，灌注液832以与动静脉瘘中的流速类似的流速被泵送。在一些实施方式中，植入液832以约1mL/min、约2mL/min、约3mL/min、约10mL/min、约50mL/min、约100mL/min或约200mL/min的速率被灌注。在一些实施方式中，就在灌注本发明的BVP之后，立即将嵌入在水凝胶套中的多个细胞暴露于灌注液832的氧气和葡萄糖内容物。在一些实施方式中，在系统内流动开始后约5分钟内，将多个细胞暴露于灌注液的氧气和葡萄糖内容物。在一些实施方式中，在系统内流动开始后约10分钟或约30分钟内，将多个细胞暴露于灌注液的氧气和葡萄糖内容物。灌注液可以是如本领域已知和理解的任何合适的流体，包括缓冲溶液、盐水溶液、葡萄糖溶液、培养基、血液、血浆、血清等。

方法

本发明的多种实施方式提供了治疗受试者中的胰腺疾病例如糖尿病的方法，该糖尿病包括但不限于I型糖尿病。现在参考图14，显示了在需要其的受试者中治疗胰腺疾病的示例性方法900。在一些实施方式中，如本文所述的，疾病是糖尿病，其包括I型糖尿病、II型糖尿病等。本发明的多种实施方式提供了将胰岛素递送至需要其的受试者的方法。本发明的多种实施方式提供了用于将大量细胞(例如胰岛的胰岛细胞)递送至需要其的受试者的方法。

在一些实施方式中，方法900开始于步骤S901。在多种实施方式中，步骤S901包括获得脱细胞、非细胞和/或无细胞的血管移植物。在多种实施方式中，步骤S901包括使血管移植物脱细胞。在一些实施方式中，血管移植物是动脉移植物。在一些实施方式中，如本文所述，动脉移植物从一个或多个动脉血管中分离，例如脐动脉、主动脉、腹主动脉、胸主动脉、乳腺动脉、肱动脉、桡动脉、胃网膜动脉、腹壁下动脉、脾动脉、肩胛下动脉、肠系膜下动脉、旋股外侧动脉降支、尺动脉、肋间动脉以及如本领域技术人员理解的任何其他合适的动脉组织。在一些实施方式中，血管移植物是静脉移植物。在一些实施方式中，如本文所述，静脉移植物从一个或多个静脉血管分离，例如，隐静脉、脐静脉或本领域技术人员所理解的任何其他合适的静脉组织。在一些实施方式中，血管移植物是工程化的血管移植物，例如本文所述的工程化的非细胞或无细胞血管移植物。

在步骤S902的多种实施方式中，将脱细胞血管移植物120包裹在生物相容性水凝胶中。可选地，在一些实施方式中，没有将血管移植物包裹在水凝胶中，而是通过诸如共价键、封装在微粒内或封装或截留在细胞外基质颗粒、线股或薄片——其系在血管移植物的组成部分上或为血管移植物的组成部分——中的方式，将细胞附着在移植物的外表面上。在一些实施方式中，可将脱细胞血管移植物120稳定在支撑结构上，以便于促进其包裹在水凝胶中。支撑结构可以包括尺寸适于安装在移植物的腔内的圆柱形结构。例如，支撑结构的直径可上至约0.01mm、约0.01mm至约0.05mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至约0.15mm、约0.15mm至约0.2mm、约0.2mm至约0.5mm、约0.5mm至约1mm、约1mm至约5mm、约5mm至约10mm等。支撑结构的非限制性实例可以包括例如注射器、针、刚性和/或半刚性管道或其他合适的结构。支撑结构可以由任何合适的生物相容性材料构造，所述生物相容性材料包括例如，不锈钢、

