CN117186196A - 一种藻红蛋白的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种藻红蛋白的制备方法,提取步骤包括：鲜藻‑20℃冻融3次，捣碎后浸提3天，将PBS缓冲液加入冻融后的鲜藻中，捣碎机捣碎20秒，浸泡3天后，过滤两遍，离心取上层液，即得藻红蛋白提取液，提取液中藻红蛋白的纯度A565/A280可达1.0；纯化前处理步骤包括：藻红蛋白提取液经过硫酸铵盐析、PBS缓冲液复溶、离心、0.22μm过滤，可得纯度A565/A280达到2.0的藻红蛋白溶液；纯化步骤：经两次Bio‑Gel A‑0.5m凝胶过滤层析可分别得到纯度A565/A280≥4.5、A565/A280≥5.5的藻红蛋白溶液；纯化后处理：经过硫酸铵盐析或冻干工艺对得到的以上纯度的藻红蛋白产品后处理后可长达2年保存。通过本发明的技术方案，能得到高收率、高纯度、高荧光活性、易于长时间保存的藻红蛋白。
Description
技术领域
本发明涉及海藻色素提取技术领域，具体而言，特别涉及一种藻红蛋白的制备方法。
背景技术
藻红蛋白是一种荧光发射强烈的高效荧光水溶性色素蛋白，具有极高的荧光量子产额，可以作为荧光探针用于生物、医学研究以及疾病的诊断与治疗。藻红蛋白广泛存在于蓝藻、红藻和隐藻等藻类中的一种捕光色素蛋白。
藻红蛋白是一种胞内蛋白，选择合适的提取条件捣碎细胞、最大程度上回收藻体中的藻红蛋白、得到其高纯度提取液，是整个藻红蛋白制备的一个重要步骤。通常来说细胞被捣碎的程度越高，其藻红蛋白的得率也就越大，但是剧烈的细胞捣碎方法也将导致细胞内多糖等其他杂质也会大量释放出来，反而不利于之后的分离纯化。同时为了保持藻红蛋白的活性，其细胞捣碎条件也不能太过剧烈。目前常用于藻红蛋白提取的细胞捣碎方法主要有溶胀法、反复冻融法、搅切法、超声破碎法、化学处理法等。溶胀法虽然获得的藻红蛋白纯度较高，但该方法提取时间较长；反复融冻法受操作规模限制，耗时长、耗能多，一般只适用于实验室少量藻体的处理；搅切法的粗提液中含有大量杂质；超声捣碎法操作时间越久，料液温度就会越高，长时间的运行会导致蛋白质变性且该方法也会释放细胞中的大量杂质，不利后续蛋白质纯化；化学处理法由于加入的化学试剂增加后期纯化处理的难度，且残留的化学试剂不利于生物安全。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种藻红蛋白的制备方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：一种藻红蛋白的制备方法，鲜藻经过提取、纯化前处理、纯化、纯化后处理4个步骤，可分别得到A565/A280≥1.0、A565/A280≥2.0、A565/A280≥4.5、A565/A280≥5.5的藻红蛋白溶液，具体包括以下步骤：
S1提取：鲜藻-20℃冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，捣碎后浸提3天，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10的比例，将PBS缓冲液加入冻融后的鲜藻中，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，浸泡1天、2天、3天、4天、5天后，用400目网筛过滤两遍，4000rpm、4℃离心10min，取上层液，即得藻红蛋白提取液；提取后能得到A565/A280≥1.0纯度的提取液；
S2纯化前处理：藻红蛋白提取液经过硫酸铵盐析、离心、PBS缓冲液复溶、0.22μm过滤得纯度A565/A280≥2.0的藻红蛋白溶液；
S3纯化：经过一次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到4.5的藻红蛋白溶液，经过二次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到5.5的藻红蛋白溶液；
S4纯化后处理：硫酸铵盐析保存或加入甘露醇作为保护剂冻干保存对得到的以上纯度的藻红蛋白产品后处理后可达2年保存。
作为优选方案，鲜藻选用条斑紫菜、坛紫菜、多管藻中的一种或多种。
进一步地，步骤S1，具体包括以下步骤：
S1-1反复冻融：分别准确称取500g坛紫菜鲜藻放在-20℃冷冻16h、4℃融化8h的条件下反复冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，在完成不同冻融次数后按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例往鲜藻中加入PBS缓冲液，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
