CN111172044A - 高产红曲色素的红曲霉菌株及利用其生产胞外色素的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产红曲色素的红曲霉菌株，其分类命名为紫色红曲霉菌，菌株号为CSU‑M 630，保藏编号为CCTCC NO：M 2019596，保藏日期为2019年8月1日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。本发明通过常压室温等离子体诱变系统，获得了一株高产胞外色素的红曲霉突变株，其生产胞外色素的能力较亲本菌株提高了2倍；本发明利用该突变菌株进行固定化分批发酵，其胞外色素色价可高达108.32U/mL，是常规液态发酵的3倍，且有效缩短了生产周期，提高了胞外色素的生产效率。

Description

高产红曲色素的红曲霉菌株及利用其生产胞外色素的方法
技术领域
本发明涉及发酵工程技术领域，具体涉及一株高产红曲色素的红曲霉菌株及 利用其生产胞外色素的方法。
背景技术
红曲米/粉，以传统大宗粮食稻米为原料经红曲发酵而来的药食产品，是我 国一种传统色彩符号，具备调节血脂、血压、增强免疫、增加抗体等功能，在食 品工业领域的应用已经相当普遍。我国食用红曲米的省份主要集中在江苏、上海、 福建、江西、浙江等华南省市，人均食用红曲米在14～80g/d。据调查，我国东 南部地区犯心脑血管疾病人口相对较低，极大可能归因于长期食用红曲米的习惯。 目前，根据红曲霉菌次级代谢物种类差异，市面上红曲产品主要集中表现在“色 素红曲”(适用于着色剂和糖化剂)和“功能性红曲”(Monacolin K，适用于保健)。 相对于人工合成色素，红曲色素作为天然的食品色素添加剂，无毒害等副作用而 日益受到消费者的关注。
近10年来，基于传统的固态发酵生产红曲色素生产周期长、劳动密集、培 养占据面积大等缺点，液态深层发酵方式生产体积大、发酵周期短、易控制等优 势，红曲色素的生产研究方向由固态发酵方式转向液态深层发酵。然而，70％-80％ 左右红曲色素以醇溶性积累于菌丝内(胞内色素)，仅少量色素再经过氨基化或 糖基化生成水溶性而释放至胞外(称为胞外色素)。因此，提升胞内色素的分泌 备受研究者关注。除了采用传统的物理诱变育种提高红曲胞外色素生产水平外， 2012年，上海交通大学王志龙教授团队利用TritonX-100显著提升了胞外色素分 泌水平；2013年，江南大学许赣荣团队研究了不同表面活性剂对Monascus purpureus H1102色素和生物量的影响，得到15g/L Triton X-100添加显著性提高 总色价量(304.3U/mL)和胞外/胞内色素比例(1.46)；2017年，Sunil H.Koli等 人发现30ug/mL氟康唑能够抑制基因ERG11表达，降低麦角甾醇合成，发酵 96h时色素生产水平提高88％；2018年，江南大学张薄博团队利用表面活性剂 Span-80使得红曲黄色素产量提高27.8倍。提升胞外色素的生产水平主要集中在 发酵参数的调控上，改变发酵工艺提高红曲胞外色素的生产强度问题关注甚少。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一株高产红曲色素的红曲霉菌株及利 用其生产胞外色素的方法，本发明通过常压室温等离子体诱变系统，获得了一株 高产胞外色素的红曲霉突变株，其生产胞外色素的能力较亲本菌株提高了2倍； 本发明利用该突变菌株进行固定化分批发酵，其胞外色素色价可高达108.32 U/mL，是常规液态发酵的3倍，且有效缩短了生产周期，提高了胞外色素的生 产效率。
本发明通过下述技术方案实现。
高产红曲色素的红曲霉菌株，其特征在于：其分类命名为紫色红曲(Monascuspurpureus)，菌株号为CSU-M630，保藏编号为CCTCC NO：M 2019596，保藏 日期为2019年8月1日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心，保藏地址为： 中国武汉，武汉大学。