聚氯乙烯、聚碳酸酯等。

在一些实施方式中，生物相容性水凝胶由一种或多种生物相容性生物分子，例如纤维蛋白、纤维蛋白原和凝血酶构造。如本文所述，水凝胶可以由如本领域所理解的适合形成水凝胶的任何合适的生物分子或生物分子的组合构造，例如，胶原、纤维蛋白、弹性蛋白、透明质酸、明胶、层粘连蛋白、藻酸盐、其他细胞外基质蛋白或成分等。在一些实施方式中，生物相容性水凝胶是机械上稳定的。在一些实施方式中，水凝胶具有可调刚性。

通过改变用于形成水凝胶涂层的一种或多种生物分子的浓度水凝胶刚性可以是可调的。例如，在一些实施方式中，水凝胶是使用不同浓度的纤维蛋白原和/或凝血酶形成的纤维蛋白水凝胶。如本文所述，可以使用不同比例的纤维蛋白原与凝血酶形成纤维蛋白水凝胶涂层。在一些实施方式中，水凝胶由一种或多种生物分子构造，所述生物分子例如，支持和/或促进新血管的向内生长的纤维蛋白。水凝胶涂层可以由支持血管成熟和/或稳定性的一种或多种生物分子构造。

如本文所述，水凝胶可包括一种或多种血管生成因子，例如，血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管生成素(angiopoeitins)(Ang-1、Ang-2)、转化生长因子(TGF-β)等。在一些实施方式中，如本文其他地方所述，用多个细胞接种生物相容性水凝胶。例如，在一些实施方式中，用胰岛细胞接种水凝胶。

在本发明的一些实施方式中，可以将细胞注射入血管移植物的壁中，作为将细胞或胰岛捕获在其中的手段。在某些应用中，细胞或胰岛可能被截留在与血管移植物外部结合的细胞外基质材料的颗粒、微粒或薄片内。可选地，可以将细胞或胰岛封装在适合于植入的、附着在血管移植物外部的合成材料的微粒或薄片中。

脱细胞血管移植物120可以放置在合适的容器中，例如，含有一种或多种生物分子(例如，纤维蛋白等)和/或一个或多个细胞和/或胰岛的溶液的注射器中。脱细胞血管移植物120可以在生物分子和/或细胞和/或胰岛的溶液中温育足以形成水凝胶的时间段。例如，脱细胞移植物120可以温育长达5分钟、5分钟至30分钟、30分钟至60分钟、1小时至3小时、3小时至6小时、6小时至12小时、12小时至24小时等等。

在步骤S903的多种实施方式中，将BVP 100植入需要其的受试者中。在一些实施方式中，如本领域技术人员所理解的，BVP 100可以直接与受试者的血流互相连通。在一些实施方式中，BVP 100连接到胰腺循环的一个或多个血管。在一些实施方式中，BVP连接到肝循环的一个或多个血管。在一些实施方式中，BVP连接作为在动脉和静脉之间的动静脉瘘。在一些实施方式中，动静脉瘘位于四肢上，例如位于手臂或上肢或前肢上。在一些实施方式中，瘘管位于腿或下肢或后肢上。在一些实施方式中，如本领域技术人员所理解的，将BVP植入受试者内的任何合适位置，例如动脉旁路移植物、静脉旁路移植物、动脉插入移植物、静脉插入移植物、皮下植入物、肠系膜植入物、门静脉植入物或其他植入位置。在一些实施方式中，受试者是哺乳动物，例如人。

在一些实施方式中，当使用本发明的组合物、系统和/或方法治疗受试者时，改善了疾病或紊乱，例如I型糖尿病。在一些实施方式中，当使用本发明的组合物、系统和/或方法治疗受试者时，缓解了疾病或紊乱的症状。在一些实施方式中，当使用本发明的组合物、系统和/或方法治疗受试者时，向受试者提供一种或多种生物分子，例如胰岛素。

实验实施例

参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅出于说明的目的，并且除非另有说明，否则它们不意图是限制性的。因此，本发明决不应解释为限于以下实施例，而是应解释为涵盖由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

