CN115851458A - 一种高产菌丝蛋白的镶片镰孢霉及应用 - Google Patents

一种高产菌丝蛋白的镶片镰孢霉及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物和食品技术领域，具体涉及到一株高产蛋白的菌株及其应用。本发明提供镶片镰孢霉突变菌株，尤其是保藏编号为CGMCC NO.23058的TB03菌株，相较于普通镶片镰孢霉，其蛋白含量、生长速度均明显提高，且能够利用农副产品作为碳源或氮源，且发酵蛋白中氨基酸种类齐全，含有人体必需氨基酸，具有广泛的应用价值。

Description

一种高产菌丝蛋白的镶片镰孢霉及应用
技术领域
本发明涉及食品技术领域，具体涉及到一株高产菌丝蛋白的镶片镰孢霉及其在生产菌丝蛋白中的应用。
背景技术
菌体蛋白是一种由丝状真菌经过生物工程产生的多细胞蛋白质。与其它蛋白来源相比，菌丝蛋白营养全面，生产原料易得，周期短，单位面积产率高，且具有不受环境和气候的影响、可连续生产、绿色环保等优势，市场前景广阔。菌丝蛋白产品含有丰富的蛋白质，一般在40%～80%，氨基酸的种类齐全，比例适当，含动物体所需的各种氨基酸，特别是赖氨酸含量较高，色氨酸、苏氨酸、异亮氨酸也较丰富，富含碳水化合物、功能性糖、核酸、维生素和无机盐等，还含有多种酶、激素、游离核苷酸等活性物质，能促进机体对营养物质的吸收利用。中国专利CN101011153A 中公布了一种多元蛋白质制品，是采用来源于植物的大豆分离蛋白和来源于动物的乳清蛋白为基本成分，加上来源于低等植物的藻类蛋白，来源于微生物的菌丝蛋白和单细胞蛋白制成的复合型多元蛋白质营养制品。中国专利CN109907301A公布了一种利用小麦、大麦、玉米、谷子、鹰嘴豆混合做成培养基，再接入液体菌种制备成五粮菌粉。但是利用微生物发酵高效直接产生的菌丝蛋白尚需进一步开发研究。
发明内容
针对现实的需求，本发明要解决的技术问题是如何获得能够高产蛋白的菌种和/或如何获得生长速度快的菌种和/或如何获得底物利用广泛的菌种和/或如何获得适用于菌丝蛋白生产的菌种。
本发明提供一种镶片镰孢霉（Fusarium venenatum）TB01的突变菌株，所述突变菌株中包括一个、二个或三个非同义突变，所述非同义突变选自镰孢霉的多聚腺苷酸结合蛋白存在S170F突变，和/或Tc5转座酶存在G153S，和/或纤维素合酶存在S298L突变；所述镶片镰孢霉TB01的保藏号为CGMCC NO.20740，其分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体地，所述突变菌株含有所述突变的纯合突变。
优选地，所述突变菌株是镶片镰孢霉TB03，其保藏号为CGMCC NO. 23058，分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2021年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明还提供所述的突变菌株在制备菌丝蛋白中的应用。
优选地，其通过发酵的方式发酵所述突变菌株以生产菌丝蛋白。
更优选地，农副产品原料进行发酵。更具体地，所述农副产品原料是大豆糖蜜和/或甘蔗糖蜜。
在一个具体实施方式中，采用葡萄糖发酵培养基进行发酵，所述葡萄糖发酵培养基为：每1000mL中含葡萄糖60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5；
在另一个实施方式中，发酵培养基为甘蔗糖蜜发酵培养基，其按每1000mL计，含甘蔗糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5；
另一个实施方式中，发酵培养基为大豆糖蜜发酵培养基，其按每1000mL计，含大豆糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5。
相较于普通镶片镰孢霉，其蛋白含量、生长速度均明显提高，且能够利用农副产品作为碳源或氮源，且发酵蛋白中氨基酸种类齐全，含有人体必需氨基酸，具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为镶片镰孢霉TB03的致死曲线。
图2为镶片镰孢霉TB03生物量。
生物材料保藏信息：
镶片镰孢霉TB01，其保藏编号为CGMCC NO.20740，分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2020年10月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