作为具体技术方案，所述菌株采用如下方法获得：将亲本菌株紫色红曲LQ-6 (保藏编号为CCTCC NO：M2018600，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心) 利用常压室温等离子体诱变系统进行诱变，诱变条件为：产生等离子体的载气为 99.999％的高纯氦气，气量为10.00SLM，入射功率120W，工作距离2mm，处 理时间为150s，得诱变后的菌液；之后从诱变后的菌液中筛选出红曲色素产量 最大的诱变菌株，即得如权利要求1所述的红曲色素高产红曲霉菌株。
作为具体技术方案，所述诱变菌株的筛选方法如下：
1)将诱变后的菌液均匀涂布于PDA平板中，于30℃中避光倒置培养7d， 淘汰菌落明显偏小、生长速度慢、菌丝稀薄的菌落，筛选出菌落形态与原菌株有 明显差异、生长较快或特别红的单菌落；
2)将步骤1)筛选出的单菌落接种至PDA平板培养基中，并对应编号，于 30℃避光倒置培养7d，得培养好的突变株；
3)将步骤2)获得的突变株接种至PDB培养基中，于30℃、150r/min黑 暗振荡培养7d，得突变株孢子悬液；将突变株孢子悬液接入发酵液中，于30℃、 150r/min黑暗振荡培养7d后测定红曲胞外色素，筛选出产量最大的菌株。
一种高效生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)制备红曲霉菌孢子悬浮液：将上述的胞外色素红高产曲霉菌株制成浓度 为1.0×106孢子/mL的红曲霉菌孢子悬浮液；
2)包埋固定化：将红曲霉菌孢子悬浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻 酸钠溶液以质量比1:7～10g/g的比例混合均匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气 泡消失后逐滴滴入至已灭菌的质量浓度为8％的氯化钙溶液中，制成直径为2～3 mm的固定化颗粒，之后继续让固定化颗粒在氯化钙溶液中于2～8℃条件下浸泡 2～6h，然后滤出固定化颗粒，用生理盐水洗三次，之后将固定化颗粒浸泡在生 理盐水中于2～8℃保存备用；
3)多批次连续发酵：将包埋固定化后的红曲霉菌孢子悬浮液进行发酵罐分 批发酵；
4)分离纯化：将发酵后的发酵液经过大孔吸附树脂将红曲色素分离纯化； 其中，分离纯化采用分离耦合工艺，具体步骤如下：在第一个循环发酵进行72h 后，将发酵罐中的含有色素的发酵液泵入装有大孔吸附树脂的分离柱中进行色素 的吸附；大孔吸附树脂吸附饱色素和后转入色素洗脱和树脂再生程序，并使用新 的分离柱吸附色素；将再生后的大孔吸附树脂使用纯水洗去乙醇溶液，用于色素 的再吸附；将经大孔吸附树脂吸附掉色素后的发酵液重新泵入发酵罐中进行发酵； 当发酵罐中的色价稳定后，排出发酵液，固定有红曲细胞的海藻酸钙微球继续截 留在发酵罐中，并重新注入新鲜的发酵液进行连续发酵；如此重复直至发酵罐中 的固定化小球全部破裂，则整个发酵过程结束；洗脱下来的色素溶液经乙醇回收 和干燥程序后得到色素产品。
作为具体技术方案，所述步骤(1)制备红曲霉菌孢子悬浮液具体为，将权 利要求1所述的胞外色素红高产曲霉菌株用马铃薯葡萄糖培养基在30℃条件下 培养7天，之后用4层无菌医用纱布过滤发酵液，0.85％生理盐水等体积洗涤两 次，0.85％生理盐水调整至孢子数1.0×106个/mL。
作为具体技术方案，所述步骤(2)包埋固定化具体为，将红曲霉菌孢子悬 浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻酸钠溶液以质量比1:9g/g的比例混合均 匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气泡消失后逐滴滴入至已灭菌的质量浓度为8％ 的氯化钙溶液中，制成直径为2～3mm的固定化颗粒，之后继续让固定化颗粒 在氯化钙溶液中于4℃条件下浸泡4h，然后滤出固定化颗粒，用生理盐水洗三 次，之后将固定化颗粒浸泡在生理盐水中于4℃保存备用；
