CN116286914A - 一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用 - Google Patents
一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因选自能够表达分子量在6‑12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段。本发明采用大肠杆菌跨膜蛋白复合体将第3段目的基因类人胶原蛋白分泌表达到发酵液或大肠杆菌周质空间，离心和提取周质蛋白，再经纯化，所得发酵液或大肠杆菌周质空间的重组类人胶原蛋白的电泳纯度已经达到符合使用要求，内毒素含量低，生产周期短和快捷，生产成本低，便于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于类人胶原蛋白基因工程领域，尤其涉及一种跨膜蛋白复合体基因及其在生物发酵制备重组类人胶原蛋白中的应用。
背景技术
类人胶原蛋白(Human-like Collagen)是将人体胶原蛋白的其中一段基因通过大肠杆菌、酵母菌等基因工程方法克隆、表达、分离、复性、纯化工艺生产的一种重组蛋白。类人胶原蛋白与人胶原蛋白一样属于结缔组织的重要组成部分，对于维持细胞、组织和器官等的正常生理功能有着重要的作用。由于其具有良好的生物特性，类人胶原蛋白在食品、化妆品、生物学以及医学等方面也都有着广泛的应用。不同于动物材料来源的胶原蛋白，重组人胶原蛋白或类人胶原蛋白不存在动物疾病感染风险。目前市场上已经有许多重组胶原蛋白或类人胶原蛋白由于成分单一、安全性高和生产过程可控等优点已经应用于多个领域，并且也有许多研究报道和许多发明专利，因此属于成熟的技术和市场应用领域，只是该成熟技术在生产过程中往往采用常规的比较复杂的离子交换层析或各种介质填料层析分离等重组蛋白分离纯化手段，或者采用大肠杆菌包涵体纯化途径，为了去除杂蛋白和细菌内毒素，纯化或复性过程都比较复杂，而大肠杆菌的分泌表达往往难以达到批量生产的表达量水平，有的酵母分泌表达时候需要采用甲醇诱导，生产成本高于大肠杆菌。而大肠杆菌含内毒素，大肠杆菌胞内含4000多种蛋白，通过包涵体分离纯化十分麻烦，而分泌表达一般指分泌到周质空间或培养液中，周质空间仅有100余种大肠杆菌蛋白，分离纯化简单一些，如果能分泌到培养基中，则分离纯化更简单，尤其是分子量在6-12kDa这个分子量范围的大肠杆菌发酵液和周质空间中的大肠杆菌杂蛋白极少，更有利于目的蛋白的分离纯化。
发明内容
发明目的：大肠杆菌表达重组蛋白大都采用破菌后提取包涵体进行复杂的重组蛋白纯化过程，即使分泌表达大部分也只是分泌到周质空间，分泌表达到发酵液的重组蛋白量往往很少，难以达到规模化产业化生产需求。而重组人胶原蛋白或类人胶原蛋白一般分子量都较大，通常分子量都大于14kDa以上，使之比较容易用大肠杆菌大规模表达和纯化，而分子量比较小的是人胶原蛋白肽，用大肠杆菌表达技术反而有一定难度，表达量低和容易降解，所以通常采用化学合成方法进行，但化学合成胶原蛋白肽生产成本更高。针对这种大肠杆菌重组蛋白表达技术瓶颈和缺陷，针对介于分子量低于12kDa而分子量又大于化学合成的人胶原蛋白肽，针对这些特殊的6-12kDa的低分子量重组类人胶原蛋白大肠杆菌分泌表达和蛋白纯化技术瓶颈，本发明探索了一种不采用大肠杆菌菌体破碎包涵体纯化复性重组蛋白的一般基因工程方法，采用大肠杆菌跨膜蛋白复合体技术将类人胶原蛋白分泌到周质空间和发酵液中，周质空间蛋白与发酵液中蛋白分别纯化或合并纯化，只经过2-3次不同孔径的工业化陶瓷膜过滤纯化，经过不同浓度硫酸铵沉淀，去盐后就获得电泳纯度符合使用标准的二种分子量6-12kDa的重组类人胶原蛋白。
技术方案：
第一方面，本发明提供了一种跨膜蛋白复合体基因，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因为目的基因，选自能够表达分子量在6-12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，所述第三段基因位于第一段基因的指定酶切位点前和第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，第二段基因位于第一段基因的指定酶切位点后。
通过上述基因表达的跨膜蛋白复合体将类人胶原蛋白直接分泌到发酵液中，少量分泌到周质空间，菌体内存在的少量重组目的蛋白放弃不用，不破菌以减少大肠杆菌菌体内的内毒素含量的影响。
作为一种实施方案，所述能够表达分子量在6-12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，选自核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因片段。
