SU675986A1 - Штамм SтарнуLососсUS SарRорнутIсUSн 1-продуцент уреазы - Google Patents

Description

1 Изобретение относитс  к микробиологической про1-ышленности, в частности к получению нового штамма, используемого дл  получени  фермент уреазы. В насто щее врем  дл  получени  , уреазы используют источники растительного происхождени , в основном сою. В качестве продуцентов уреазы описаны также микроорганизмы Proteu mo rg an i i И др-.- fl . Однако указанные микроорганизмы примен ют только в лабораторных услови х дл  научных целей. Наиболее близким по технической сущности к за вленному  вл етс  продуцент уреазы Вас i1I us pas teu г i i который используетс  на производстве дл  получени  коммерческого пре-парата фермента,достатком указанног штамма  вл етс  сравнительно продол жительный цикл его развити  (28 ч). Кроме того, штамм Bacillus pasteuri выращивают на среде, состо щей из дорогосто щих-компонейтов: полипептона и дрожжевого экстракта, что отражаетс  на стоимости полученного продукта. Биосинтез уреазы, наконец происходит только в присутствии субстрата, что вызывает необходимос вносить его в процессе выргицивани , тем самым усложн   технологию процесса культивировани J Цель изобретени  - поиск нового штамма - продуцента уреазы, отвечающего всем треб9вани м производства фермента уреазы при глубинном культивировании . В результате поиска штаммов продуцентов уреазы йй воздуха цеха мочевых пузырей Вильнюсского м со- комбината был вьщелен высокоактивный штамм Staphylococcus saprophyticus L-1, продуцирующий уреазу. Полученный новый штамм Staphylococcus saprophytiCUS L-1 обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками . Шаровидные бактерии, в стандартных жидких средах, образуютс  пары, тетраэдры, квадратные пакетики , иногда гроздь  клеток. Неподвижен . Величина клеток односуточной культуры на МП А 0,,5 мкм в диаметре . Клетки хорошо окрашиваютс  разбавлённьт основным фуксином и метиловым синим. Грамположительные, спор не образуют. На МПА после 24 ч инкубации в термостате при 37С образует колонии

0,5-2 мм в диаметре. После 48 ч инкубации иногда в центре колонии образует выпуклость зеленоватого оттенка . На МПА с добавлением глюкозы и мальтрзы после 48-72 ч инкубации колоний приобретают розовато-оранжевую окраску. Пигмент в среду не выдел етс  и ее не окрашивает. В м сопент .рннрм бульоне вначале образуетс  муть, котора  потом осаждаетс  на дно пробирки. Среда, становитс  прозрачной . На поверхности ломтиков картофел  не растет.

Оптимальна  температура роста 3037С . При 45°С растет слабо. При 50°С не растет. Факультативный анаэроб . Одинаково хорошо растет в стро-о анаэробных и строго аэробных услови х . Крахмал не гидролизирует. Молоко не пе.нтонизирует. Желатину не рЭзжйжае :. На среде с минеральным азотом не растет. Нитраты восстанавливает в нитриты. Усваивает мальтозу , глюкозу, фруктозу, глицерин. Сахарозу усваивает слабо. Не ,усваивает лактозу, арабинозу, ксилозу, сорбит, рамнозу, маннит, дульцит и инозит. Устойчив к лизоциму. Содержаниё ГЦ-пар в ДНК колеблетс  в пределах 30,5-35 мол.%. Не патогенен.

При смешанном засеве полностью подавл ет рост Proteus vulgar s, Bacillus polymy.xa, Bacillus circulans

Культура хранитс  в пробирках на агаризованной среде под вазелиновым ;маслом.

Сравнение уреазной активности Bacillus pasteurii и Staphy1ococcus saprophyticusL-1 проводили на препаратах уреазы грубой очистки. Активйб б Ё т5Гб и друГого штаммов оказ алась одинаковой и составл ла , 25 ед./мг препарата.

Штамм StaphyiOCOCCUS saprophyticus L-1 отличаетс  коротким циклом развити . Выращивание длитс  18 ч. Среда , состо ща  из дорогосто щих :.: йоМпонвнТОв - полйпентона и дрожжевого экстракта, заменена средой дешевого состава. Йова  среда содержит минеральные соли, кукурузный экстракт и ферментативный гидролизат дрожжей. Биосинтезфермента происходит в отсутствии субстрата, что упрощает технологию культивировани  данного штгмма. .

П р и м е р 1. Лабораторные опыты дл:  получени  уреазы из бактерии Staphyl OCOCCUS заргорЪу tJjcjjj.L-1 .

Дл  поддержки и кyльтивиpoiaнй  штамма Staphy1ococcus saprophyt cus L-1 глубинным способом служили две среды: 1 и 2. Среда № 1 содержит, %: пентон 1, дрожжевой экстракт 0,7. Среда № 2 содержит, следующие компо- , нёнты, г/л: NaCl 5, 2,. NaNOj 2,5, ферментативный гидролизат 20, кукурузный экстракт 22 мл/л, раствор микроэлементов 1 мл/л. Соетав раствора микроэлементов, г/л:

Fe СЦ 3, MnCl/j- лQ 4,

Na,Mo04. 1, H.jB034, Ca Clj-6H,jO 2

Жидкую среду № 1 разли;вали по 100 мл в качалочные колбь объемом . 750 мл и стерилизовали при 120с 40 мин. Жидкую среду № 2 вначале автоклавировали при 20 мин. После охлаждени , с целью удалени  осадков, образующихс  из кукурузного экстракта и ферментативного гидрЬлизата дрожжей, филЬтровали через бумажный фильтр. Затем разливали в качалочные колбы объемом 750 мл по 100 мл питательной србдн и стерилизовали вторично при L20°C в течени 40 мин. Агаризованную среду № 2 стерилизовали при 120с 40 мин без последующей фильтрации.