镶片镰孢霉TB03，其保藏编号为CGMCC NO.23058，分类命名为镰刀菌Fusarium venenatum，于2021年7月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例中培养基的配制方法如下：
产孢固体培养基：配制方法为（1000mL）：葡萄糖20 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
无机盐液体培养基：配制方法为（1000mL）：葡萄糖20 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
无机盐固体培养基：配制方法为（1000mL）：葡萄糖20 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，琼脂20 g，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
葡萄糖发酵培养基：配制方法为（1000mL）：葡萄糖60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
甘蔗糖蜜发酵培养基：配制方法为（1000mL）：甘蔗糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
大豆糖蜜发酵培养基：配制方法为（1000mL）：大豆糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46mg，硫酸铜1.85 mg，用水定容至1000mL，调节pH至5.5，121℃灭菌15min。
实施例1、镶片镰孢霉TB03的获得
本实施例中以镶片镰孢霉TB01（本实验室保藏，专利CN112226373A）为出发菌株，利用紫外诱变及传代培养制备镶片镰孢霉TB03：
菌株孢子悬液的制备
取斜面保存的镶片镰孢霉TB01划线接种于产孢培养基平板中，28℃恒温培养7-9d，待平板表面长满镶片镰孢霉菌体，用接种环轻轻刮取表面的孢子，加入生理盐水冲洗三次，吸取孢子悬液转移至锥形瓶中，加入少了玻璃珠，振荡10 min使孢子充分分散，脱脂棉过滤，得到镶片镰孢霉孢子悬浮液。通过血球计数法计算镶片镰孢霉孢子浓度，调整孢子悬桴液终浓度为1ｘ106CFU/ml。于4℃保存备用。
紫外诱变筛选
致死曲线：
紫外诱变处理 吸取配制好的镰孢霉孢子悬浮液（1ｘ106CFU/ml）200μL，并均匀涂布于无机盐固体平板待紫外诱变处理。诱变处理前先打开紫外灯（10W）预热20min，使其功率稳定。然后，将涂有孢子悬浮液的无机盐固体平板去盖并置于紫外灯下照射，照射距离为15 cm，分别处理0 s、30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s，并以未经紫外诱变处理的菌株作为对照。处理后立即盖上盖子置于30℃培养箱中恒温培养，培养48 h后将进行菌落计数测定。试验过程中各个处理和对照均重复３次。以未处理样品（C s）为对照，通过平板菌落计数法计算诱变致死率，绘制菌株致死率曲线（图1）。由曲线获知，在120s时，孢子的死亡率为90%以上，因此选择120 s为诱变时间。其计算公式如下：
致死率公式为：致死率=（U-T）/U*100%，U为未诱变菌落数（C s），T为诱变后菌落数。
诱变初筛：吸取配制好的镰孢霉孢子悬浮液（1ｘ106CFU/ml）200μL，并均匀涂布于无机盐固体平板待紫外诱变处理。诱变处理前先打开紫外灯（10W）预热20min，使其功率稳定。然后，将涂有孢子悬浮液的无机盐固体平板去盖并置于紫外灯下照射，照射距离为15cm，处理120 s。处理后立即盖上盖子置于30℃培养箱中恒温培养，培养48 h。挑选350个单克隆至无机盐液体培养基30 ml中，30℃培养48ｈ后用布氏漏斗过滤，用无菌水150 ml洗涤后105℃烘干3 h至恒重，挑选生物量超过2.7 g/L 的菌株，共13株。
复筛：将初筛获得13株菌株分别接种30 ml无机盐液体培养于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ后取2 mL接种与100 mL无机盐液体培养于500 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。发酵结束后，用布氏漏斗过滤，用无菌水500 ml洗涤后105℃烘干3 h至恒重。称取0.1000 g干菌丝体至20 mL无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。
筛选到生物量最大达到4.3±0.1 g/L，且蛋白含量最高58.2±0.2%的一株菌株。
