KR102197825B1

KR102197825B1 - 그라미시딘 s의 생산 및 정제방법

Info

Publication number: KR102197825B1
Application number: KR1020197034175A
Authority: KR
Inventors: 블라디미르 빅토로비치 네스트럭; 키릴 콘스탠티노비치 시로브
Original assignee: 조인트 스톡 컴퍼니 ＂발렌타 파머수티컬스＂; 바이오티카 에이.에스.
Priority date: 2016-06-01
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2021-01-05
Also published as: EP3467098A9; EP3660141A1; WO2017209651A1; CN109312298B; EP3467098A4; CN111172225A; KR102106479B1; EP3467098A1; RU2627182C1; CN109312298A; KR20190132560A; CN111172225B; KR20190007070A

Abstract

본 발명은 생명공학기술에 관한 것으로, 아네우리니바실러스 미굴라너스 (Aneurinibacillus migulanus )의 생산 균주(producing strain), VKPM B-10212를 이용하여 그라미시딘 S 활성 물질 생산에 사용될 수 있다. 수득된 돌연변이 균주는 그라미시딘 물질의 고수율 생산(high-yield production)을 가능하게 한다.

Description

그라미시딘 S의 생산 및 정제방법 {Method for producing and purification of gramicidin S}

본 발명은 생명공학기술에 관한 것으로, 생산 균주 아네우리니바실러스 미굴라너스 (Aneurinibacillus migulanus ), VKPM B-10212을 이용하여 그라미시딘 S(gramicidin S) 활성 물질 생산에 사용될 수 있다. 수득된 돌연변이 균주는 그라미시딘 물질의 고수율(high-yield) 생산을 가능하게 한다.

합성 배지(synthetic media) 상에서 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis ) 생산 균주를 액침 배양(submerged culturing)하는 단계를 포함하는 그라미시딘 S(gramicidin S)의 생산을 위한 방법이 알려져 있다 [V.V. Korshunov Physiology of metabolism of Bacillus brevis subsp. G.-B. in association with biosynthesis of gramicidin S.- Candidate's dissertation, 1962, Moscow, MSU, V.V. Korshunov, N.S. Egorov Synthetic medium for Bacillus brevis culturing and grammidin producing. Mikrobiologiia, 1962; 31: 3, 515-519, V.N. Shaposhnikov, I.L. Rabotnova, A.B. Silaev et. al. Method for producing crystalline gramicidin S. - Inventor's certificate No. 187243, 1963, M.B. Kupletskaya Effect of aeration on grammidin development and production by culture of Bacillus brevis var. G.-B. Mikrobiologiia, 1965; 34: 5, 905-909, G.G. Zharikova Natural variability of spore bacteria and biosynthesis of polypeptide antibiotics. - Doct. diss., 1972, Moscow, MSU, A.I. Berezovskaya, A.N. Vypiyach, N.S. Egorov et. al. Bacillus brevis strain 101 - gramicidin S-producing. - Inventor's certificate No. 686463, 1978, Method for submerged culturing Bacillus brevis strain 101 for producing gramicidin S, -RU 제2447143호, 11/24/2008].

바실러스 브레비스 (Bacillus brevis ) 균주 101[T.P.　Yudina Physiological and biochemical features of grammidin-producing Bacillus brevis subsp. G.-B. and variants thereof. - Cand. Diss., 2002, Moscow, MSU]을 배양하는 경우, 생성물의 합성을 위해 사용된 가장 생산적인 바실러스 브레비스 (Bacillus brevis ) 균주[T.P.　Udalova Features of Bacillus brevis var. G.-B growth and development associated with biosynthesis of gramicidin S. - Cand. Diss., 1979, Moscow, MSU]를 배양하는 단계를 포함하는 그라미시딘 S(gramicidin S)를 생산하는 주기적인 과정(periodic process)이 알려져 있으며, 이는 반응기(reactor) 내로 영양 배지의 단일 로딩(single loading)을 수행하고, 접종물을 씨딩하며(seeding), pH 6.0 이하에 도달될 때까지 27시간 동안 통기 및 교반시키며 배양함으로써 특성화된다.