具体的，所述跨膜蛋白复合体基因包含如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2二部分组成的跨膜蛋白复合体基因，从不同的人胶原蛋白基因中选择部分基因片段，合成类人胶原蛋白基因片段插入在SEQ ID NO.1的核酸内切酶BamHI前和SEQ ID NO.1的第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，然后在核酸内切酶BamHI后进一步插入含有如SEQ ID NO.2的另一个跨膜蛋白基因，这3个基因(SEQ ID NO.1-类胶原蛋白基因-SEQ ID NO.2)共同组成跨膜蛋白复合体通道，这3个跨膜蛋白复合体通道基因一并克隆入一般的pET表达载体，便于将其中表达的类人胶原蛋白分泌到大肠杆菌的周质空间和发酵液中，并且使大部分目的蛋白被分泌入发酵液中。
进一步的，类人胶原蛋白的基因片段选择不同的人胶原蛋白基因片段，表达的类人胶原蛋白分子量在6-12kDa之间。类人胶原蛋白的核苷酸序列可以选择为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6中的一种基因序列，只需要符合人胶原蛋白其中的一段片段，并且能在大肠杆菌中能表达，分子量在6-12kDa就可以选择用于克隆到含有上述二种跨膜蛋白基因序列的pET表达载体上进行分泌表达和进行简易目的蛋白分离纯化，不同的类人胶原蛋白片段之间表达量会有所不同或纯度有所差别，但是都可以使大部分目的蛋白分泌表达到发酵液中。
第二方面，本发明提供了一种类人胶原蛋白，所述类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
第三方面，本发明提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包括所述的跨膜蛋白复合体基因。
第四方面，本发明提供了一种重组大肠杆菌，所述大肠杆菌包含所述的跨膜蛋白复合体基因，或者表达所述的类人胶原蛋白。
第五方面，本发明提供了一种类人胶原蛋白的制备方法，包括利用所述的跨膜蛋白复合体基因、所述的重组表达载体、或所述的重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白。
进一步的，所述的类人胶原蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)将所述跨膜蛋白复合体基因连接到pET表达载体上，构建重组表达载体；
(2)将重组表达载体导入到基因克隆用的大肠杆菌感受态中，鉴定，获得含类人胶原蛋白基因克隆载体的甘油菌，甘油菌测序正确后提取表达质粒转导到大肠杆菌表达菌中，诱导表达；
(3)离心分离大肠杆菌菌体和发酵液，离心后的菌体提取周质蛋白，将发酵液和周质蛋白分别通过工业陶瓷膜过滤纯化，或者两者的混合物通过工业陶瓷膜过滤纯化，即得类人胶原蛋白。
更进一步的，步骤(3)中，所述通过工业陶瓷膜过滤纯化后，所得类人胶原蛋白还可以再进行不同浓度的硫酸铵沉淀处理；优选的，硫酸铵的浓度梯度设置为35％，40％，45％，50％和75％。
更进一步的，所述通过工业陶瓷膜过滤纯化，是经过2-3次不同孔径陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为2-50nm。
上述方法通过2-3种不同孔径的工业陶瓷膜过滤，梯度硫酸铵沉淀后脱盐就能达到电泳纯，符合使用要求，使这类重组蛋白的蛋白纯化过程十分简单快捷，便于工业化大批量生产，降低重组蛋白的生产成本。进一步的，上述发酵液和提取的周质蛋白可以混合一起，通过预先实验结果，选择合适的2-3种不同孔径的工业陶瓷膜过滤纯化，浓缩后的重组类人胶原蛋白经过35％，40％，45％，50％，75％不同浓度的硫酸铵沉淀，废弃低浓度硫酸铵的沉淀，上清液进一步加到终浓度75％硫酸铵后离心，沉淀物复溶后脱盐就成为电泳纯度符合使用要求的重组类人胶原蛋白。
更具体的：
上述含不同基因序列的目的蛋白的发酵液通过离心分离菌体后的发酵液冷藏保存，通过预先实验结果，选择合适的2-3种不同孔径的工业陶瓷膜过滤纯化，浓缩后的重组类人胶原蛋白经过35％，40％，45％，50％，75％不同浓度的硫酸铵沉淀，废弃低浓度硫酸铵的沉淀，上清液进一步加到75％硫酸铵后离心，沉淀物复溶后脱盐就成为电泳纯度符合使用要求的重组类人胶原蛋白，不再需要进一步通过离子交换、亲和层析或其它蛋白分离介质等常规蛋白纯化手段进行进一步的蛋白纯化过程，大大节省了重组蛋白的纯化过程和生产成本。
