CN116621968B - 一种重组iii型人源化胶原蛋白纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胞内蛋白纯化技术领域，尤其涉及一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：S1：离心收集菌体；S2：制备细胞裂解液：该细胞裂解液中含有镧铽双核配合物裂解催化剂，且该裂解催化剂由二乙烯三胺与3,5‑吡唑二甲酸、2‑羟基间苯二甲酸通过酰胺化反应形成的环化中间体，进一步与La3+、Tb3+配位而成；S3：将沉淀菌体加入细胞裂解液中，37℃搅拌裂解3‑5h，再于10‑15MPa压力下匀浆30min，离心后，收集上清液I；S4：利用5wt%NaCl进行酸溶；S4：利用20wt%NaCl进行碱沉。本发明纯化方法有效提高胞内蛋白溶出率和目标蛋白提取率，能使目标蛋白纯度达到97.5%以上。
Description
技术领域
本发明涉及胞内蛋白纯化技术领域，尤其涉及一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法。
背景技术
胶原蛋白是哺乳动物体内含量最多的功能性结构蛋白，广泛存在于机体内的皮肤、肌腱、血管、牙齿、骨骼等结缔组织的细胞外基质中，在伤口愈合、细胞修复、皮肤抗衰老、细胞免疫等方面具有重要的应用价值。胶原蛋白由3条α 链的多肽链亚基组成，α 链自身构型为左手螺旋，三条α链又互相缠绕成右手螺旋结构，即胶原蛋白的“胶原域” ，其肽链通式为(Gly-X-Y)n，其中 X一般为Pro（脯氨酸），Y一般为Hyp（羟脯氨酸）。目前，胶原蛋白主要分为I型、II型、III型等类型，I型胶原蛋白分子组成为[α1(I)]2α2(I)，主要分布于骨骼中；II型胶原蛋白由[α1(II)]3 组成，主要由软骨细胞产生；III型胶原蛋白分子组成为[α1(III)]3，由于半胱氨酸的存在，肽链间能形成二硫键，可构成细纤维，主要存在于表皮层和真皮层之间的微胶原层，是维持肌肤高弹饱满的关键。
重组人源胶原蛋白是基于人体皮肤Ⅱ型和Ⅲ型胶原蛋白的原始基因序列，并一步优化选择其中高水溶性、高生物活性的部分，进行密码子优化和拼接重组，得到了全新的重组人源Ⅲ型胶原蛋白序列，并导入大肠杆菌、芽孢杆菌、毕赤酵母等微生物体内，利用微生物发酵技术进行规模化生产。但是，由于以大肠杆菌为宿主菌主要在细胞内表达重组III型人源化胶原蛋白目标产物，即胞内表达，加大了目标产物的提取难度，致使利用大肠杆菌工程菌发酵出的重组III型人源化胶原蛋白的分离纯化尤为困难。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，以解决现有重组III型人源化胶原蛋白纯化方法提取率低、得率低的问题。
基于上述目的，本发明提供了一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：
S1：收集菌体：2-4℃下，对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：按质量份依次称取6-8份三羟甲基氨基甲烷、3-5份镧铽双核配合物裂解催化剂、2-3份溶菌酶、2.5-3.5份乙二胺四乙酸、1-2份4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000份去离子水中，25-35℃搅拌分散0.5-1h，制得细胞裂解液；
所述的镧铽双核配合物裂解催化剂由二乙烯三胺与3,5-吡唑二甲酸、2-羟基间苯二甲酸通过酰胺化反应形成的环化中间体，进一步与La3+、Tb3+配位而成；
S3：将沉淀菌体加入细胞裂解液中，37℃搅拌裂解3-5h，再于10-15MPa压力下匀浆30min，再对所得匀浆裂解液进行离心后，收集上清液I；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理1-2h，在此pH=4.0酸性条件下，使杂蛋白沉淀，而目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白不沉淀，离心后，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于2-8℃静置处理1-2h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，离心后，弃上清并收集目标蛋白。
优选的是，S1、S3中，所述离心转速为6000-7000r/min，离心时间为10-20min。
优选的是，所述沉淀菌体与细胞裂解液的质量比为(1.4-1.55):(8.45-8.6)。
优选的是，所述沉淀菌体与细胞裂解液的质量比为1.5:8.5。
优选的是，所述镧铽双核配合物裂解催化剂的制备方法，包括以下步骤：
S21：将二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸加入去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将2-羟基间苯二甲酸加入无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入缩合剂HATU，70-75℃搅拌反应5-10h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入可溶性镧盐、可溶性铽盐，45-60℃搅拌反应2-3h，0℃冰浴冷却1-1.5h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；