본 발명의 목적은 상업적인 고수율로 그라미시딘을 생산하는 더욱 효율적인 방법을 고안하는 것이며 이 방법에서 사용될 수 있는 미생물을 제공하는 것이다. 상기 목적은 아네우리니바실러스 미굴라너스 ( Aneurinibacillus migulanus )의 신규한 균주, VKPM B-10212를 제공함으로써 달성된다.

일 양태에서, 본 발명은 아네우리니바실러스 미굴라너스 ( Aneurinibacillus migulanus) 박테리아 균주 VKPM B-10212에 관한 것이다.

바람직한 양태에서, 본 발명은 그라미시딘을 생산하는 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus ) 박테리아 균주 VKPM B-10212에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 그라미시딘 생산을 위한 아네우리니바실러스 미굴라너스 (Aneurinibacillus migulanus ) 박테리아 균주 VKPM B-10212의 용도에 관한 것이다.

배양체(culture)의 속명(generic name) 및 종명(specific name): 아네우리니바실러스 미굴라너스 ( Aneurinibacillus migulanus ).

수탁번호: VKPM B-10212.

방법: 상기 균주를 돌연변이로서 고안하였음.

배양체는 RNCIM FSUI "GosNIIGenetika" (모스코바)에 의해 동정되었고, 16S RNA 분석법을 이용한 균주 No. 101에 대한 동정 보고서(identification report)는 2009년 3월 16일 것이다. 기탁증(deposit certificate)이 첨부되어 있다. 기탁 일자: 2009/03/03.

균주의 배양적 특징 및 형태학적 특징: 4 내지 8 μm 길이, 0.6 내지 0.7 μm 너비의 간균(rod), 균주는 0.8 내지 1.0 μm의 타원형 립(oval rib)이 있는 포자를 생성한다. 이는 호기성이다. 이는 젤라틴을 유체화(fluidify)하지 않는다. 이것은 전분을 가수분해하지 않는다. 이는 아민과 암모늄 형태의 질소를 사용한다. 가우즈(Gauze)와 브라즈흐니코바(Brazhnikova)의 한천 성장 배지(agar growth medium) 상에서 40-48 시간 동안 40±1 °C의 온도에서 배양한 경우, 이는 명확한 분화구 모양(crateriform) 또는 점 같은(pointlike) 중심이 있는 둥근 형태의 콜로니-한천 표면 위에 돌출된-를 형성한다. 콜로니는 베이지 색상의(beige color), 불투명하며 페이스트상 점조도(pasty consistency)를 갖는다. 이들은 한천 표면으로부터 접종 루프(inoculation loop)를 이용하여 용이하게 제거될 수 있다. 콜로니의 형태와 크기는 배지 조성, 씨딩 밀도(seeding density), 및 다른 요인들에 따라 매우 다양하다. 배양 과정동안, 이를 별개의 형태(morphology) 및 감소된 항생물질 생산을 갖는 이형으로 구분할 수 있다.

균주의 적용분야: 항생물질의 상업적 생산.

균주에 의해 합성되는 생성물: 그라미시딘 S 하이드로클로라이드 (gramicidin S hydrochloride) (결정).

교반 플라스크 내, 액체 “루틴 래버러토리(Routine Laboratory)” 배지에서 72시간 동안 배양되는 경우, 균주 활성 (생산성), 다르게는 생산능 (production performance)은 0.2±0.02 g_{그라미시딘} _S /g_{바이오매스(biomass)}에 대응하는 2±0.3 g/L 그라미시딘 S를 생산한다. 최적의 조건하에 발효조(fermenter)에서 성장되는 경우, 그라미시딘 S의 특정 생산은 최고 0.4 g_{그라미시딘} _S /g_{바이오매스} 일 수 있다. 2009/01/27 일자의 한천 배지상의 활성 상태에서(active state) 유지된 균주의 평균 생산성은 2,073 g/L 그라미시딘 S였고; 관련 불순물 함량(impurity content)은 15.3%였다.