进一步的，离心后收集的菌体加入TBS缓冲液(Tris,30mM,pH8.0,蔗糖20％,EDTA钠盐2mM)洗涤菌体，6000rpm离心15分钟，弃上清液，进而用10倍体积的MgSO4水溶液重悬菌泥，4-8度磁力搅拌下放置30分钟，6000rpm离心15分钟，弃沉淀，上清液为不破坏大肠杆菌内膜情况下所提取的包含目的蛋白的周质蛋白。通过预先实验结果，选择合适的2-3种不同孔径的工业陶瓷膜过滤纯化，浓缩后的重组类人胶原蛋白经过35％，40％，45％，50％，75％不同浓度的硫酸铵沉淀，废弃低浓度硫酸铵的沉淀，上清液进一步加到终浓度75％硫酸铵后离心，沉淀物复溶后脱盐就成为电泳纯度符合使用要求的重组类人胶原蛋白。
第六方面，本发明提供了所述的跨膜蛋白复合体基因、所述的重组表达载体、或所述的重组大肠杆菌在制备类人胶原蛋白的应用。
有益效果：传统的大肠杆菌表达外源基因通过包涵体纯化目的蛋白技术方案，包涵体提取的重组蛋白往往需要破菌技术和破菌设备，包涵体纯化工艺比较复杂，破菌后内毒素污染产品需要很高的蛋白纯度，纯化的重组蛋白需要复性，所以重组蛋白生产成本较高，纯化和复性工艺要求高和纯化和复性的设备配套齐全才能进行这类重组蛋白的大规模纯化，否则产量或纯度无法达到工业化生产的需求。而目前的采用信号肽等技术进行分泌表达的重组蛋白大部分集中在周质空间和菌体内，分泌到发酵液的往往产量不高，直接用大肠杆菌发酵液进行工业化重组蛋白纯化的产品很少，得率也比较低。
本发明不同于传统的大肠杆菌表达技术，采用了大肠杆菌跨膜蛋白复合体将类人胶原蛋白分泌表达到发酵液或大肠杆菌周质空间，通过离心分离菌体和发酵液，菌体提取周质蛋白，周质蛋白或/和去掉菌体的发酵液直接采用工业化陶瓷膜分离。采用工业陶瓷膜的“错流过滤”，在压力驱动下周质蛋白和发酵液流经膜管，按照不同孔径的陶瓷膜，相对孔径大小的小分子组分透过膜，大分子组分被膜截留，实现了对流体中重组蛋白的常温或低温分离、浓缩和纯化。通常在3小时内就可以完成100升发酵罐发酵的发酵液和提取的周质蛋白进行初步的分离纯化，去除了大部分杂蛋白，再进一步采用梯度硫酸铵沉淀，过G25凝胶柱脱盐后，二种重组类人胶原蛋白的纯度就已经达到电泳纯度符合使用要求。本专利由于没有破坏大肠杆菌内膜，所以纯化的重组蛋白内毒素含量低，生产周期短和快捷，生产成本低，便于大规模工业化生产。即使单独使用离心去除菌体的发酵液纯化的目的蛋白也达到纯度和产率符合大规模工业化生产的要求，并且不需要破菌设备和破菌工艺，需要的纯化设备也十分简单容易添置，投资门槛低便于大规模工业化生产。
附图说明
图1：含不同基因序列3,5,6(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)的表达载体pET21d-CL1(1,4,7),pET21d-CL3(2,5,8)和pET21d-CL4(3,6,9)表达载体表达的菌体胞内、周质空间和发酵液中目的蛋白表达电泳图，大部分目的蛋白在发酵液中。1,2,3分别为基因序列3,5,6的菌体胞内表达，4,5,6为周质空间表达，7,8,9为发酵液中表达。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5kDa。
图2：不同基因序列3,5,6(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)的表达载体pET21d-CL1(1),pET21d-CL3(2)和pET21d-CL4(3)发酵液中目的蛋白经过镍柱纯化的蛋白电泳图。1,2,3分别为基因序列3,5,6的含6His的不同分子量的类人胶原蛋白。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图3：不同基因序列3,5,6(SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)的表达载体pET21d-CL1(1，4,6),pET21d-CL3(2,5,7)和pET21d-CL4(3,8,9)的表达菌通过发酵罐生产的发酵液和周质空间目的蛋白表达电泳图，大部分目的蛋白在发酵液中。1,2,3，4,5,9为发酵液蛋白，6，7，8为周质空间蛋白，M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图4：不同基因序列4,5,6(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)的表达载体pET21d-CL2(1，4),pET21d-CL3(2,5)和pET21d-CL4(3,6)的表达菌通过100升发酵罐生产的发酵液离心后和菌体提取的周质蛋白混合后一起分别过孔径5nm(1,2,3)和2nm(4,5,6)工业陶瓷膜后浓缩液的蛋白电泳图。