Шта1им Staphylococcus saprophy ti cu L-1 поддерживали в пробирках со скошенной агаризованной средой № 2.

Дл  оживлени  штамм Staphylococcu saprohyticus L-1 пересевали на агаризованную среду № 2 в чашках Петри и инкубировали в термостате при 37С в течение 24 ч. Оживленную культуру засевали в качалочные колбы со средами,№ 1 и № 2 соответственно. Выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при в.течение 4ч. Таким образом подготовленную культуру использовали в качестве инокул та при глубинном культивировании. Посевной материал вносили в, качалочные колбы из расчета Ю бактериальных клеток на 1 мл питательной среды.

Штамм выращивали на круговой качалке (200 об/мин) при в течение 18 ч. После 4-18 чроста определ ли уреазйую активность ; в высушенных ацетоном клетках. Ферментативную активность определ ли колориметрическим методом. Количество аммиака : измер ли, использу  реактив Несслера . За единицу уреазной активности принимали количество фермента, катализирун цее освобождение 1А моль аммиака за 1 мин при 30°С. Было установлено , что максимальное накопление Уреазы происходило от 9 до 12 ч роста. Культивирование в течение более длительного времени приводило к уменьшению уреазной активности.

Средние данные уреазной активности приведены в табл. 1.

Таблица

Пример 2. Полупроизводственные опыты дл  получени  уреаэы из бактерии Staphy1ococcus saprophyticus L-1.

Поддерживание штамма и подготовку посе в ного мат ери ал а зводй ли та:КИМ же способом, как было описано в примере 1. Разница состо ла лишь в том, что посевной материал в колбах на качалке выращивали в течение 12 ч

Полупроизводственные испытани  проводили параллельно .на двух средах 1 и № 2. Состав сред указан в примере 1. Ферментеры емкостью 1,5 м , содержащие по 750 л соответствуквдей стерильной питательной среды , засевали посевным материалом из расчета 10 бактериальных клеток.на 1 мл среды. Выра.цивание проводили: при аэрации 8 (200 об/мин) при З7с в течение 18-20 ч. рН среды поддерживали в инте|)вале 6,8-7,2, использу  25%-ный раствор аммиачной воды или концентрированную фосфорную

кислоту. После 4-18 ч роста определ ли уреазйую активность в высушенных охлажденных ацетоном бактериальных клетках. В конце ферментации из 1 л культуральной среды цектрифуги роваТ й&м (14000 об/мин) бактериальную массу. Собранные и взвешенные клетки разрушали механически , использу  .стекл нные шарики диаметром 0,1-0,4 мм. В полученном грубом экстракте измер ли уреазиую

0 активность.и концентрацию белка по Лоури.

В результате полупроизводственных испытаний было установлено, что на

5 среде 1 максимальное накопление фермента происходило между 9-12 ч роста, на среде № 2 - между 9-15 ч роста. Дальнейшее культивирование не приводило к падению уреазной ак0 тивности.

Средние показатели ферментативной активности приведены в табл. 2.

Таблица 2

При полупроизводственных испытани х из 1 л культуральной жидкости получено 0,99 г сухого продукта с уреазной активностью 25 ед/мг препарата .

Стоимость уреазы, выделенной из соевых бобов, производимой Олайнским биохимическим заводом, за . 1000 единиц составл ет 3,75 руб. Стоимость уреазь, производимой фирмой Колбиохем за 1000 единиц составл ет . 2, 65 руб. валютой. Стоимос уреазы, производимой во ВНИИПЭ в 10 раз дешевле стоимости уреазы, призводимой зарубежными фирмами, и в 25-30 раз дешевле стоимости уреазы, получаемой из соевых бобов.

При полупроизводственных испытани х 1 кг грубо очищенной уреазы, полученной из Staphyloco ecus saprophyticus L-1, стоит 2500 руб. с рентабельностью продукции 18,3%. Стоимость 1000 единиц данной уреазы, производимой из Bacillus -pasteurli в Бельгии составл ет 1,0 руб. валютой . При производстве только во ВНИИПЭ 3,5 кг бактериальной уреазы экономи  денежных затрат составила бы около 10 тыс.руб. в год.

9,7 16,6

Claims (2)

1.Wong В.L., Shobe С.Р. Э7 Canadtan Journal of Microbiology, уГ20, № 4, pp. 623-630.

2.The 1975-1976 Al br ch-Eu rop.e Catalog/Hand book of Organic and Btpchemicals.The Sourse J.anssen PhartnacenticaN .Y. Al d r i ch-Eu rope . Belgium, tiqa N.Y.Aldrich-Europe. Belgium, 1974 (прототип). .