균주 활성 결정을 위한 방법은 다음의 기법을 포함한다: 에틸 알코올을 이용해 배양액으로부터 그라미시딘 S 추출한 다음, 이어서 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography) 기법에 의한 그라미시딘 S 농도의 결정.

균주의 장기간 저장을 위한 방법, 조건 및 배지 조성: 기장(millet)에 포자를 저장, 영양 세포 (vegetative cell)와 포자를 동결 건조된 상태 (10 내지 20% 밀크(milk)와)로 저장.

균주 연장을 위한 방법, 조건 및 배지 조성: 가우즈(Gauze)와 브라즈흐니코바(Brazhnikova)의 한천 배지 [아민 질소, 1% 펩톤, 0.5% NaCl, 3% 한천-한천, pH 7.0를 기준으로, 50 vol. % 또는 28 mg%의 효모수(yeast water)]상에서 48-72 시간동안 40 °C에서 성장시킴. 오비탈 교반기(orbital shaker) (회전 속도 220 rpm, 1 m 진폭)위의 0.75 L 교반 플라스크 (0.1 L의 배지를 갖는)내 액체 반-합성 (liquid semi-synthetic) "루틴 래버러토리” 배지[배지의 1리터 당: 20 mL의 증류된 글리세롤(distilled glycerol), 8 mL의 식품 등급(food grade) 젖산 40%, 9.9 g의 K₂HPO₄, 5 g의 NaCl, 0.2 g의 MgSO₄·7H₂O, 8.12 g의 암모늄 옥살레이트(ammonium oxalate), 최고 5 mg%의 효모 자가 분해물(yeast autolysate)]상에서, 40 °C에서 48-72 동안 배양시킴.

최적 조건 및 발효 배지 조성: "발효 루틴(Fermentation Routine)" 배지 [30 mL의 글리세롤, 24.6 mL의 젖산 40%, 2 g의 K₂HPO₄, 5 g의 NaCl; 0.2 g MgSO₄·7H₂O, 12 g의 암모니아 옥살레이트, 최고 10 mg%의 효모 자가 분해물, 최고 20 mg%의 카제인 가수분해물(casein hydrolyzate), 2 mL의 라프롤(Laprol), 살균 후 7.02와 7.2 사이의 pH]. 통기는 시간 당 1.25 m³ O₂/배지의 m³이 될 것이고; 압력은 0.5 ATMG가 될 것이며; 교반 강도(stirring intensity)는 달성된 바이오매스 (0.035 내지 0.045

)에 따라, 발효의 시작에서 0.2-0.3

내지 발효의 종료에서 0.4-1.0

의 산소 물질 전달(oxygen mass transfer)을 제공해야 한다. 케모스타트(chemostat)는 pH 6.4 내지 7.2에 있을 것이다. 배양은 발효 방법에 따라서 16 내지 48 시간 동안 될 것이다. 균주의 DNA는 HindIII 제한 자리(restriction site)를 포함한다.

균주는 동물 병원성(zoopathogenic), 식물병원성(phytopathogenic)이지 않다.

도 1은 검사 균주(test strain)내 101 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 제한 분석(restriction analysis)을 도시한다.
1. HindIII 제한 효소로 처리된 검사 균주 101의 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편.
2. 마커 1 kb DNA 래더 (위에서 밑으로, 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3500, 3000, 2500, 2000, 1500, 1000, 750, 500, 250 bp).
3. HindIII 제한 효소로 처리되지 않은 검사 균주 101의 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편.

이하, 실시예를 참조로 하여 본 발명을 설명한다.

16S RNA 검정을 이용한 균주 101 종 동정(identification to species)

작업 단계

I. 단일 콜로니까지 배양물을 스크리닝하고 16S RNA 검정을 위한 바이오매스를 수득하는 단계

П. DNA를 분리하는 단계

III. PCR 프라이머 및 조건(regimen)을 선택하는 단계

16S rDNA 생성을 위한 보존적 프라이머 (Conservative primer):

8f - aga gtt tga tcc tgg ctc ag

926r - ccg tca att cct ttr agt tt

1492r - ggt tac cct tgt tac gac tt

반응 조건:

1. 95 °С에서 3분.