作为具体技术方案，所述步骤(3)多批次连续发酵中，按照接种量为8％～12％的孢子悬浮液制备成固定化颗粒接种。
作为具体技术方案，所述步骤(3)多批次连续发酵中，发酵罐分批发酵中 发酵液培养基的配方如下：葡萄糖80g/L；酵母膏2.5g/L；麦芽浸膏2.5g/L； 蛋白胨2.5g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.01g/L； MnSO4·7H2O 0.03g/L；KH2PO4 0.01g/L；ZnSO4·7H2O 80g/L。
作为具体技术方案，所述步骤(4)分离纯化中，采用体积浓度为95％的乙 醇水溶液作为洗脱剂。
作为具体技术方案，所述步骤(4)分离纯化中，大孔吸附树脂的粒度0.40～1.25mm为97.20％，含水量为51.26％，湿视密度为0.69g/mL，湿真密度为1.06 g/mL，质量全交换容量为5.12mmol/g，渗磨圆球率为98.25％。
与现在技术相比，本发明有益效果如下：
1)本发明利用常压室温等离子体(ARTP)诱变系统，获得了一株高产胞外 色素的红曲霉突变株CSU-M630。经检测比较，亲本菌株紫色红曲LQ-6经常规 液态发酵后其胞外色素色价为12.07U/mL，而筛选的突变株紫色红曲 CSU-M630经常规液态发酵后其胞外色素色价为34.12U/mL，突变株紫色红曲 CSU-M630生产胞外色素的能力较亲本菌株提高了约2倍。
2)本发明以红曲霉突变株CSU-M630为发酵菌株，利用固定化分批发酵技 术，可将整个发酵周期缩短至8天，平均红曲胞外色素色价为92.05U/mL，生 产强度为11.51U/mL·d-1，得率为1.15U/g；相比常规液态发酵，本发明利用固 定化分批发酵技术，使突变株CSU-M630生产胞外红曲色素分别提高了2倍。
3)本发明工艺简单，可操作性强，产品投入成本低，可工业化生产，人工 劳动少，有利于红曲色素生产的工业化应用。
附图说明
图1为发酵液中红曲色素全波段扫描结果；
图2为亲本菌株和本发明突变菌株经常规液态发酵液后的胞外色价测定结 果；
图3为本发明突变株紫色红曲CSU-M630采用固定化分批发酵胞外色价测 定结果；
图4为本发明模拟的多批次发酵分离耦合工艺图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的实施例中的技术方案进行清楚、完整 的描述。基于本发明种的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创新性劳动前 提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
实施例1
亲本菌株紫色红曲LQ-6经ARTP诱变获得本发明突变株紫色红曲 CSU-M630的方法。
1)将亲本菌株紫色红曲LQ-6制成孢子悬浮液，将灭菌载片预热后，取事 先制备好的菌悬液10μL均匀涂布在其表面，将装有载片的灭菌培养皿转移至 ARTP操作室内，用无菌镊子将载片放到对应凹槽中，调节手动旋转样品载台位 置，使载片固定于等离子体发生器射流出口正下方处。经实验优化，诱变条件为： 产生等离子体的载气为99.999％的高纯氦气，气量为10.00SLM，入射功率120W， 工作距离2mm，处理时间为150s，此条件下红曲霉菌株致死率为90％，正突变 率较高。参数设置完毕后开始对样品进行处理，将处理完毕的载片放入盛有400 μL无菌水的2ml规格EP管中振荡洗脱15～20s，得诱变后的菌液。