该镧铽双核配合物裂解催化剂的合成反应方程式如下：
优选的是，所述可溶性镧盐为氯化镧、硝酸镧、乙酸镧中的一种或多种。
优选的是，所述可溶性铽盐为氯化铽、硝酸铽、乙酸铽中的一种或多种。
优选的是，所述二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸、去离子水、2-羟基间苯二甲酸、无水乙醇、缩合剂HATU、可溶性镧盐、可溶性铽盐的用量比例为(20-30)mmol:(10-15)mmol:70mL:(10-15)mmol:30mL:(0.2-0.3)g:(10-15)mmol:(10-15)mmol。
优选的是，S4、S5中，所述离心转速为10000-12000r/min，离心时间为10-20min。
本发明的有益效果：
本发明重组III型人源化胶原蛋白纯化方法首次利用细胞裂解液、pH=4.0/5wt%NaCl、pH=10.0/20wt%NaCl对菌体及上清液联合处理，有效提高胞内蛋白溶出率，进而提高目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白的提取率，能使目标蛋白纯度达到97.5%以上，可完全替代层析法进行纯化，进而避免高耗材、高成本的层析填料的使用，有效节约纯化成本，对于实际的生产工艺具有重要意义。
本发明首次利用二乙烯三胺与3,5-吡唑二甲酸、2-羟基间苯二甲酸通过酰胺化反应形成环化中间体，并进一步与La3+、Tb3+配位合成镧铽双核配合物裂解催化剂，并创造性地应用于裂解大肠杆菌菌体的细胞裂解液中，无需在40-100MPa高压匀浆条件下，即可实现大肠杆菌菌体的高效破裂、裂解，降低能耗，优化纯化工艺。发明人发现，在细胞裂解液体系中，仅添加少量的镧铽双核配合物裂解催化剂，即可达到优良的催化裂解效果，相比于不添加镧铽双核配合物的细胞裂解液，重组III型人源化胶原蛋白的提取率至少提高了210.6%。究其原因是，大肠杆菌细胞壁外膜自外向内由脂多糖(LPS)-磷脂双分子层-脂蛋白的结构组成，含有大量磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油等，且大肠杆菌脂多糖(LPS)中类脂A含有磷酸酯键，同时，大肠杆菌细胞膜结构中磷酸双分子层的极性头部由磷酸二酯键桥连，而裂解催化剂结构中La3+/Tb3+双金属中心能与磷酸酯基团中的2个O配位，因而，通过桥连两个磷酰基氧原子提供双倍的Lewis酸催化，极大地削弱了原有P-O键的强度，同时由于裂解催化剂结构中与Tb3+配位的羟基亲核进攻P原子，进一步促进了P-O键的裂解，进而使大肠杆菌细胞壁和细胞膜高效裂解；在镧铽双核配合物裂解催化剂对大肠杆菌细胞壁外膜攻击、裂解后，细胞裂解液中的溶菌酶对细胞壁内侧的肽聚糖进一步进行水解，进而促进大肠杆菌细胞壁的完全裂解。
此外，发明人还发现，相比于单一La3+或Tb3+配位成的裂解催化剂，La3+/Tb3+联合配位合成的双核配合物裂解催化剂表现出更优异的催化裂解性能，可能是由于La3+/Tb3+的联合配位产生了一定的协同催化裂解P-O键的效果。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明重组III型人源化胶原蛋白纯化方法流程图；
图2为实施例1-4及对比例1-5纯化方法分离纯化后的目标蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，Mark表示蛋白标准品，SS1-SS4依次表示实施例1-4分离纯化后的目标蛋白，DB1-DB5依次表示对比例1-5分离纯化后的目标蛋白。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。
本发明实施例所使用的大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌，构建方法依据“III 型类人胶原蛋白在大肠杆菌重组表达及发酵制备[J],李瑛琦等,微生物学通报”，具体为：
（1）引物设计与合成：根据类人胶原蛋白(human-like collagen，HLC) 的基因序列，设计并合成引物；
kit-F：5′-CGGGATCCAGAGGTCCACCCGGTGAGC-3′；
kit-R：5′-CGGAATTCTTAACCACCGGCTGGA CCTTGG-3′；
（2）构建表达质粒 pET-28a(+)-kit：
采用 pUC57-kit 质粒为模板，以 kit-F 及 kit-R 为引物，PCR 扩增基因 kit；
其中，PCR 反应条件：95 ℃、5 min；95 °C、30 s，55 °C 、30 s，72 °C、30 s，35 个循 环；72 °C、5 min；12 °C、12 h；
PCR 反应体系：Premix TaqTM DNA 聚合酶 25 μL，模板1μL，kit-F (10μmol/L) 1μL，kit-R (10μmol/L) 1μL，ddH2O 22μL；