S1-2捣碎机捣碎：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
S1-3浸泡：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎20秒，放入4℃环境中浸泡1天、2天、3天、4天、5天时搅拌均匀，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
进一步地，冻融为3次，捣碎机捣碎为20秒，浸泡为3天。
作为优选方案，步骤S2具体包括以下步骤：选择固体硫酸铵作为盐析沉淀的盐，分别采用硫酸铵饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%做梯度实验，各取100ml提取液进行盐析，4℃过夜，4000rpm、4℃下离心 30min，弃上清取沉淀，用50mMPBS缓冲液将盐析沉淀进行复溶，再4000rpm、4℃下离心 30min，留上清液，经过0.22μm过滤，去掉不容的杂质，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
进一步地，硫酸铵饱和度为30%。
本发明由于采用了以上技术方案，与现有技术相比使其具有以下有益效果：采用的原料为新鲜的湿藻，最大程度的保留了终产品的活性，而大多数其他专利的原料一般为干粉或晒干产品。对于此原料得到的藻红蛋白产品纯度A565/A280能达到5.5以上，目前还未看到有专利提到用此原料能得到这么高纯度的产品。其次，也可根据对藻红蛋白的需求不同，分别得到纯度(A565/A280)≥1.0、纯度(A565/A280)≥2.0、纯度(A565/A280)≥4.5的藻红蛋白产品。
本发明对制备藻红蛋白的工艺参数进行优化设置，将冻融、捣碎、浸泡是结合来使用的前处理方法，冻融的次数、时间，捣碎的时间，浸泡的时间，还有他们三者的顺序都是和其他专利不相同的，冻融次数控制在3次，减少耗能和耗时，捣碎时间为一次20秒，在能充分破碎细胞的同时选择尽可能短的捣碎时间，保证捣碎对目的蛋白的破坏尽可能小，4℃浸泡3天，保证大量目的蛋白浸提出来，且选择尽可能少的浸泡天数，避免微生物对目的蛋白的污染，保证蛋白活性，再经过离心，方便后续的操作。将这些前处理方法结合，避开了以往常规操作耗时、耗能、降低蛋白活性的缺点。
本发明的纯化柱纯化方法简单、只需要一种缓冲液即可；不需要纯化前后的换液处理；可根据用户需求制备不同纯度的的藻红蛋白产品；能得到高纯度藻红蛋白产品；因蛋白不与纯化柱料结合，不需要结合后再洗脱，最大程度地保留藻红蛋白活性。
本发明的蛋白保存方法为硫酸铵盐析保存和冻干保存两种，这两种是蛋白保存常用的方法，但硫酸铵盐析的饱和度、冻干时保护剂种类和浓度针对不同的蛋白是不同的，针对专利中的藻红蛋白研究出适合的硫酸铵盐析保存和冻干保存方法，使产品保存时间更长。
本发明改进了天然海藻色素的生产工艺和技术，利用丰富的海藻资源开发新型天然海藻色素，具有巨大的市场意义与经济意义。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述部分中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为冻融次数对藻红蛋白纯度、含量的影响图；
图2为捣碎时间对藻红蛋白浸出纯度的影响对照图；
图3为捣碎时间对藻红蛋白浸出含量的影响对照图；
图4为浸泡时间对藻红蛋白纯度的影响对照图；
图5为浸泡时间对藻红蛋白含量的影响对照图；
图6为不同硫酸盐饱和度对藻红蛋白提取液含量和纯度的影响对照图；
图7为三种类型层析柱纯化新鲜坛紫菜样品纯度结果对比图；
图8为三种类型层析柱纯化新鲜坛紫菜样品荧光结果对比图；
图9为硫酸铵盐析保存的藻红蛋白的含量和荧光随着月份变化图；
图10为加入甘露醇作为保护剂冻干保存的藻红蛋白的含量和荧光随着月份变化图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
下面结合图1至图10对本发明的实施例的藻红蛋白的制备方法进行具体说明。
本发明提出了一种藻红蛋白的制备方法，鲜藻经过提取、纯化前处理、纯化、纯化后处理4个步骤，可分别得到A565/A280≥1.0、A565/A280≥2.0、A565/A280≥4.5、A565/A280≥5.5的藻红蛋白溶液，鲜藻选用条斑紫菜、坛紫菜、多管藻中的一种或多种。具体包括以下步骤：