无需进一步描述，相信本领域的普通技术人员可以使用前面的描述和下面的说明性实施例来制造和利用本发明并实践所要求保护的方法。因此，以下工作实施例具体指出了本发明的优选实施方式，并且不应解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。

实施例1：治疗I型糖尿病的生物人工血管胰腺的设计

作为解决胰岛移植中一些问题的创新且具有潜在影响的方法，研究了在脱细胞血管外部递送胰岛。在将胰岛接种到脱细胞血管的外表面后，将组织作为血管移植物植入，其中动脉血流穿过脱细胞血管的腔，并且将胰岛嵌入在血管的外表面。在动脉移植物植入的情况下，完全氧合的血液将直接流过脱细胞血管，并使氧气和营养物扩散到接种在外血管表面的胰岛。然后，胰岛能够对血糖水平作出反应并将胰岛素分泌到宿主循环中。图1A-1G显示了生物人工血管胰腺(BVP)技术的直观表示。本发明和技术的首要目标是帮助患者对抗1型糖尿病。

胰岛分离

为了测试BVP，首先以稳健和可重复的方式收获胰岛。在大鼠和猪二者中均进行了胰岛收获，以用于BVP测试试验。

大鼠胰岛分离：用于大鼠胰岛分离的方案基于Carter等人的方案，并进行了数个改进以提高产量(Carter等人，Biological Procedures Online 2009；11：3-31)。对2-4个月大、体重200-300g的雌性Sprague Dawley大鼠上进行胰腺的大鼠胰岛收获。为了处死动物，以175mg/mL和0.1mg/100g大鼠腹腔(intraperitonially)内注射Euthasol。将补充有HEPES缓冲溶液以及青霉素/链霉素抗生素(P/S)的Hank’s平衡盐溶液(HBSS)用作缓冲/洗涤溶液。在切开并打开腹腔后，定位胆总管，并使用25量规的针头以在HBSS中的10mL的1.5mg/mL的胶原酶P对其插管。然后切除胰腺。将提取的胰腺放入含有另外10mL胶原酶P的玻璃小瓶中。然后将玻璃小瓶置于水浴中并连续搅动10-14分钟，以使胶原酶消化胰腺。一旦没有大的组织块留下，使用Hanks平衡盐溶液(HBSS)缓冲液将溶液洗涤3次。对于每次洗涤，使细胞沉降4分钟，并吸出上清液。在洗涤3次后，再使用1000μm筛孔作为过滤器执行两次另外的洗涤，以去除较大的组织颗粒。最后，对于最后一次洗涤，将细胞放入70μm细胞过滤器中，并用HBSS洗涤。这允许外分泌簇和细胞被过滤通过，同时将胰岛保留在筛孔上。然后使用罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI)培养基将筛孔冲洗到未经处理的培养皿上。将10滴双硫腙(0.025g双硫腙；5mL DMSO；20mL PBS)添加到培养皿中以将胰岛染色成粉红色。然后挑选胰岛，并在RPMI(RPMI，10％胎牛血清，1％P/S)中培养准备使用。图2B显示了大鼠胰岛和用荧光素双乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)染色的大鼠胰岛，其将活细胞染色成绿色和将死细胞染色成红色。

猪分离：还分离了猪胰岛。在器官提取后，通过猪胰腺的总胆管注射100mL的1.5mg/mL的胶原酶P。然后将胰腺放入玻璃瓶中并消化20分钟。在最后一分钟期间，搅动瓶子持续整分钟。然后使用与用于描述大鼠胰腺相同的方法洗涤和分离胰岛。图3显示了使用FDA/PI染色的猪胰岛。这些数据表明，从几种物种中收获能活的(viable)胰岛是可行的，并且可以扩展此类技术至从人胰腺中分离胰岛。对于BVP的临床实施，预期将人胰岛而不是动物衍生的胰岛移植到受体中。可以使用本领域已知的多种方法中的任一种从人胰腺中分离人胰岛。如下所述，本文描述的动物衍生的胰岛用于临床前原理验证研究的目的。