将 PCR 产物及 pET-28a(+)质粒用 BamH I和 EcoR I 双酶切，过夜连接后，构建出表达质粒 pET-28a(+)-kit；
（3）转化大肠杆菌工程菌：将表达质粒 pET-28a(+)-kit转化至E.coli BL21(DE3)中，挑取阳性转化子，通过菌液 PCR 验证、双酶切(BamH I/EcoR I)验证及测序验证后进行斜面保藏，构建出大肠杆菌工程菌，即表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌。
本发明实施例所使用的大肠杆菌工程菌发酵液的制备方法为：
（1）配制TB培养基：胰蛋白胨25g/L、酵母提取物50g/L、K2HPO4 72 mM、KH2PO4 17mM、甘露醇0.8g/L、甘油4g/L、余量为水；
（2）将大肠杆菌工程菌接种至含有5L TB培养基的发酵罐内，控制大肠杆菌工程菌占TB培养基的质量百分比为2.0%，且发酵罐的参数设置如下：pH=6.8，溶解氧DO值为40%，搅拌速度为400r/min，发酵温度为37℃；
（3）待发酵罐内发酵体系的OD600值达到8.0时，加入卵磷脂至其终浓度为1mM，并于20℃诱导36h，得大肠杆菌工程菌发酵液。
如图 1 所示，本发明提供一实施例的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：
S1：收集菌体：2-4℃下，按6000-7000r/min的转速对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心10-20min后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：
按质量份依次称取6-8份三羟甲基氨基甲烷、3-5份镧铽双核配合物裂解催化剂、2-3份溶菌酶、2.5-3.5份乙二胺四乙酸、1-2份4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000份去离子水中，25-35℃搅拌分散0.5-1h，制得细胞裂解液；
所述的镧铽双核配合物裂解催化剂由二乙烯三胺与3,5-吡唑二甲酸、2-羟基间苯二甲酸通过酰胺化反应形成的环化中间体，进一步与La3+、Tb3+配位而成；
所述镧铽双核配合物裂解催化剂的制备方法，包括以下步骤：
S21：将二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸加入去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将2-羟基间苯二甲酸加入无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入缩合剂HATU，70-75℃搅拌反应5-10h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入可溶性镧盐、可溶性铽盐，45-60℃搅拌反应2-3h，0℃冰浴冷却1-1.5h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；所述可溶性镧盐为氯化镧、硝酸镧、乙酸镧中的一种或多种；所述可溶性铽盐为氯化铽、硝酸铽、乙酸铽中的一种或多种；
该镧铽双核配合物裂解催化剂的合成反应方程式如下：
所述二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸、去离子水、2-羟基间苯二甲酸、无水乙醇、缩合剂HATU、可溶性镧盐、可溶性铽盐的用量比例为(20-30)mmol:(10-15)mmol:70mL:(10-15)mmol:30mL:(0.2-0.3)g:(10-15)mmol:(10-15)mmol；
S3：将沉淀菌体加入细胞裂解液中，且控制沉淀菌体与细胞裂解液的质量比为(1.4-1.55):(8.45-8.6)，37℃搅拌裂解3-5h，再于10-15MPa压力下匀浆30min，再按6000-7000r/min的转速对所得匀浆裂解液进行离心10-20min后，收集上清液I；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理1-2h，在此pH=4.0酸性条件下，使杂蛋白沉淀，而目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白不沉淀，再按10000-12000r/min的转速离心10-20min，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于2-8℃静置处理1-2h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，按10000-12000r/min的转速离心10-20min后，弃上清并收集目标蛋白。
实施例1
一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：