2. 35 사이클

95 °С에서 30초.

57 °С에서 30초.

72 °С에서 1분 30초.

3. 72 °С에서 5분.

IV. 16S rDNA 시퀀싱, 서열 비교 및 친족 트리(Kinship Tree) 제작

자동 시퀀서 AE3000에서 시퀀싱을 수행한다.

서열 분석을 위해, 전문화된 계통발생학적 컴퓨터 프로그램(phylogenetic computer program)을 사용한다.

결과 재현의 안정성. PCR 반응을 적어도 3번의 반복 실험(replicate)에서 수행한다.

시료 PCR 전기 영동에 대한 조건.

1.0% 아가로오스 젤, 5 V/cm의 전기장(electric field)에서 전기 영동.

V. 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 제한 분석(Restriction analysis)

a) 16S rDNA 가변 영역의 시퀀싱.

16S rDNA 가변 영역(variable region)의 시퀀싱은 균주 101에 대해 하기의 조립된 뉴클레오티드 서열(assembled nucleotide sequence)을 제공하였다:

atgaaggttttcgatcgtaaagttctgttgttagggaagaaccgccggggatgacctccc

cggtctgacggttncctaaacgagaaagcccccggctaatctacggtgcccagcagccgc

ggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcgg

cttcttaagtcaggtgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggccacttgaaactggga

agcttgagtgcaggagaggagagcggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatg

tggaggaacacccgtggcgaaggcggctctctggcctgtaactgacgctgaggcgcgaaa

gcgtggggagcgaacaggattagatacccctggtagtccacgccgtaaacgttgagtgct

aggtgttggggactccaatcctcagtgctcgcagctaacgcaat

aagcactccgcctggg

b) 시퀀싱 결과의 분석 및 친족 트리 제작

GenBank 및 RDP-II 데이터 베이스에 대한 1차적인 스크리닝은 검사 균주가 하기의 계통 그룹(systematic group)에 속하는 것을 나타냈다: 박테리아(Bacteria); 후벽균문(Firmicutes); 간균목(Bacillales); 페니바실러스과(Paenibacillaceae); 아네우리니바실러스 군(Aneurinibacillus group); 아네우리니바실러스(Aneurinibacillus), 상동성은 종(species) 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus) 및 아네우리니바실러스 아네우리니리티커스 (Aneurinibacillus aneurinilyticus)와 98%이다.

서열을 GenBank 데이터베이스로부터 입수할 수 있는 박테리아의 가장 관련된 종으로부터 대응하는 서열과 정렬하였다.

미생물 사이의 친족(kinship)을 결정하는 것을 제공하고 계통수(phylogenetic tree)를 제작하는 리보소말 데이터베이스 프로젝트 II (Ribosomal Database Project II, RDB II)의 웹사이트에 있는 컴퓨터 프로그램으로 처리된 서열 결과를 그래프로 (graphically) 나타낸다.

16S rRNA RDP II 데이터베이스에 대한 추가의 분석은 동종의 박테리아와 상동성 (homology)를 나타냈으며, 가장 관련된 종은 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus)와 아네우리니바실러스 아네우리니리티커스(Aneurinibacillus aneurinilyticus)이다.

분석 데이터에 기초하여, 동형 균주(homologous strain)가 있는 계통수를 제작하였다 (도 2).

특정 유형에 대한 미생물의 관련성 기준(relevancy criterion)은 적어도 97%의 상동성이다.

이 기준을 이용하여, 검사 균주는 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus) 또는 아네우리니바실러스 아네우리니리티커스(Aneurinibacillus aneurinilyticus) 종으로 속할 수 있다.

더욱 정확한 동정을 위해, 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 제한 분석을 사용하였다.

아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus)에서 이 DNA 단편은 HindIII 제한 자리를 포함하는 것으로 보고되는 반면, 아네우리니바실러스 아네우리니리티커스(Aneurinibacillus aneurinilyticus)는 이 제한 자리를 포함하지 않는다.

제한 분석을 검사 균주 101에서 16S RNA 유전자를 암호화하는 DNA 단편에 대해 수행하였다. 분석 결과를 도 1에 나타낸다.