使血管脱细胞

从大鼠和人组织中分离天然动脉，然后进行脱细胞。可用于BVP发明的其他潜在的脱细胞动脉移植物包括脱细胞成人静脉或动脉，以及脱细胞的工程化的动脉/血管。为了进行原理验证研究的目的，使用了人脐动脉和天然的大鼠主动脉，因为它们的直径(约1 mm)适合于植入大鼠的腹主动脉。

Gui等人的方案被用于使人脐动脉和大鼠胸主动脉脱细胞(Gui等，Tissue EngPart A2009；15：2665-76)。为了分离人脐动脉，获得了人脐带。用镊子切开脐带以分离动脉。通过打开处死的大鼠的胸壁并切断主动脉来分离大鼠胸动脉。通过将分离的血管在CHAPS洗涤剂溶液(8 mM CHAPS；1 M NaCl；25 mM EDTA)中温育过夜开始脱细胞过程。然后洗涤血管，并在SDS洗涤剂溶液(1.8 mM SDS；1 M NaCl；25 mM EDTA)中于37℃下温育过夜。然后用PBS执行15次洗涤，以从血管中清除任何CHAPS或SDS。然后将脱细胞血管在4℃的具有1％青霉素/链霉素抗生素溶液的无菌磷酸盐缓冲盐水中保存长至一年。

纤维蛋白涂层

在准备了脱细胞动脉后，开发了水凝胶涂层，该涂层适合将胰岛附接到脱细胞移植物的外表面。在选择合适的水凝胶时，重要的是它是生物相容的、机械稳定的并且优选为血管生成的。尽管许多水凝胶中的任何一种都可能适合于生产BVP的目的，但在这些概念验证研究中，还是利用了纤维蛋白。选择这种水凝胶是因为其高的生物相容性、对血管生成的出色支持以及其对水凝胶的硬度进行调节的能力——这取决于用于制作凝胶的纤维蛋白原和凝血酶的相对比例。通过调节纤维蛋白凝胶的硬度，可以改变围绕无细胞动脉外部的含胰岛涂层的机械性能，这可以优化凝胶稳定性，以承受外科植入的物理严苛条件。

纤维蛋白水凝胶使用纤维蛋白原和凝血酶的混合物制作。凝血酶的作用是使纤维蛋白原分子裂开并形成纤维蛋白的交联网络。为了优化纤维蛋白涂层，使用了以与凝血酶多种比例的不同浓度的纤维蛋白原对纤维蛋白组合物进行测试。使用成型技术，将5 mg/mL的纤维蛋白原——与凝血酶以5：1的比例；10 mg/mL的纤维蛋白原——与凝血酶以5：1的比例；和10 mg/mL的纤维蛋白原——与凝血酶以10：1的比例，涂布在脱细胞人脐动脉上。简而言之，将脱细胞动脉穿过10 cm的14量规的金属注射器。然后，对1 mL塑料注射器涂布5％的疏水性普兰尼克(pluronic)，以预防纤维蛋白粘附在注射器的内腔上。将纤维蛋白装载入1mL注射器中，并将具有脐动脉的金属注射器置于注射器内。使纤维蛋白在血管周围聚合。还添加1.5 mM Ca²⁺以增加纤维蛋白聚合。在37℃下温育30分钟后，从塑料注射器中抽出金属注射器并且该操作得到了以纤维蛋白涂布的脱细胞血管。此方法如图4A-4D所示。在图4D的第四幅图中显示了以纤维蛋白涂布并从金属注射器支撑结构释放的示例性的脱细胞血管。定性地，10 mg/mL的纤维蛋白原——与凝血酶以10：1的比例，得到最好的涂层。

MIN6细胞培养

如本文所述，开发了从大鼠和猪组织中分离纯化的胰岛的技术。正是这些胰岛将嵌入无细胞动脉周围的纤维蛋白涂层中以制作BVP。然而，胰岛操作麻烦并且分离和保持可能是昂贵的。因此，为了加快最初的概念验证研究，使用了永生化细胞系，该细胞系以高效产生胰岛素。