S1：收集菌体：2℃下，按6000r/min的转速对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心10min后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：
S21：将20mmol二乙烯三胺、10mmol 3,5-吡唑二甲酸加入70mL去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将10mmol 2-羟基间苯二甲酸加入30mL无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入0.2g缩合剂HATU，70℃搅拌反应5h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入10mmol氯化镧、10mmol氯化铽，45℃搅拌反应2h，0℃冰浴冷却1h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；
S25：依次称取6g三羟甲基氨基甲烷、3g镧铽双核配合物裂解催化剂、2g溶菌酶、2.5g乙二胺四乙酸、1g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000g去离子水中，25℃搅拌分散0.5h，制得细胞裂解液；
S3：将140g沉淀菌体加入860g细胞裂解液中，37℃搅拌裂解3h，再于10MPa压力下匀浆30min，再按6000r/min的转速对所得匀浆裂解液进行离心10min后，收集上清液I；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理1h，再按10000r/min的转速离心10min，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于2℃静置处理1h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，按10000r/min的转速离心10min后，弃上清并收集目标蛋白。
实施例2
一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：
S1：收集菌体：3℃下，按6500r/min的转速对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心15min后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：
S21：将25mmol二乙烯三胺、12.5mmol 3,5-吡唑二甲酸加入70mL去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将12.5mmol 2-羟基间苯二甲酸加入30mL无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入0.25g缩合剂HATU，75℃搅拌反应8h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入12.5mmol硝酸镧、12.5mmol硝酸铽，55℃搅拌反应2.5h，0℃冰浴冷却1.5h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；
S25：依次称取7g三羟甲基氨基甲烷、4g镧铽双核配合物裂解催化剂、2.5g溶菌酶、3g乙二胺四乙酸、1.5g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000g去离子水中，30℃搅拌分散1h，制得细胞裂解液；
S3：将150g沉淀菌体加入850g细胞裂解液中，37℃搅拌裂解4h，再于12.5MPa压力下匀浆30min，再按6500r/min的转速对所得匀浆裂解液进行离心15min后，收集上清液I；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理1.5h，再按11000r/min的转速离心15min，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于5℃静置处理1.5h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，按11000r/min的转速离心15min后，弃上清并收集目标蛋白。
实施例3
一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，包括以下步骤：
S1：收集菌体：4℃下，按7000r/min的转速对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心20min后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：