HindIII 제한효소로 DNA 단편 처리 후, 620 bp와 870 bp 단편의 존재는 HindIII 자리가 검사 균주 101로부터의 DNA 단편에 포함되는 것을 나타낸다. 이 기준은 검사 균주 101을 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus) 종으로 지칭하는 것을 허용한다.

그라미시딘 S(gramicidin S)를 생산하는 방법

그라미시딘 S를 발효 기법을 이용하여 생산한다. 방법은 다음의 4개의 단계로 구성된다: 연구실에서, 생산 균주로서, 기탁기관 VKPM에 기탁된 기탁번호 B-10212인 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus) 균주를 제공하는 단계, 접종물(inoculum)을 제조하는 단계, 연구실 발효조에서 상기 접종물을 배양하는 단계, 주 발효조(main fermenter)에서 그라미시딘 S(gramicidin S)의 생합성을 제공하는 단계.

발효의 주요 매개변수를 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus)의 생산균주, VKPM B-10212의 형태와 안정성에 기초하여 선택하였다. 배양기내, 한천 배지상에서 배양하는 생산 균주에 대한 시간은 48 내지 120 시간에 이르며, 페트리 디쉬(Petri dish) 상에서 배양에 비하면, 더 큰 부피의 접종물을 허용한다. 박테리아 현탁액을 -20 ℃와 -80 ℃ 사이의 온도에서 15%의 글리세롤 보존액(protective glycerol solution)에 저장한다.

접종물의 예비 제조(Preliminary preparation)를 연구실 발효조에서 한천 배지 상에서 다른 미생물의 부재하에 수행한다.

이어서 접종물을 구연산 나트륨(sodium citrate), 염화 암모늄(ammonium chloride), 인산 이수소 칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 1:1 비율의 D-젖산과 L-젖산, 효모 추출물 분말(yeast extract powder), 카제인 분말(casein powder), 소포제(defoaming agent) 스트룩톨(Struktol) J 647로 이루어진 발효 배지 (fermentation medium) 1 내지 2.5% by volume의 다음 발효조로 옮긴다. 발효 과정에 대한 최적의 매개변수는 10 내지 20에 이르는 광학 밀도(optical density), pH 5.5 내지 7.5, 다른 미생물이 부재였다. 발효 과정은 48 내지 120 시간이 걸린다.

다음 생산 단계는 주 발효조에서 접종물을 발효하는 것을 수반한다. 접종물 부피는 구연산 나트륨(sodium citrate), 염화 암모늄(ammonium chloride), 인산 이수소 칼륨(potassium dihydrogen phosphate), 1:1 비율의 D-젖산과 L-젖산, 효모 추출물 분말(yeast extract powder), 카제인 분말(casein powder), 소포제(defoaming agent) 스트룩톨(Struktol) J 647로 이루어진 발효 배지의 8 내지 17%이다. 6.5 내지 7.0에 이르는 최적의 pH 값을 암모니아 용액을 첨가함으로써 제어한다. 최적의 양분 농도(nutrient concentration)를 글리세롤, 황산 암모늄(ammonium sulfate) 및 옥수수전분 용액(cornstarch solution)을 추가함으로써 유지한다. 발효 과정은 48 내지 120 시간이 걸린다.

생산된 바이오매스를 세라믹 필터 유닛으로 한외 여과 방법을 이용하여 여과하고, 탈이온수(deionized water)로 바이오매스를 세척하여 바이오매스로부터 불순물을 제거한다. 농축된 바이오매스를 180℃의 분무 건조기(spray dryer)에서 건조한다. 건조된 바이오매스를 40℃의 아세톤으로 세척하여 유색의 불순물(colored impurity)을 제거한다. 아세톤은 질소로 퍼징(purging)하여 제거하고, 이어서 한번 더 아세톤을 이용해 세척(rinsing)하고 45 ℃에서 진공하에 건조시킨다.