2)取诱变后的菌液，均匀涂布于PDA平板中，放入30℃恒温生化培养箱 中避光倒置培养7d，淘汰菌落明显偏小、生长速度慢、菌丝稀薄的菌落，筛选 出菌落形态与原菌株有明显差异、生长较快或特别红的单菌落；刮取适量筛选出 的单菌落接种至新鲜的PDA平板培养基中，对应编号，30℃避光倒置培养7d， 得到培养好的突变株；刮取适量培养好的突变株接种于装有30mL PDB培养基 的三角烧瓶中，于30℃、150r/min的旋恒温摇床上黑暗振荡培养7d；再将突变 株孢子悬液接入发酵液中，于30℃、150r/min的旋恒温摇床上黑暗振荡培养7d 后测定红曲胞外色素，结果见图2，以筛选出产量最大的菌株，并命名为紫色红 曲CSU-M630。
由图2可知，亲本菌株紫色红曲LQ-6经常规液态发酵后其胞外色素色价为12.07U/mL，而筛选的突变株紫色红曲CSU-M630经常规液态发酵后其胞外色 素色价为34.12U/mL，是亲本菌株紫色红曲LQ-6的3倍。本发明突变株紫色红 曲CSU-M630的ITS4基因序列测定结果如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
本发明突变株紫色红曲CSU-M630采用固定化分批发酵后胞外色素色价的 检测。
a、将本发明突变株紫色红曲CSU-M630在无菌条件下，按10％(V/V)的 接种量接入红曲霉菌发酵液中，于30℃，150rpm条件的恒温摇床上黑暗培养7 d；然后利用4层无菌医用纱布过滤发酵液，0.85％生理盐水等体积洗涤两次，无 菌水调整至孢子数为1.0×106孢子/mL，得红曲霉菌孢子悬浮液；
b、将红曲霉菌孢子悬浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻酸钠溶液以质 量比1:9g/g的比例混合均匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气泡消失后逐滴滴入 至已灭菌的质量浓度为8％的氯化钙溶液中，制成直径为2～3mm的固定化颗粒， 之后继续让固定化颗粒在氯化钙溶液中于4℃条件下浸泡4h，然后滤出固定化 颗粒，用生理盐水洗三次，之后将固定化颗粒浸泡在生理盐水中于4℃保存备用； 然后将结构稳定的海藻酸钙微球按接种量10％(v/v)进行发酵罐分批发酵，并检测 胞外色素含量，结果见图3。
由图3可知，本发明突变株紫色红曲CSU-M630采用固定化分批发酵生产 红曲胞外色素，其胞外色素色价可高达108.32U/mL，胞外色素平均色价为90.02 U/mL，是常规液态发酵34.12U/mL的3倍左右，可见本发明采用固定化分批发 酵可大幅提高突变株紫色红曲CSU-M630产生胞外色素的能力。
实施例3
大孔吸附树脂分离纯化红曲色素中洗脱液的优化。
(1)树脂选择：以食品级大孔吸附性树脂LX-300C(安蓝晓科技新材料股 份有限公司生产)作为吸附剂，其粒度(0.40-1.25mm)为97.20％，含水量为 51.26％，湿视密度为0.69g/mL，湿真密度为1.06g/mL，质量全交换容量为5.12 mmol/g，渗磨圆球率为98.25％；
(2)树脂处理：将大孔吸附树脂LX300C，先在甲醇中浸泡12h，用无菌 水冲洗，干燥称重；然后，将约30g的干燥树脂LX300C装入长300mm、直径 25mm的玻璃吸附剂填充柱中(床层体积BV约为80mL)；
(3)解析、洗脱液的选择：分别以无水乙醇、95％(v/v)乙醇水溶液、70％ (v/v)乙醇水溶液、纯水作为洗脱剂，结果见表1。由表1可知，LX300C树 脂对胞外红曲色价的吸附和解析能力，初始胞外色价浓度为90.02U/mL时，静 态吸附实验表明树脂LX300C的胞外色素吸附能力达到1056U/g干树脂；无水 乙醇，95％(v/v)乙醇水溶液，70％(v/v)乙醇水溶液、纯水进行洗脱后，再 吸附能力分别降低至650U/g、860U/g、946.53U/g、72.53U/g,解吸率分别为 76.85％、84.96％、85.75％、4.06％；其中70％(v/v)乙醇水溶液对树脂LX300C 的解吸率最高，再吸附能力最高，其次为95％(v/v)乙醇水溶液。然而，考虑到 95％(v/v)乙醇水溶液在工业生产中更易于回收，可降低成本，因此本发明优选 95％(v/v)乙醇水溶液作为最佳的洗脱剂。