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图5：将基因序列4(SEQ ID NO.4)的表达载体pET21d-CL2的发酵液和周质蛋白过了孔径5nm工业陶瓷膜的浓缩液加水稀释后进一步过孔径5nm(1,2)和2nm(3,4，5)工业陶瓷膜后的浓缩液蛋白电泳图，6为过孔径5nm工业陶瓷膜后的最初流出液电泳图。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图6：将基因序列5(SEQ ID NO.5)的表达载体pET21d-CL3的发酵液和周质蛋白过了孔径5nm工业陶瓷膜的浓缩液加水稀释后进一步过5nm(1,2,4,6)和2nm(3,5)工业陶瓷膜后的浓缩液蛋白电泳图。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图7：将基因序列6(SEQ ID NO.6)的表达载体pET21d-CL3的发酵液和周质蛋白过了孔径5nm工业陶瓷膜的浓缩液加水稀释后过了5nm工业陶瓷膜的浓缩液加水稀释后进一步过5nm(1,6)和2nm(2，3,4，5)工业陶瓷膜后的浓缩液蛋白电泳图。M为蛋白分子量，66,45,35,27,20,14.4,9.5，6.5,4.1kDa。
图8：将基因序列6(SEQ ID NO.6)的发酵液经过工业陶瓷膜孔径2nm后的浓缩液经过35％(1)，40％(2,5)，45％(3,6)，50％(4)不同硫酸铵浓度沉淀后进一步用75％硫酸铵(7)沉淀后电泳结果。
图9：将不同基因序列4,5,6(SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6)的发酵液经过工业陶瓷膜孔径2nm后的浓缩液经过40％硫酸铵浓度沉淀后进一步用75％硫酸铵沉淀后经过G25脱盐后的电泳结果。1,2,3,5为序列4的重组类人胶原蛋白，有的形成了2聚体。4,6,7为序列5的重组类人胶原蛋白,8为序列6的重组类人胶原蛋白。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明。
实施例1
将SEQ ID NO.1委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成后连接到pET21d载体的NcoI和BamHI酶切位点之间，将SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.4，SEQ IDNO.5，SEQ ID NO.6通过委托优化密码子和合成基因序列后分别连接到SEQ IDNO.1的第3个ATG后和BamHI酶切位点前的位置，可以通过提前与SEQ IDNO.1一起合成和连接，也可以单独合成基因序列后通过无缝连接技术直接连接。将SEQ ID NO.2委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成后连接到pET21d载体的BamHI和HindIII酶切位点之间，从而分别克隆到大肠杆菌DH5α，挑取单克隆进行PCR鉴定，获得pET21d-CL1,pET21d-CL2,pET21d-CL3,pET21d-CL4含不同片段的类人胶原蛋白克隆载体甘油菌，甘油菌提取质粒分别测序正确后转导到大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，分别获得4种目的蛋白分子量为6-12kDa的低分子量类人胶原蛋白的大肠杆菌分泌表达载体，这4种目的蛋白都来源于二种不同的人胶原蛋白基因片段表达的目的蛋白。前2种目的蛋白来源于一种人胶原蛋白基因片段，不同之处为含6His标签和不含6His标签，后2种目的蛋白来源于另外一种人胶原蛋白基因片段，区别在于基因片段的长度不同。目的蛋白的分子量都在6-12kDa之间。
实施例2
用pET21d-CL1,pET21d-CL3和pET21d-CL4的BL21表达甘油菌复苏后，在含100μg/ml氨苄青霉素的100毫升2XLB培养基中25度扩增，当OD600到达0.4-0.6时候，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达16-18小时，摇床转速180rpm-200rpm,表达结束后离心，菌体收集后，取少量菌体加入PBS超声破碎后制备电泳样品进行电泳，大部分菌体加入TBS缓冲液(Tris,30mM,pH8.0,蔗糖20％,EDTA钠盐2mM)洗涤菌体，6000rpm离心15分钟，弃上清液，进而用10倍体积的MgSO4水溶液重悬菌泥，4-8度磁力搅拌下放置30分钟，6000rpm离心15分钟，弃沉淀，上清液为不破坏大肠杆菌内膜情况下提取的包含目的蛋白的周质蛋白，取部分周质蛋白制备电泳样品进行电泳。取10毫升发酵液采用10％三氯乙酸(TCA)终浓度进行沉淀蛋白，用丙酮洗涤后60度烘干30分钟，加入0.01N NaOH制备电泳样品进行电泳。结果如图1，3种不同基因序列的低分子量类人胶原蛋白大部分表达在发酵液中，少量在周质空间中，在胞内含有极少目的蛋白，说明这几种低分子胶原蛋白通过SEQIDNO.1和SEQ ID NO.2组成的跨膜蛋白复合体大部分分泌到大肠杆菌发酵液中(图1)。