또한, 그라미시딘 S를 에탄올로 추출하고, 희석된 염산 (HCl:ethanol = 1:2)으로 pH를 3.0-4.0로 조정한다. 추출을 반복적으로 수행하여, 가압된 질소(pressurized nitrogen)로 추출물을 제거한다. 에탄올 분리 후, 바이오매스를 약 47 °C에서 진공하에 건조한다.

건조된 바이오매스를 물에 용해하고 활성탄(activated carbon)으로 탈색한 뒤, 압력 여과기(filter press)상에서 여과, 에탄올로 세척하여 탄소 상에서 흡착(sorption)을 통해 생산물 손실(product loss)을 감소시킨다.

수득된 추출물을 결정화기(crystallizer)로 옮겨서, 탈이온수로 희석하고, 농축된 염화 나트륨 용액을 추가하여 55 내지 65 °C의 온도로 가열한다. 청징(clarification) 후, 용액을 5 °C를 초과하지 않는 온도로 냉각시킨다. 수득된 결정을 원심분리기에서 분리하고 최대 65 °C의 온도에서 진공하에 건조하며, 추가로 핀밀(pin milling)하고, 400 및 200 μm 메쉬 스크린(mesh screen)을 통해 체로 거르고 폴리에틸렌 주머니(polyethylene bag)로 포장하여 알루미늄 용기에 둔다.

러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘 (VKPM)

B-10212

20090303

SEQUENCE LISTING <110> JOINT STOCK COMPANY "VALENTA PHARMACEUTICALS" <120> ANEURINIBACILLUS MIGULANUS STRAIN AND USE THEREOF <130> PCT/RU2017/000326 <160> 1 <210> 1 <211> 480 <212> rDNA <213> Aneurinibacillus migulanus, strain VKPMB-10212 <400> 1 atgaaggttt tcgatcgtaa agttctgttg ttagggaaga accgccgggg atgacctccc 60 cggtctgacg gttncctaaa cgagaaagcc cccggctaat ctacggtgcc cagcagccgc 120 ggtaatacgt agggggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 180 cttcttaagt caggtgtgaa agcccacggc tcaaccgtgg agggccactt gaaactggga 240 agcttgagtg caggagagga gagcggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 300 tggaggaaca cccgtggcga aggcggctct ctggcctgta actgacgctg aggcgcgaaa 360 gcgtggggag cgaacaggat tagatacccc tggtagtcca cgccgtaaac gttgagtgct 420 aggtgttggg gactccaatc ctcagtgctc gcagctaacg caataagcac tccgcctggg 480