表1树脂LX300C对红曲色素的吸附及不同洗脱液处理下的解吸(按400mL发酵液上柱计算)
Figure BDA0002381080270000071
实施例4
一种高效生产红曲霉菌胞外色素的方法，其包括如下步骤：
1)制备红曲霉菌孢子悬浮液：紫色红曲CSU-M630菌株用马铃薯葡萄糖培 养基在30℃条件下培养7天，之后用4层无菌医用纱布过滤发酵液，0.85％生理 盐水等体积洗涤两次，0.85％生理盐水调整至孢子数1.0×106个/mL，得红曲霉 菌孢子悬浮液，备用；
其中，紫色红曲CSU-M630的其分类命名为紫色红曲霉菌，菌株号为 CSU-M630，保藏编号为CCTCC NO：M 2019596，保藏日期为2019年8月16 日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；
紫色红曲CSU-M630采用如下方法获得：将亲本菌株LQ-6(保藏编号为 CCTCC NO：M2018600，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心)利用常压室 温等离子体诱变系统进行诱变，诱变条件为：产生等离子体的载气为99.999％的 高纯氦气，气量为10.00SLM，入射功率120W，工作距离2mm，处理时间为 150s，得诱变后的菌液；将诱变后的菌液均匀涂布于PDA平板中，于30℃中避 光倒置培养7d，淘汰菌落明显偏小、生长速度慢、菌丝稀薄的菌落，筛选出菌 落形态与原菌株有明显差异、生长较快或特别红的单菌落；之后将筛选出的单菌落接种至PDA平板培养基中，并对应编号，于30℃避光倒置培养7d，得到培 养好的突变株；然后将获得的突变株接种至PDB培养基中，于30℃、150r/min 黑暗振荡培养7d，得突变株孢子悬液；将突变株孢子悬液接入发酵液中，于30℃、 150r/min黑暗振荡培养7d后测定红曲胞外色素，筛选出红曲胞外色素产量最大 的菌株，即得紫色红曲CSU-M630菌株；
2)包埋固定化：将红曲霉菌孢子悬浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻 酸钠溶液以质量比1:9g/g的比例混合均匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气泡消 失后逐滴滴入至已灭菌的质量浓度为8％的氯化钙溶液中，制成直径为2～3mm 的固定化颗粒，之后继续让固定化颗粒在氯化钙溶液中于4℃条件下浸泡4h， 然后滤出固定化颗粒，用生理盐水洗三次，之后将固定化颗粒浸泡在生理盐水中 于4℃保存备用；
3)多批次连续发酵：按照接种量为10％的孢子悬浮液制备成固定化颗粒接 种，进行发酵罐分批发酵；
4)分离纯化：采用分离耦合工艺，具体步骤如下：请参阅图4，在第一个 循环发酵进行72h后，将发酵罐中的含有色素的发酵液泵入装有大孔吸附树脂 LX300C的分离柱中进行色素的吸附(图4，a柱)；大孔吸附树脂LX300C吸附 饱色素和后转入色素洗脱和树脂再生程序(附图4，b柱)，并使用新的分离柱(附 图4，d柱)吸附色素；将再生后的大孔吸附树脂LX300C使用纯水洗去乙醇溶 液，用于色素的再吸附；将经大孔吸附树脂LX300C吸附掉色素后的发酵液重新 泵入发酵罐中进行发酵；当发酵罐中的色价稳定后，排出发酵液，固定有红曲细 胞的海藻酸钙微球继续截留在发酵罐中，并重新注入新鲜的发酵液进行连续发酵；如此重复直至发酵罐中的固定化小球全部破裂，则整个发酵过程结束；洗脱下来 的色素溶液经乙醇回收和干燥程序后得到色素产品。