S1提取：鲜藻-20℃冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，捣碎后浸提3天，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10的比例，将PBS缓冲液加入冻融后的鲜藻中，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，浸泡1天、2天、3天、4天、5天后，用400目网筛过滤两遍，4000rpm、4℃离心10min，取上层液，即得藻红蛋白提取液；将冻融、捣碎、浸泡、离心方法结合，包括冻融的次数、时间，捣碎的时间，浸泡的时间，离心力、离心时间，还有他们四者的顺序，使其更适用于本专利提到的鲜藻原料的提取方法，更好的提高收率且省时、减少能耗。提取后能得到A565/A280≥1.0纯度的提取液；冻融次数控制在3次，减少耗能和耗时，捣碎时间为一次20秒，在能充分破碎细胞的同时选择尽可能短的捣碎时间，保证捣碎对目的蛋白的破坏尽可能小，4℃浸泡3天，保证大量目的蛋白浸提出来，且选择尽可能少的浸泡天数，避免微生物对目的蛋白的污染，保证蛋白活性，再经过离心，方便后续的操作。将这些前处理方法结合，避开了以往常规操作耗时、耗能、降低蛋白活性的缺点。具体包括以下步骤：
S1-1反复冻融：分别准确称取500g坛紫菜鲜藻放在-20℃冷冻16h、4℃融化8h的条件下反复冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，在完成不同冻融次数后按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例往鲜藻中加入PBS缓冲液，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
冻融次数对藻红蛋白纯度、含量的影响如图1所示，随着冻融次数的增加，藻红蛋白含量增加，尤其是冻融3次及以上，含量明显增加，冻融到第三次，随着冻融次数的增加，纯度增加，冻融3次以上，纯度变化不明显，反复冻融法的提取条件为试验中冻融3次及以上。
S1-2捣碎机捣碎：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
捣碎时间对藻红蛋白纯度、含量的影响如图2和图3所示，捣碎20秒比未捣碎浸出的藻红蛋白纯度和含量都高，但随着捣碎时间的延长，浸出的藻红蛋白含量增加，但变化不明显，而纯度随着捣碎时间的延长降低，可能是搅拌机工作时间长了以后产热造成蛋白破坏的结果，故此处选择最优捣碎时间为20秒。
S1-3浸泡：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎20秒，放入4℃环境中浸泡1天、2天、3天、4天、5天时搅拌均匀，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
浸泡时间对藻红蛋白纯度、含量的影响如图4和图5所示，随着浸泡时间的延长，不同冻融次数的藻红蛋白的含量都增加，尤其是前3天增长较为明显，随着浸泡时间的延长，藻红蛋白的纯度变化趋势表现为前三天增加，后3天逐渐降低，通过紫外分光光度计检测，当浸泡时间超过三天后，藻蓝蛋白的峰会逐渐增加，导致藻红蛋白纯度降低，当浸泡时间超过三天后，观察浸出液颜色也变得越来越紫，故选择最优浸泡条件为浸泡3天。
通过图4和图5也可看出，冻融3次、4次、5次、6次后，再通过捣碎20秒、浸泡三天后，浸出液中藻红蛋白的含量和纯度区别不大，为了节省后续试验时间，减少冻融耗能，故选择最优提取方法为坛紫菜-20℃冷冻16h、4℃融化8h的条件下反复冻融3次、捣碎机捣碎20秒、浸泡3天。使用紫外可见分光光度计测定藻红蛋白浸出上清液在280nm、498nm、565nm下的吸光度，计算藻红蛋白的纯度和含量。
藻红蛋白的纯度、含量计算公式：
P＝A565/A280
M＝N×(A565/8.166) ×V
上式中：P——藻红蛋白的纯度；
M——藻红蛋白的含量，mg；
N——上清液稀释倍数；
V——坛紫菜料液的体积，L；
A280、A565分别为样品在280nm、498nm、565nm波长下的吸光度值。
S2纯化前处理：藻红蛋白提取液经过硫酸铵盐析、离心、PBS缓冲液复溶、0.22μm过滤，此步骤相对成本较低，操作较简单，便可得纯度A565/A280≥2.0的藻红蛋白溶液；对于本专利鲜藻原料，经摸索，硫酸铵盐析的最佳饱和对为30%，在此饱和度下，能使原料中大部分目的蛋白沉淀，其余蛋白留在上清液中达到分离目的，此饱和浓度相对较低，相对节省硫酸铵试剂。再经4000rpm、4℃下离心 30min，得到目的蛋白沉淀，目的蛋白沉淀用PBS缓冲液复溶，经0.22um过滤后便可上柱纯化，因提取液中还残留少量鲜藻杂质，先沉淀再过滤比先过滤再沉淀节省时间，且能保证上柱前没有大于0.22um颗粒。具体包括以下步骤：