小鼠胰岛瘤(MIN6)细胞用作BVP系统初始测试的模型细胞类型。进行了葡萄糖刺激的胰岛素分泌(GSIS)实验，以证实MIN6细胞可以响应于葡萄糖而产生胰岛素，其水平与天然胰岛相似。为了进行该实验，在24孔板中培养了50,000个MIN6细胞，并使细胞沉降过夜。除去培养基，并用PBS洗涤孔。将具有低葡萄糖(20mg/dL葡萄糖)的基础培养基与细胞一起温育2小时。然后将不同浓度的葡萄糖和优化的DMEM应用于细胞，并温育20分钟。使用Mercodia公司的胰岛素(酶联免疫吸附测定)ELISA测定法检测胰岛素。20分钟后的胰岛素水平如图5中所示，并显示出成功的GSIS反应，其中使用高葡萄糖优化的DMEM(450mg/dL葡萄糖)观察到特别高的胰岛素分泌。

还测试了MIN6细胞在纤维蛋白凝胶中的存活。将50,000个MIN6细胞接种到300μL的不同的纤维蛋白原浓度和纤维蛋白原与凝血酶比例的纤维蛋白凝胶中。将装载细胞的纤维蛋白构建体在500μl优化的DMEM培养基中保存3天。使用可将活细胞染色成绿色并将死细胞染色成红色的荧光素双乙酸酯/碘化丙啶(FDA/PI)证实存活。图6中的A行表明，大多数细胞都是绿色的，并且存活，而与纤维蛋白组合物无关。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色被用作存活的第二验证。TUNEL将死胞核染色成绿色和DAPI用来将细胞核染色成蓝色。图6中B行显示大多数胞核不是绿色的，因此细胞在凝胶内存活。

纤维蛋白中的胰岛功能性

在确立MIN6细胞可以在纤维蛋白中存活后，胰岛然后也显示在纤维蛋白中也可以存活并发挥功能。使用转移小室设置评估纤维蛋白中的胰岛培养。转移小室设置用培养基向围绕胰岛接种的纤维蛋白凝胶提供了理想条件。将三十只大鼠胰岛封装在10mg/mL纤维蛋白中，并在转移小室内培养2天。这些胰岛的光学显微镜照片在图7A中示出。在培养的这两天期间，使用胰岛素ELISA确定胰岛素水平，以便检测胰岛素从胰岛中的释放。可以在图7B中找到这种胰岛素释放，并且斜率表明胰岛以23pg/胰岛/分钟释放胰岛素，这接近文献中发现的20pg/胰岛/分钟的值(Buchwald，Theoretical Biology and Medical Modelling2011；8：20)。这表明胰岛能够在纤维蛋白凝胶内部成功地发挥作用，这支持了使用纤维蛋白涂层来制作BVP构建体。

有限元分析

为了确定最佳的BVP制备条件以允许最大的胰岛存活，使用COMSOL

跨平台有限元分析模拟软件进行有限元分析。图15A所示的建模模拟了BVP构建体中的氧气扩散。为模拟的胰岛、无细胞的移植物和水凝胶涂层分配扩散系数值。氧气源自腔和胞间隙并且必须扩散通过无细胞的移植物和水凝胶涂层以到达消耗氧气的胰岛。该模拟用于评估胰岛存活百分比和在最大胰岛素分泌下的胰岛面积百分比，其具有每个横截面不同数量的胰岛、不同的胰岛直径和不同的水凝胶涂层厚度。图15B中显示的模拟结果呈现：允许胰岛存活的高于0.071mmHg氧气的氧气水平的胰岛存活百分比；和允许胰岛素完全不受抑制分泌的高于2.13mmHg氧气的氧气在最大胰岛素分泌下的胰岛面积。改变诸如每个横截面的胰岛数量、胰岛直径和水凝胶涂层厚度的参数，以确定它们对胰岛存活和功能性的影响。