其中，大孔吸附树脂LX300C为食品级大孔吸附树脂，蓝晓科技新材料股份 有限公司生产，大孔吸附树脂LX300C的粒度0.40～1.25mm为97.20％，含水 量为51.26％，湿视密度为0.69g/mL，湿真密度为1.06g/mL，质量全交换容量 为5.12mmol/g，渗磨圆球率为98.25％；使用时，将大孔吸附树脂LX300C先 在甲醇中浸泡12h，用无菌水冲洗，干燥称重；然后，将约30g的干燥树脂LX300C 装入长300mm、直径25mm的玻璃吸附剂填充柱中(床层体积BV约为80mL)； 采用体积浓度为95％的乙醇水溶液作为洗脱剂，对色素进行洗脱和树脂再生。
Figure BDA0002381080270000101
Figure BDA0002381080270000111
序列表
<110> 中南林业科技大学
<120> 高产红曲色素的红曲霉菌株及利用其生产胞外色素的方法
<130> 2020
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 575
<212> DNA
<213> 紫色红曲 CSU-M630()
<400> 1
tggactgcat ctactgatcc gaggtcacct aaggaaaaaa aggttggaga gggcaaaggc 60
cccggcccga cctactgagc gggtgacaaa gccccatacg ctcgaggacc ggacgcggcg 120
ccgccactgc ctttcgggcc cgtccccgtt gcccggaggc gcaggggacg gcggcccaac 180
acacaagccg cgcttgaggg gcagtaatga cgctcggaca ggcatgcccc ccggaatacc 240
agggggcgca atgtgcgttc aaagattcga tgattcactg aattctgcaa ttcacattac 300
ttatcgcatt tcgctgcgtt cttcatcgat gccggaacca agagatccgt tgttgaaagt 360
tttaaccgat ttggtatgtt tactcagaca gcaatccttt tcaaagacag cgttcgagaa 420
gatgtctccg gcgggcccca gggggccgcg ccgaagcaac aggaggtaca ataatcacgg 480
gtgggaggtt gggtcccacg aaggggaccc gcactcggta atgatccttc cgcaggttca 540
cctacggaaa ccttgttacg atttttactt ccaac 575

Claims (10)

1.高产红曲色素的红曲霉菌株，其特征在于：其分类命名为紫色红曲霉菌，菌株号为CSU-M630，保藏编号为CCTCC NO：M 2019596，保藏日期为2019年8月1日，保藏单位为：中国典型培养物保藏中心。
2.如权利要求1所述的高产红曲色素的红曲霉菌株，其特征在于所述菌株采用如下方法获得：
将亲本菌株LQ-6CCTCC NO：M 2018600利用常压室温等离子体诱变系统进行诱变，诱变条件为：产生等离子体的载气为99.999％的高纯氦气，气量为10.00SLM，入射功率120W，工作距离2mm，处理时间为150s，得诱变后的菌液；之后从诱变后的菌液中筛选出红曲色素产量最大的诱变菌株，即得如权利要求1所述的高产红曲色素的红曲霉菌株。
3.如权利要求2所述的高产红曲色素的红曲霉菌株，其特征在于，所述诱变菌株的筛选方法如下：
1)将诱变后的菌液均匀涂布于PDA平板中，于30℃中避光倒置培养7d，淘汰菌落明显偏小、生长速度慢、菌丝稀薄的菌落，筛选出菌落形态与原菌株有明显差异、生长较快或特别红的单菌落；