实施例3
用pET21d-CL1,pET21d-CL3和pET21d-CL4的BL21表达甘油菌复苏后，在含100μg/ml氨苄青霉素的1000毫升2XLB培养基中25度扩增，当OD600到达0.4-0.6时候，加入0.4mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达16-18小时，摇床转速180rpm,表达结束后离心，收集的上清液用滤纸过滤后直接上Roche公司的镍柱填料上柱亲和层析，用2升PBS洗脱，用含10mM咪唑的PBS100毫升洗脱非特异性蛋白，用含250mM咪唑的PBS 50毫升洗脱目的蛋白，收集的洗脱液采用10％三氯乙酸(TCA)终浓度进行沉淀蛋白，用丙酮洗涤后60度烘干30分钟，加入0.01N NaOH制备电泳样品进行电泳。结果如图2，发酵液中3种不同基因序列的低分子量胶原蛋白的目的蛋白在镍柱纯化中由于表达量不同，纯度不同，说明纯化的目的蛋白是本专利序列中含6His标签的低分子量类人胶原蛋白(图2)。
实施例4
用pET21d-CL2,pET21d-CL3和pET21d-CL4的BL21表达甘油菌复苏后进行100升BioPAS发酵罐(上海仅鑫制药设备有限公司)中试实验，发酵液60升，发酵培养基(g/L)：Tryptone 12.0，Yeast Extract 24.0，K2HPO4 16.4，KH2PO42.3，Glycerin 20.0，水解酪蛋白3.0，pH 6.8。补料培养基(g/L)：Tryptone 60.0，Yeast Extract 120.0，K2HPO4 82.2，KH2PO4 11.6，Glycerin 333.0，水解酪蛋白3.0，pH 6.8。利用100L发酵系统进行类人胶原蛋白的发酵，设置以下发酵条件：pH 6.8，溶解氧(dissolved oxygen，DO)>20％，37℃，400r/min。待OD600为8.0时用终浓度为0.4mmol/L的IPTG 25℃诱导23h结束发酵，期间监测发酵罐的溶氧参数和适当补液。将发酵液放出用GQ76管式分离机(上海戴宝机械设备有限公司)连续流离心机20000rpm离心，菌体加入TBS缓冲液(Tris,30mM,pH8.0,蔗糖20％,EDTA钠盐2mM)洗涤菌体，6000rpm离心15分钟，弃上清液，进而用10倍体积的MgSO4水溶液重悬菌泥，4-8度磁力搅拌下放置30分钟，6000rpm离心15分钟，弃沉淀，上清液为不破坏大肠杆菌内膜情况下提取的包含目的蛋白的周质蛋白。将周质蛋白和发酵液混合后过孔径50nm的工业陶瓷膜除菌，过陶瓷膜全程使用低温恒温槽(KDC-1010)保持低温。陶瓷膜流出液4度保存。流出液进一步采用孔径5nm的工业陶瓷膜错流过滤，流出液再同时进行孔径2nm的工业陶瓷膜错流过滤和浓缩，分别收集5nm的陶瓷膜浓缩液、流出液和2nm的陶瓷膜浓缩液、流出液，分别通过TCA沉淀进行电泳，结果见图4。由于过5nm膜的浓缩液中通过电泳鉴定仍有许多目的蛋白，进一步加不同倍比的纯水进行稀释后进一步进行采用孔径5nm的工业陶瓷膜错流过滤，流出液再同时进行孔径2nm的工业陶瓷膜错流过滤和浓缩，分别收集5nm的陶瓷膜浓缩液和2nm的陶瓷膜浓缩液通过TCA沉淀进行电泳，结果见图5,6,7。3类不同基因序列的类人胶原蛋白过陶瓷膜2nm后的浓缩液中目的蛋白已经获得初步纯化，杂蛋白较少。纯度已经达到90％左右。
实施例5
将实施例4经过2-3次不同孔径陶瓷膜初步纯化的3类不同序列的类人胶原蛋白实施不同浓度的硫酸铵沉淀，不但可以减少4度保存的2nm陶瓷膜浓缩液体积，也便以更好的保存重组蛋白。取不同体积的3类初步纯化的类人胶原蛋白2nm陶瓷膜浓缩液分别加入35％，40％，45％，50％不同浓度的硫酸铵，在磁力搅拌下慢慢加入不同量的硫酸铵，直到全部溶解后4度保存30分钟，12000rpm离心15分钟，取少量沉淀加入适量PBS制备成电泳样品进行电泳，上清液继续加到硫酸铵浓度达到终浓度75％，直到全部溶解后4度保存30分钟，12000rpm离心15分钟，沉淀用1/2-1/8原体积的PBS 4度复溶1-3天。过Sephadex G25(GEHealthcore Bio-Sciences AB)凝胶柱，过0.22μm膜，取部分样品制备成电泳样品进行电泳，用蛋白检测试剂盒测蛋白浓度。然后蛋白样品加入5％灭菌甘油-80度冰箱保存。结果如图8和图9所示，图9电泳中的第5和第7泳道及图8电泳中的第7泳道分别表示通过上述简易纯化过程后基因序列4,5,6表达的类人胶原蛋白电泳纯度已经显示为纯度符合要求的一条电泳条带，泳道内没有明显的杂蛋白存在。