生物反应器设置

为了证明BVP发明是维持封装在外表面上的水凝胶中的细胞存活的合适环境，在生物反应器中使用BVP设置执行初始测试。设计并构造了生物反应器，以复制植入的BVP会经历的体内环境。植入的BVP会经历腔的高葡萄糖和氧气水平和周围胞间隙的较低氧气和葡萄糖水平。为了在体外复制该情况，将生物反应器分成两个储器。腔储器包含具有450mg/dL葡萄糖的优化的DMEM和附连的空气过滤器。在BVP外部，有间隙储器，其包含具有<20mg/dL葡萄糖的无葡萄糖DMEM并且无空气过滤器。可以将BVP构建体缝合到生物反应器中，然后可以将腔储器的培养基泵送通过BVP的腔。生物反应器设计如图8中所示。

初步研究使用了MIN6细胞，如前所述，使用10mg/mL纤维蛋白在脱细胞脐动脉周围涂布该MIN6细胞。将MIN6 BVP在37℃的生物反应器内部培养3天。生物反应器培养3天后的结果如图9A-9C所示。苏木精和伊红(H&E)染色用于识别细胞。苏木精将DNA和胞核染色成深蓝色，以便识别细胞，而伊红将蛋白质染色成粉红色。细胞仍然被涂布在脱细胞血管表面的周围，而TUNEL染色证实细胞存活。这些数据表明，BVP向接种在脱细胞血管外表面上的细胞提供了足够的氧气和营养物。

静态胰岛素生产

为了评估BVP内胰岛的胰岛素产生，根据图16A所示实验参数，将BVP放入含有葡萄糖(葡萄糖(+))培养基或无葡萄糖(葡萄糖(-))培养基的皿中。简而言之，将BVP放入含有葡萄糖(+)培养基的皿中，然后每15分钟将其转移到具有新鲜的培养基的新皿中，持续60分钟时段。然后将BVP转移到含有葡萄糖(-)培养基的皿中。每15分钟将BVP再次转移到含有新鲜的葡萄糖(-)培养基的新皿中，持续60分钟时段。然后将BVP转移回含有葡萄糖(+)培养基的皿中。每15分钟将BVP再次转移到含有新鲜的葡萄糖(+)培养基的新皿中，持续60分钟时段。在实验过程中，对从每个皿收集的培养基执行胰岛素的ELISA分析。当胰岛暴露于葡萄糖(+)培养基的高葡萄糖水平时，其分泌胰岛素。当胰岛暴露于葡萄糖(-)培养基的低葡萄糖水平时，其停止胰岛素产生。图16B所示的结果证实胰岛素ELISA结果表明BVP能够通过胰岛素分泌来响应葡萄糖。

体内植入

在BVP在体外的初始成功后，在体内测试了构建体。将免疫缺陷的Rowett Nude(RNU)大鼠用于体内研究。这些大鼠是在5个月大时从Charles River购买的。为了产生BVP构建体，将脱细胞人脐动脉接种在其外表面上，如前所述，在10mg/mL纤维蛋白内具有约200个猪胰岛。使用主动脉插入移植物方案将BVP构建体植入裸大鼠。在图10A中可以看到新鲜植入的BVP。

大鼠从手术中迅速恢复，并在24小时内完全活跃。在植入两周后，外植BVP构建体。体内2周后的BVP构建体如图10B所示。BVP构建体上生长了小的微血管，其表明植入物已促进血管生成进入纤维蛋白涂层。这种血管生成可以为涂布在BVP表面的胰岛提供进一步的营养物。这从根本上使BVP技术不同于其他胰岛技术——其他胰岛技术聚焦于通过使用半透膜将胰岛与其周围环境隔离。相反，BVP通过从血管移植物的腔中扩散而提供营养物，并且随后通过与血管移植物的外表面上的胰岛紧密接近的毛细血管的形成向胰岛提供另外的营养物。BVP移植物在整个实验中保持开放。