Claims

발효기법을 이용하여 그라미시딘 S(gramicidin S)를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 4개의 단계로 이루어진 것인, 방법:
- 기탁기관 VKPM에 기탁된 기탁번호 B-10212인 아네우리니바실러스 미굴라너스(Aneurinibacillus migulanus) 균주를 생산 균주로서 연구실에서 제공하는 단계;
- 접종물(inoculum)을 제조하는 단계;
- 상기 접종물을 연구실 발효조(laboratory fermenter)에서 배양시키는 단계; 및
- 주 발효조(main fermenter)에서 그라미시딘 S의 생합성을 제공하는 단계.
제1항에 있어서,
상기 기탁기관 VKPM에 기탁된 기탁번호 B-10212인 아네우리니바실러스 미굴라너스 균주를 생산 균주로 연구실에서 제공하는 단계는 박테리아 현탁액을 15%의 글리세롤 보존액(protective glycerol solution)에 -20 ℃ 내지 -80 ℃의 온도에서 저장하는 것을 포함하는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 접종물을 제조하는 단계는 상기 생산 균주를 배양기 내의 한천 배지상에서 48 내지 120 시간 동안 배양시키는 것을 포함하는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 접종물을 연구실 발효조에서 배양시키는 단계는 구연산 나트륨(sodium citrate), 염화 암모늄(ammonium chloride), 인산 이수소 칼륨(potassium dihydrogen phosphate), D-젖산과 L-젖산, 효모 추출물 분말(yeast extract powder), 카제인 분말(casein powder), 및 소포제(defoaming agent)로 이루어진 발효 배지 (fermentation medium)에서 수행되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제4항에 있어서,
발효 공정은 48시간 내지 120시간이 소요되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제4항에 있어서,
배양된 접종물의 양은 상기 발효 배지의 1 내지 2.5 부피%인 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 발효 배지 중 D-젖산과 L-젖산의 비율은 1:1인 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제4항에 있어서,
발효 공정에 대해 하기 파라미터가 이용되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법:
10 내지 20의 광학 밀도(optical density); 및
5.5 내지 7.5의 pH.
제1항에 있어서,
상기 주 발효조에서 그라미시딘 S의 생합성은 구연산 나트륨(sodium citrate), 염화 암모늄(ammonium chloride), 인산 이수소 칼륨(potassium dihydrogen phosphate), D-젖산과 L-젖산, 효모 추출물 분말(yeast extract powder), 카제인 분말(casein powder), 및 소포제(defoaming agent)로 이루어진 발효 배지에서 수행되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 접종물의 부피는 상기 발효 배지의 양의 8 내지 17%인 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 발효 배지 중 D-젖산과 L-젖산의 비율은 1:1인 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
상기 발효 배지의 최적의 pH 값은 6.5 내지 7.0의 범위내에 있는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 발효 배지의 최적의 pH 값은 암모니아 용액을 첨가함으로써 제어되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
최적의 양분 농도는 글리세롤, 황산 암모늄(ammonium sulfate) 및 옥수수전분 용액(cornstarch solution)을 추가함으로써 유지되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
제9항에 있어서,
발효 공정은 48시간 내지 120시간이 소요되는 것인, 그라미시딘 S를 생산하는 방법.
그라미시딘 S를 정제하는 방법으로서, 기탁기관 VKPM에 기탁된 기탁번호 B-10212인 아네우리니바실러스 미굴라너스 균주의 바이오매스(biomass)를 세라믹 필터 유닛(ceramic filter unit)으로 한외 여과법(ultrafiltration method)을 이용하여 여과하고, 상기 바이오매스를 탈이온수(deionized water)로 세척하여 상기 바이오매스로부터 불순물을 제거한 다음, 농축된 바이오매스를 분무 건조기(spray dryer)에서 건조시키고, 건조된 바이오매스를 아세톤으로 세척하여 유색의 불순물(colored impurity)을 제거하고, 상기 아세톤은 질소로 퍼징함으로써(purging) 제거시키며, 1회 더 아세톤으로 세척한 다음, 진공하에서 건조시키고;
이어서, 그라미시딘 S를 에탄올로 추출하고, pH를 희석된 염산으로 3.0-4.0으로 조정하며, 추출을 반복적으로 수행하고, 추출물을 가압된 질소(pressurized nitrogen)로 제거하며, 에탄올 분리(ethanol separation) 후에 상기 바이오매스를 진공하에서 건조시키고;
건조된 바이오매스를 수중에 용해시키고 활성탄(activated carbon)으로 탈색시킨 후에, 압력 여과기(filter press)상에서 여과하고, 에탄올로 세척하며;
수득된 추출물을 결정화기(crystallizer)로 옮겨, 탈이온수로 희석시키고, 농축된 염화 나트륨 용액을 추가하며, 55 내지 65 ℃의 온도로 가열시키고;
청징(clarification) 후, 용액을 5 ℃ 이하의 온도로 냉각시키고, 수득된 결정을 원심분리기에서 분리시키며, 최대 65 ℃의 온도에서 진공하에 건조시키고, 핀밀(pin milling) 및 체질(sieving)하는 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 농축된 바이오매스는 180℃의 분무 건조기에서 건조되는 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
제16항에 있어서,
아세톤으로 세척하여 유색의 불순물(colored impurity)을 제거하는 것은 40℃에서 수행되는 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 농축된 바이오매스는 여과 후에 진공하 45℃에서 건조되는 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 바이오매스는 추출 후에 진공하 47℃에서 건조되는 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
제16항에 있어서,
상기 수득된 결정이 체질되어 통과되는 메쉬 스크린(mesh screen)은 400 및 200㎛인 것인, 그라미시딘 S를 정제하는 방법.
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