S21：将30mmol二乙烯三胺、15mmol 3,5-吡唑二甲酸加入70mL去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将15mmol 2-羟基间苯二甲酸加入30mL无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入0.3g缩合剂HATU，75℃搅拌反应10h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入15mmol乙酸镧、15mmol乙酸铽，60℃搅拌反应3h，0℃冰浴冷却1.5h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；
S25：依次称取8g三羟甲基氨基甲烷、5g镧铽双核配合物裂解催化剂、3g溶菌酶、3.5g乙二胺四乙酸、2g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000g去离子水中，35℃搅拌分散1h，制得细胞裂解液；
S3：将155g沉淀菌体加入845g细胞裂解液中，37℃搅拌裂解5h，再于15MPa压力下匀浆30min，再按7000r/min的转速对所得匀浆裂解液进行离心20min后，收集上清液I；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理2h，再按12000r/min的转速离心20min，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于8℃静置处理2h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，按12000r/min的转速离心20min后，弃上清并收集目标蛋白。
实施例4与实施例3相同，区别在于：S3中，沉淀菌体用量为150g，细胞裂解液用量为850g。
对比例1与实施例1相同，区别在于：在细胞裂解液制备过程中不添加镧铽双核配合物裂解催化剂和溶菌酶。
对比例2与实施例1相同，区别在于：在细胞裂解液制备过程中不添加镧铽双核配合物裂解催化剂。
对比例3与实施例1相同，区别在于：在镧铽双核配合物裂解催化剂合成过程中不添加3,5-吡唑二甲酸，且2-羟基间苯二甲酸用量为20mmol。
对比例4与实施例1相同，区别在于：在双核配合物裂解催化剂合成过程中不添加氯化镧，且氯化铽用量为20mmol。
对比例5与实施例1相同，区别在于：在双核配合物裂解催化剂合成过程中不添加氯化铽，且氯化镧用量为20mmol。
测定实施例1-4及对比例1-5纯化后的目标蛋白质量，并根据公式100%*目标蛋白质量/沉淀菌体质量，计算重组III型人源化胶原蛋白的相对提取率，试验结果如表1所示：
由表1可知，相比于对比例1-5，实施例1-4纯化后所得的重组III型人源化胶原蛋白的相对提取率得到明显提升，证明了镧铽双核配合物裂解催化剂对于提高重组III型人源化胶原蛋白的分离提取率具有重要作用；且本发明纯化方法无需在40-100MPa高压匀浆条件下，即可实现大肠杆菌菌体的高效破裂、裂解，降低能耗。
通过对比实施例1及对比例2试验数据可知，在细胞裂解液体系中，仅添加少量的镧铽双核配合物裂解催化剂，即可达到优良的催化裂解效果。相比于对比例2（不添加镧铽双核配合物的细胞裂解液），实施例1的重组III型人源化胶原蛋白的提取率提高了210.6%。究其原因是，大肠杆菌细胞壁外膜自外向内由脂多糖(LPS)-磷脂双分子层-脂蛋白的结构组成，含有大量磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油等，且大肠杆菌脂多糖(LPS)中类脂A含有磷酸酯键，同时，大肠杆菌细胞膜结构中磷酸双分子层的极性头部由磷酸二酯键桥连，而裂解催化剂结构中La3+/Tb3+双金属中心能与磷酸酯基团中的2个O配位，因而，通过桥连两个磷酰基氧原子提供双倍的Lewis酸催化，极大地削弱了原有P-O键的强度，同时由于裂解催化剂结构中与Tb3+配位的羟基亲核进攻P原子，进一步促进了P-O键的裂解，进而使大肠杆菌细胞壁和细胞膜高效裂解。
通过对比实施例1及对比例1-2试验数据可知，镧铽双核配合物裂解催化剂对于细胞裂解液的裂解性能起到关键的作用，究其原因是，由于肽聚糖在大肠杆菌细胞壁内侧，需要在镧铽双核配合物裂解催化剂对大肠杆菌细胞壁外膜攻击、裂解后，溶菌酶才能明显发挥出水解肽聚糖的作用。
通过对比实施例1及对比例3试验数据可知，相比于在镧铽双核配合物合成过程中不添加3,5-吡唑二甲酸的对比例3（即全部以2-羟基间苯二甲酸形成环化中间体），实施例1表现出更优异的裂解大肠杆菌性能，具有更高的目标蛋白提取率，究其原因可能是，3,5-吡唑二甲酸可作为质子转移催化剂，催化磷脂、糖脂等类脂的水解，与2-羟基间苯二甲酸、二乙烯三胺共同制备环化中间体，有利于提升镧铽双核配合物对大肠杆菌菌体催化裂解作用。
通过对比实施例1及对比例4-5试验数据可知，相比于单一La3+或Tb3+配位成的裂解催化剂，La3+/Tb3+联合配位合成的双核配合物裂解催化剂表现出更优异的催化裂解性能，可能是由于La3+/Tb3+的联合配位产生了一定的协同催化裂解P-O键的效果；同时，对比例4(Tb3+配位的双核配合物裂解催化剂)抗菌性能又优于对比例5(La3+配位的双核配合物裂解催化剂)，说明Tb3+对于双核配合物裂解催化剂对于催化磷酸酯键的裂解具有更重要影响。