2)将步骤1)筛选出的单菌落接种至PDA平板培养基中，并对应编号，于30℃避光倒置培养7d，得到培养好的突变株；
3)将步骤2)获得的突变株接种至PDB培养基中，于30℃、150r/min黑暗振荡培养7d，得突变株孢子悬液；将突变株孢子悬液接入发酵液中，于30℃、150r/min黑暗振荡培养7d后测定红曲胞外色素，筛选出产量最大的菌株。
4.一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于包括如下步骤：
1)制备红曲霉菌孢子悬浮液：将权利要求1所述的胞外色素红高产曲霉菌株制成浓度为1.0×106孢子/mL的红曲霉菌孢子悬浮液；
2)包埋固定化：将红曲霉菌孢子悬浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻酸钠溶液以质量比1:7～10g/g的比例混合均匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气泡消失后逐滴滴入至已灭菌的质量浓度为8％的氯化钙溶液中，制成直径为2～3mm的固定化颗粒，之后继续让固定化颗粒在氯化钙溶液中于2～8℃条件下浸泡2～6h，然后滤出固定化颗粒，用生理盐水洗三次，之后将固定化颗粒浸泡在生理盐水中于2～8℃保存备用；
3)多批次连续发酵：将包埋固定化后的红曲霉菌孢子悬浮液进行发酵罐分批发酵；
4)分离纯化：将发酵后的发酵液经过大孔吸附树脂将红曲色素分离纯化。
5.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(1)制备红曲霉菌孢子悬浮液具体为，将权利要求1所述的胞外色素红高产曲霉菌株用马铃薯葡萄糖培养基在30℃条件下培养7d，之后用4层无菌医用纱布过滤发酵液，0.85％生理盐水等体积洗涤两次，0.85％生理盐水调整至孢子数1.0×106个/mL。
6.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(2)包埋固定化具体为，将红曲霉菌孢子悬浮液与已灭菌的质量浓度为3％的海藻酸钠溶液以质量比1:9g/g的比例混合均匀制成海藻酸钠-孢子悬浮液，待气泡消失后逐滴滴入至已灭菌的质量浓度为8％的氯化钙溶液中，制成直径为2～3mm的固定化颗粒，之后继续让固定化颗粒在氯化钙溶液中于4℃条件下浸泡4h，然后滤出固定化颗粒，用生理盐水洗三次，之后将固定化颗粒浸泡在生理盐水中于4℃保存备用。
7.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(3)多批次连续发酵中，按照接种量为8％～12％的孢子悬浮液制备成固定化颗粒接种。
8.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(3)多批次连续发酵中，发酵罐分批发酵中发酵液培养基的配方如下：葡萄糖80g/L；酵母膏2.5g/L；麦芽浸膏2.5g/L；蛋白胨2.5g/L；CaCl2·2H2O 0.1g/L；MgSO4·7H2O 0.5g/L；FeSO4·7H2O 0.01g/L；MnSO4·7H2O 0.03g/L；KH2PO4 0.01g/L；ZnSO4·7H2O 80g/L。
9.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(4)分离纯化中，采用体积浓度为95％的乙醇水溶液作为洗脱剂。
10.如权利要求4所述的一种生产红曲霉菌胞外色素的方法，其特征在于，所述步骤(4)分离纯化中，大孔吸附树脂的粒度0.40～1.25mm为97.20％，含水量为51.26％，湿视密度为0.69g/mL，湿真密度为1.06g/mL，质量全交换容量为5.12mmol/g，渗磨圆球率为98.25％。
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