因此，本申请采用大肠杆菌跨膜蛋白复合体将类人胶原蛋白分泌表达到发酵液或大肠杆菌周质空间，通过离心，提取周质蛋白，直接采用不同孔径的工业化陶瓷膜分离，采用梯度硫酸铵沉淀，过G25凝胶柱脱盐后，6-12kDa的3个不同序列的重组类人胶原蛋白的电泳纯度就已经达到符合使用要求，内毒素含量低，生产周期短和快捷，生产成本低，便于大规模工业化生产，冻存的或冻干后的样品可以直接应用于生物材料、医疗器械、化妆品等领域中作为原料使用。
Claims (10)
1.一种跨膜蛋白复合体基因，其特征在于，所述跨膜蛋白复合体基因包含三段基因，第一段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，第二段基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，第三段基因选自能够表达分子量在6-12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，所述第三段基因位于第一段基因的指定酶切位点前和第3个ATG后所指定的目的基因克隆插入位点，第二段基因位于第一段基因的指定酶切位点后。
2.根据权利要求1所述的跨膜蛋白复合体基因，其特征在于，所述能够表达分子量在6-12kDa类人胶原蛋白的人胶原蛋白基因片段，选自核苷酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的基因片段。
3.一种类人胶原蛋白，其特征在于，所述类人胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因。
5.一种重组大肠杆菌菌株，其特征在于，所述大肠杆菌菌株包含权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因，或者表达权利要求3所述的类人胶原蛋白。
6.一种类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括利用权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因、权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组大肠杆菌菌株生产的类人胶原蛋白。
7.根据权利要求6所述的类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将所述跨膜蛋白复合体基因连接到载体上，构建重组表达载体；
(2)将重组表达载体克隆到大肠杆菌中，鉴定，获得含类人胶原蛋白克隆载体甘油菌，甘油菌测序正确后提取质粒转导到大肠杆菌表达菌中，诱导表达；
(3)离心分离大肠杆菌菌体和发酵液，离心后的菌体提取周质蛋白，将发酵液和周质蛋白分别通过工业陶瓷膜过滤纯化，或者两者的混合物通过工业陶瓷膜过滤纯化，即得类人胶原蛋白。
8.根据权利要求7所述的类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述通过工业陶瓷膜过滤纯化后，所得类人胶原蛋白还可以再进行不同浓度的硫酸铵沉淀处理；优选的，硫酸铵的浓度梯度设置为35％，40％，45％，50％和75％。
9.根据权利要求7所述的类人胶原蛋白的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述通过工业陶瓷膜过滤纯化，是经过2-3次不同孔径陶瓷膜过滤，陶瓷膜的孔径为2-50nm。
10.权利要求1或2所述的跨膜蛋白复合体基因、权利要求4所述的重组表达载体、或权利要求5所述的重组大肠杆菌在制备类人胶原蛋白的应用。
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Citations (8)
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|---|---|---|---|---|
| CN101812457A (zh) * | 2010-02-05 | 2010-08-25 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种人类胶原蛋白片段的基因及其编码的氨基酸序列 |
| CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
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| CN103102407A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 西安益力欣生物科技有限公司 | 基因重组人胶原蛋白 |
| CN103122027A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-05-29 | 杨霞 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
| CN113185612A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-30 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种酿酒酵母表达长效重组iii型胶原蛋白及其在化妆品中的应用 |
| CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
| CN113440431A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-09-28 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组ⅲ型人源化胶原蛋白在头皮护理中的用途及包含其的头皮护理产品 |
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Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20110288274A1 (en) * | 2009-07-17 | 2011-11-24 | Russell Brooke H | Designer collagens and use thereof |
| CN101812457A (zh) * | 2010-02-05 | 2010-08-25 | 青岛贝尔特生物科技有限公司 | 一种人类胶原蛋白片段的基因及其编码的氨基酸序列 |
| CN102146135A (zh) * | 2010-12-23 | 2011-08-10 | 陕西九州生物医药科技园发展有限公司 | 一种重组类人胶原蛋白及其生产方法 |
| CN103122027A (zh) * | 2012-11-26 | 2013-05-29 | 杨霞 | 一种重组人源胶原蛋白及其生产方法 |
| CN103102407A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-15 | 西安益力欣生物科技有限公司 | 基因重组人胶原蛋白 |
| CN113185612A (zh) * | 2021-04-01 | 2021-07-30 | 芜湖英特菲尔生物制品产业研究院有限公司 | 一种酿酒酵母表达长效重组iii型胶原蛋白及其在化妆品中的应用 |
| CN113185604A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-07-30 | 江苏创健医疗科技有限公司 | 一种重组人xvii型胶原蛋白、制备方法和应用 |
| CN113440431A (zh) * | 2021-08-02 | 2021-09-28 | 山西锦波生物医药股份有限公司 | 重组ⅲ型人源化胶原蛋白在头皮护理中的用途及包含其的头皮护理产品 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FEDERICO CARAFOLI ET AL.: ""Collagen recognition and transmembrane signalling by discoidin domain receptors"", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA 》, vol. 1834, 2 November 2012 (2012-11-02), pages 2187 * |
| 李瑛琦等: ""III 型类人胶原蛋白在大肠杆菌重组表达及发酵制备"", 《微生物学通报》, vol. 47, no. 12, 20 December 2020 (2020-12-20), pages 4164 - 4171 * |
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