两周后，通过组织切片和免疫荧光染色分析外植体。外植体的H&E染色在图11中示出。胰岛可以在外植的BVP的H&E切片中看到。在图12中，DAPI/胰岛素的免疫荧光染色用于识别胰岛，而TUNEL用于确定胰岛是否存活。在图13中，DAPI/胰岛素的染色再次用于识别胰岛并且CD31的染色用于识别显示微血管生长存在的内皮细胞。染色结果证实，胰岛能够在体内植入中存活2周，这直接证明了胰岛接受了足够的营养物以维持该时间段的体内存活。使用CD31对内皮细胞染色显示有希望的微血管生长到围绕脱细胞血管的纤维蛋白构建体内，显示经由与植入的胰岛紧密接近的微血管的形成，改善了向植入的胰岛的营养物递送。

除了使用裸大鼠的体内实验外，还通过用链脲佐菌素处理裸大鼠以诱导糖尿病，从而生成了糖尿病大鼠模型。如图17A-17B所示的证实了该模型有效性的结果表明诱发了长时间的低血糖症并且有效地破坏了胰岛。

然后将糖尿病大鼠用于评估BVP植入物的体内功效，该BVP植入物是将接种到纤维蛋白水凝胶上的1200个大鼠胰岛涂布无细胞人脐动脉移植物而产生的。如图18A所示，使用了三种手术模型。在第一个模型中，植入BVP使得BVP腔连接到大鼠腹主动脉。使用1200个大鼠胰岛、无细胞人脐动脉和纤维蛋白涂层制作BVP。然后将BVP缝合到受体大鼠的腹主动脉中作为端对端移植物。在第二种模型中，无流量对照，将BVP植入在腹主动脉附近，但是BVP并未被缝合作为端对端移植物。而是将其放置在腹主动脉附近，并用将BVP连接到周围组织的2条缝线保持在适当的位置。此模型用于证实对于BVP行使功能是否必需流动通过BVP的腔。在第三种模型——手术假模型——中，仅用纤维蛋白和无细胞人脐动脉产生BVP，然后将BVP缝合到受体大鼠的腹主动脉中作为端对端移植物。没有胰岛用于此对照。所有移植均在第7天进行。如图18B所示的结果，与BVP无流量对照和假对照相比，移植的BVP能够在90天的过程内帮助降低大鼠血糖。

BVP受体中的葡萄糖耐量测试

对禁食过夜的大鼠执行葡萄糖耐量测试。这些大鼠是正常裸大鼠、糖尿病裸大鼠或已接受BVP植入的糖尿病裸大鼠。在时间0，给大鼠腹腔注射2g葡萄糖/kg大鼠的葡萄糖推注。然后以指定的时间间隔使用尾部缺口对血液进行采样，以产生葡萄糖耐量测试图，如图19A所示。为了提供不同组之间的比较，执行曲线下面积分析(如图19B所示)。小的曲线下面积表明大鼠能够快速恢复其血糖水平，而较大的曲线下面积表明大鼠的血糖在较长时间内保持较高。BVP植入物组的曲线下面积低于糖尿病组，但仍高于没有糖尿病的对照大鼠。

BVP异种移植物中的胰岛素生产

除了上面生成和验证的大鼠同种异体移植物BVP之外，异种移植物BVP也使用接种在涂布无细胞人脐动脉血管移植物的纤维蛋白水凝胶内的人胰岛生成的。使用1200个人胰岛构建异种移植物BVP，然后移植到糖尿病大鼠中，如图20A所示。然后在递增的时间点收集大鼠血浆并评估人胰岛素。图20B所示的结果表明，在移植人胰岛BVP后，在大鼠血浆中检测到人胰岛素。为了评估植入的BVP异种移植物的功效，对异种移植物受体执行了葡萄糖耐量测试。图20C中所示的葡萄糖耐量测试结果证实，在时间0处将葡萄糖注射入移植受体大鼠后，人胰岛素水平增加。