对实施例1-4及对比例1-5纯化后的目标蛋白进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示：在图2中，Mark表示蛋白标准品，SS1-SS4依次表示实施例1-4分离纯化后的目标蛋白，DB1-DB5依次表示对比例1-5分离纯化后的目标蛋白，由图可知，经实施例1-4及对比例1-5纯化后的蛋白泳道均未出现其他杂蛋白条带，说明本发明纯化方法可获得高纯度的重组III型人源化胶原蛋白，分析原因是，通过pH=4.0/5wt%NaCl、pH=10.0/20wt%NaCl对上清液进行联合处理，能有效分离出杂蛋白和目标蛋白，是保证目标蛋白产品纯度的关键手段，但是，实施例1-4的目标蛋白条带明显粗于对比例1-5的目标蛋白条带，说明实施例1-4的目标蛋白含量更高，证明了实施例1-4纯化方法对于菌体中的重组III型人源化胶原蛋白具有更高的提取率，进一步验证了实施例1-4中的镧铽双核配合物裂解催化剂对于菌体的破裂及目标蛋白提取率的提升具有重要影响。
经SDS-PAGE电泳分析及Quantity One软件分析，测得实施例1-4纯化后的目标蛋白纯度，试验结果如表2所示：
由表2可知，本发明重组III型人源化胶原蛋白纯化方法利用细胞裂解液、pH=4.0/5wt%NaCl、pH=10.0/20wt%NaCl对菌体及上清液联合处理，能使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白纯度达到97.5%以上，可完全替代层析法进行纯化，进而避免高耗材、高成本的层析填料的使用，大大降低纯化工艺成本。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：收集菌体：2-4℃下，对大肠杆菌工程菌发酵液进行离心后，弃上清并收集沉淀菌体；所述大肠杆菌工程菌为表达重组III型人源化胶原蛋白的大肠杆菌；
S2：制备细胞裂解液：按质量份依次称取6-8份三羟甲基氨基甲烷、3-5份镧铽双核配合物裂解催化剂、2-3份溶菌酶、2.5-3.5份乙二胺四乙酸、1-2份4-羟乙基哌嗪乙磺酸，并加入1000份去离子水中，25-35℃搅拌分散0.5-1h，制得细胞裂解液；
所述的镧铽双核配合物裂解催化剂由二乙烯三胺与3,5-吡唑二甲酸、2-羟基间苯二甲酸通过酰胺化反应形成的环化中间体，进一步与La3+、Tb3+配位而成；
所述镧铽双核配合物裂解催化剂的制备方法，包括以下步骤：
S21：将二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸加入去离子水，搅拌溶解后，得反应液I；
S22：将2-羟基间苯二甲酸加入无水乙醇中，搅拌溶解后，得反应液II；
S23：将反应液I加入反应液II中，加入缩合剂HATU，70-75℃搅拌反应5-10h，得环化中间体溶液；
S24：向环化中间体溶液中加入可溶性镧盐、可溶性铽盐，45-60℃搅拌反应2-3h，0℃冰浴冷却1-1.5h后，离心、洗涤、真空干燥后，得镧铽双核配合物裂解催化剂；
S3：将沉淀菌体加入细胞裂解液中，37℃搅拌裂解3-5h，再于10-15MPa压力下匀浆30min，再对所得匀浆裂解液进行离心后，收集上清液I；
所述沉淀菌体与细胞裂解液的质量比为(1.4-1.55):(8.45-8.6)；
S4：向S3所得上清液I中加入NaCl直至NaCl的质量浓度为5%，再调节pH=4.0，搅拌混合后，再于25℃静置处理1-2h，离心后，收集上清液II；
S5：向S4所得上清液II中继续加入NaCl直至NaCl的终质量浓度为20%，再调节pH=10.0，搅拌混合后，再于2-8℃静置处理1-2h，使目标蛋白重组III型人源化胶原蛋白沉淀，离心后，弃上清并收集目标蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，S1、S3中，所述离心转速为6000-7000r/min，离心时间为10-20min。
3.根据权利要求1所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，所述沉淀菌体与细胞裂解液的质量比为1.5:8.5。
4.根据权利要求1所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，所述可溶性镧盐为氯化镧、硝酸镧、乙酸镧中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，所述可溶性铽盐为氯化铽、硝酸铽、乙酸铽中的一种或多种。
6.根据权利要求1、4、5任一项所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，所述二乙烯三胺、3,5-吡唑二甲酸、去离子水、2-羟基间苯二甲酸、无水乙醇、缩合剂HATU、可溶性镧盐、可溶性铽盐的用量比例为(20-30)mmol:(10-15)mmol:70mL:(10-15)mmol:30mL:(0.2-0.3)g:(10-15)mmol:(10-15)mmol。
7.根据权利要求1所述的一种重组III型人源化胶原蛋白纯化方法，其特征在于，S4、S5中，所述离心转速为10000-12000r/min，离心时间为10-20min。
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