为了实现藻红蛋白的纯度更高，盐析让蛋白沉淀是一种选择，因藻红蛋白提取液为4000rpm、4℃下离心 10min的上清液，提取液中有可见黑色“原料”，会影响盐析沉淀的效果，选择固体硫酸铵作为盐析沉淀的盐，分别采用硫酸铵饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%做梯度实验，各取100ml提取液进行盐析，4℃过夜，4000rpm、4℃下离心 30min，弃上清取沉淀，用50mMPBS缓冲液将盐析沉淀进行复溶，再4000rpm、4℃下离心 30min，留上清液，经过0.22μm过滤，去掉不容的杂质，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
不同硫酸铵盐析饱和度对藻红蛋白提取液处理后含量和纯度的影响如图6所示，随着硫酸铵饱和度的增加，藻红蛋白的含量逐渐增加，藻红蛋白的纯度先降低后增加，再30%饱和度的时候纯度最高，A565/A280能大2.0以上，考虑到要得到高纯度藻红蛋白产品，且30%饱和度的含量可接受，故此方法最优条件为30%饱和度硫酸铵沉淀，可得纯度2.0以上的，且收率大于60%的藻红蛋白溶液。
S3纯化：两次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析，平衡液和洗脱液均为PBS缓冲液，根据洗脱峰进行收集，经过一次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到4.5的藻红蛋白溶液，经过二次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到5.5的藻红蛋白溶液；这种纯化方法简单、只需要一种缓冲液即可，且不需要纯化前后的换液处理，可根据用户需求制备不同纯的的藻红蛋白产品，Bio-Gel A-0.5m凝胶是惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，能很好的保护藻红蛋白的活性，减少纯化过程中藻红蛋白的荧光损失。
将纯度A565/A280≥2.0的新鲜坛紫菜制备的藻红蛋白溶液浓缩至1mg/ml，分别用Bio-Gel A-0.5m、DEAE Cellulose-52、DEAE Sepharose三种层析柱经过两次纯化，三种类型层析柱纯化新鲜坛紫菜样品纯度结果对比如图7所示，三种类型层析柱纯化新鲜坛紫菜样品荧光结果对比如图8所示，经过一次DEAECellulose-52纯化得到的样品纯度最高，但荧光稍微弱于经过一次Bio-Gel A-0.5m纯化得到的样品，说明一次Bio-Gel A-0.5m纯化对新鲜坛紫菜制备的藻红蛋白样品活性影响较小；经过两次Bio-Gel A-0.5m纯化得到的样品，纯度和荧光均比另外两种纯化柱纯化两次得到的样品高，说明相对于DEAECellulose-52、DEAE Sepharose两种离子层析柱，Bio-Gel A-0.5m凝胶层析柱更适用于纯化新鲜坛紫菜制备的藻红蛋白样品，因Bio-Gel A-0.5m凝胶是惰性载体，不带电荷，吸附力弱，蛋白不与纯化柱料结合，不需要结合后再洗脱，操作条件比较温和，能很好的保护藻红蛋白的活性，减少纯化过程中藻红蛋白的荧光损失，且经过两次纯化可得到高纯度藻红蛋白产品。这种纯化方法简单、只需要一种缓冲液即可，且不需要纯化前后的换液处理。
S4纯化后处理：为了实现藻红蛋白长期保存，硫酸铵盐析保存或加入甘露醇作为保护剂冻干保存对得到的以上纯度的藻红蛋白产品后处理后可达2年保存。
保存两年检测藻红蛋白含量和荧光，总体变化不大，且都在质量控制合格范围内。
硫酸铵盐析保存的藻红蛋白的含量和荧光随着月份变化如图9所示，加入甘露醇作为保护剂冻干保存的藻红蛋白的含量和荧光随着月份变化如图10所示，随着考察月份的增加，这两种方式保存的藻红蛋白含量和荧光略有下降趋势，但总体变化不大，且都在质量控制合格范围内。
在本发明的描述中，术语“多个”则指两个或两个以上，除非另有明确的限定，术语“上”、“下”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制；术语“连接”、“安装”、“固定”等均应做广义理解，例如，“连接”可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连。对于本领域的普通技术人员而言,可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本说明书的描述中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“具体实施例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或实例。而且，描述的具体特征、结构、材料或特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种藻红蛋白的制备方法，其特征在于, 鲜藻经过提取、纯化前处理、纯化、纯化后处理4个步骤，可分别得到A565/A280≥1.0、A565/A280≥2.0、A565/A280≥4.5、A565/A280≥5.5的藻红蛋白溶液，具体包括以下步骤：