体外生物反应器和体内初步植入结果证实，产生异位胰腺的BVP方法有能力成为胰岛移植的可行设计。在当前结果的基础上，期望改进胰岛收获产量，以增加移植的胰岛的数量。这项新技术可以利用创新的移植机制，为移植的胰岛提供充足的营养物和氧气，而无需依赖于不良的血管化床(例如肝微循环或皮下空间)的扩散。在证实了BVP在动物模型中的有效性之后，将使用直径为6mm、长度为42cm的工程化的脱细胞动静脉移植物来制作BVP构建体。这些工程化的血管具有82cm²的较大表面积，可用于胰岛涂布，并允许血液以大约1-2升/分钟的速度流过腔(Lawson，JH等人Lancet 2016；387(10032)：2026-34)。BVP技术为I型糖尿病患者提供了独特的血管工程化解决方案。

尽管已经使用具体术语描述了本发明的优选实施方式，但是这种描述仅用于说明性目的，并且应当理解，可以在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下进行改变和变型。

本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容通过引用整体并入本文。尽管已经参考具体实施例公开了本发明，但是显然，本领域的其他普通人员可以设计出本发明的其他实施方式和变型而不脱离本发明的真实精神和范围。所附权利要求旨在被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。

Claims (22)

1.一种组合物，其包括：

脱细胞血管移植物；

具有可调刚性的生物相容性水凝胶套；和

多个细胞。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱细胞血管移植物包括脱细胞动脉移植物。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱细胞血管移植物包括脱细胞静脉移植物。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述脱细胞血管移植物包括工程化的血管移植物。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述水凝胶套包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶、胶原、弹性蛋白、明胶、脱乙酰壳多糖、

藻酸盐、层粘连蛋白、透明质酸素、丝、聚乙二醇、分离的细胞外基质水凝胶或其组合。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个细胞是胰岛细胞。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个细胞选自：α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞、胰岛瘤细胞、转基因细胞、敲除细胞、敲入细胞或以其他方式遗传修饰的细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(IPSC)和其组合。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个细胞接种在所述水凝胶套内。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多个细胞接种在所述水凝胶套的表面上。

10.根据权利要求6所述的组合物，其中所述胰岛细胞是选自牛、猪、鼠科动物、家鼠、马和人胰岛细胞的哺乳动物胰岛细胞。

11.一种培养系统，其包括：

具有可调刚性的生物相容性基底，其中所述生物相容性基底包括脱细胞血管移植物；和

水凝胶套。

12.根据权利要求11所述的培养系统，其中所述水凝胶套包括多个细胞。

13.根据权利要求12所述的培养系统，其中所述多个细胞包括胰岛细胞。

14.根据权利要求13所述的培养系统，其中所述多个胰岛细胞是选自牛、猪、鼠科动物、家鼠、马和人胰岛细胞的哺乳动物细胞。

15.根据权利要求11所述的培养系统，其中所述水凝胶套包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶或其组合。

16.一种治疗患者中糖尿病的方法，器包括：

在生物相容性水凝胶中包裹非细胞的血管移植物；其中用细胞接种所述生物相容性水凝胶；和

在受试者中植入所述血管移植物。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述血管移植物包括动脉血管移植物。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述血管移植物包括静脉血管移植物。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述生物相容性水凝胶包括纤维蛋白、纤维蛋白原、凝血酶或其组合。

20.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞包括胰岛细胞。

21.根据权利要求16所述的方法，其中所述细胞包括选自以下的一个或多个细胞类型：α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、ε细胞、胰岛瘤细胞、转基因细胞、敲除细胞、敲入细胞、以其他方式遗传修饰的细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(IPSC)和其组合。

22.根据权利要求16所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

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