S1提取：鲜藻-20℃冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，捣碎后浸提3天，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10的比例，将PBS缓冲液加入冻融后的鲜藻中，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，浸泡1天、2天、3天、4天、5天后，用400目网筛过滤两遍，4000rpm、4℃离心10min，取上层液，即得藻红蛋白提取液；提取后能得到A565/A280≥1.0纯度的提取液；
S2纯化前处理：藻红蛋白提取液经过硫酸铵盐析、离心、PBS缓冲液复溶、0.22μm过滤，得纯度A565/A280≥2.0的藻红蛋白溶液；
S3纯化：经过一次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到4.5的藻红蛋白溶液，经过二次Bio-Gel A-0.5m凝胶过滤层析纯化后可得纯度A565/A280达到5.5的藻红蛋白溶液；
S4纯化后处理：硫酸铵盐析保存或加入甘露醇作为保护剂冻干保存对得到的以上纯度的藻红蛋白产品后处理后可达2年保存。
2.根据权利要求1所述的一种藻红蛋白的制备方法,其特征在于,所述鲜藻选用条斑紫菜、坛紫菜、多管藻中的一种或多种。
3.根据权利要求2所述的一种藻红蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S1，具体包括以下步骤：
S1-1反复冻融：分别准确称取500g坛紫菜鲜藻放在-20℃冷冻16h、4℃融化8h的条件下反复冻融1次、2次、3次、4次、5次、6次，在完成不同冻融次数后按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例往鲜藻中加入PBS缓冲液，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
S1-2捣碎机捣碎：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎0秒、20秒、40秒、60秒，搅拌均匀后，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量；
S1-3浸泡：选取冻融3次、4次、5次、6次的500g坛紫菜鲜藻，按照鲜藻：PBS缓冲液=1：10（重量体积比）的比例各往鲜藻中加入PBS缓冲液，捣碎机捣碎20秒，放入4℃环境中浸泡1天、2天、3天、4天、5天时搅拌均匀，4000rpm、4℃下离心 10min，取上清液测定样品在565nm、498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
4.根据权利要求3所述的一种藻红蛋白的制备方法,其特征在于,所述冻融为3次，捣碎机捣碎为20秒，浸泡为3天。
5.根据权利要求1所述的一种藻红蛋白的制备方法,其特征在于,所述步骤S2具体包括以下步骤：选择固体硫酸铵作为盐析沉淀的盐，分别采用硫酸铵饱和度为10%、20%、30%、40%、50%、60%做梯度实验，各取100ml提取液进行盐析，4℃过夜，4000rpm、4℃下离心30min，弃上清取沉淀，用50mMPBS缓冲液将盐析沉淀进行复溶，再4000rpm、4℃下离心30min，留上清液，经过0.22μm过滤，去掉不容的杂质，取上清液测定样品在565nm、 498nm、280nm下的吸光度，计算样品纯度、含量。
6.根据权利要求5所述的一种藻红蛋白的制备方法,其特征在于,所述硫酸铵饱和度为30%。
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| TW201927319A (zh) * | 2017-12-26 | 2019-07-16 | 國立台灣海洋大學 | 紅隱藻之培養以產製藻紅蛋白之方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 曾繁杰等: "条斑紫菜的藻胆蛋白的研究——I. R-藻红蛋白的物理和免疫化学研究", 《中国科学 B辑》, pages 364 - 368 * |
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