传代培养驯化：从上述筛选到的那一株镰孢菌接种至30 ml无机盐液体培养基于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ作为种子液。接种2 mL种子液至30ml无机盐液体培养基于100 mL的三角瓶中，培养24 h后取2 mL转接至新鲜的30 mL无机盐液体培养基于100 mL的三角瓶中，培养24 h再次转接，共转接110代。将110代菌液稀释至1ｘ104倍后涂布与无机盐固体培养基中，培养48 h。挑选250个单克隆至无机盐液体培养基30 ml中，30℃培养48ｈ后用布氏漏斗过滤，用无菌水150 ml洗涤后105℃烘干3 h至恒重，挑选生物量超过4.5 g/L的菌株，共5株（分别编号为TB01-1（即TB03）、TB01-2、 TB01-3、TB01-4和TB01-5）。
传代复筛：将上述传代驯化获得5株菌接种至30 ml无机盐液体培养基于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ作为种子液。取5 mL的种子液接种至100ml无机盐液体培养基于500mL的三角瓶中，培养48 h。培养结束后用布氏漏斗过滤，用无菌水150 ml洗涤后105℃烘干3h至恒重，图2中可以看出TB03菌的生物量达到5.2±0.2g/L。
实施例2、镶片镰孢霉TB03蛋白氨基酸分析
将镶片镰孢霉TB01、TB03分别从平板中接种与30 ml无机盐液体培养于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。取5 mL接种与100 mL无机盐液体培养于500 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。发酵结束后用布氏漏斗过滤，收集菌体，105℃烘干3 h至恒重。
称取0.1g 干菌丝体至20 ml无菌水中，震荡摇匀后，利用超声仪超声使菌丝体完全混匀，形成均一溶液，利用总有机碳/总氮分析仪（N/C 2100S）测定总氮含量并计算菌丝体蛋白含量。TB01蛋白含量为46.3±0.3%，TB03蛋白含量为58.2±0.2%。
将获得TB01和TB03的菌丝蛋白进行LC-MS分析，结果如表1。与TB01相比，TB03提高菌丝体蛋白中必需氨基酸占比，提高范围从26.67%-70.53%，增加了菌丝体蛋白的营养价值。
表1菌丝蛋白氨基酸分析
Figure SMS_1
实施例3、镶片镰孢霉TB03葡萄糖发酵
将镶片镰孢霉TB01、TB03分别从平板中接种与30 ml无机盐液体培养于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。取5 mL接种与200 mL无机盐液体培养于500 mL的三角瓶中，30℃培养24ｈ。将100 mL的种子液接种到5 L发酵罐中，其中含有2.8 L的葡萄糖发酵培养基，用氨水调控pH值为5.5，转速300 rpm，通氧量1ppm，发酵时间72 h。发酵结束后将发酵液用布氏漏斗过滤，用15 L 蒸馏水洗涤后，105℃烘干3 h至恒重。TB01获得39.6±0.2 g，即13.2±0.2 g/L，TB03获得56.3±0.3 g干重，即18.8±0.4 g/L。
实施例4、镶片镰孢霉TB03大豆糖蜜发酵
将镶片镰孢霉TB01、TB03分别从平板中接种与30 ml无机盐液体培养于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。取5 mL接种与200 mL无机盐液体培养于500 mL的三角瓶中，30℃培养24ｈ。将100 mL的种子液接种到5 L发酵罐中，其中含有2.8 L的大豆糖蜜发酵培养基，用氨水调控pH值为5.5，转速300 rpm，通氧量1ppm，发酵时间72 h。发酵结束后将发酵液用布氏漏斗过滤，用15 L 蒸馏水洗涤后，105℃烘干3 h至恒重。TB01获得53.2±0.2 g，即17.7±0.2 g/L，TB03获得63.2±0.4g干重，即21.1±0.1 g/L。
实施例5、镶片镰孢霉TB03甘蔗糖蜜发酵
将镶片镰孢霉TB01、TB03分别从平板中接种与30 ml无机盐液体培养于100 mL的三角瓶中，30℃培养48ｈ。取5 mL接种与200 mL无机盐液体培养于500 mL的三角瓶中，30℃培养24ｈ。将100 mL的种子液接种到5 L发酵罐中，其中含有2.8 L的甘蔗蜜糖发酵培养基，用氨水调控pH值为5.5，转速300 rpm，通氧量1ppm，发酵时间72 h。发酵结束后将发酵液用布氏漏斗过滤，用15 L 蒸馏水洗涤后，105℃烘干3 h至恒重。TB01获得56.4±0.2 g，即18.8±0.2 g/L，TB03获得69.8±0.3 g干重，即23.3±0.6 g/L。
实施例6、镶片镰孢霉TB03遗传变异
通过对镶片镰孢霉TB03进行全基因组重测序，利用比较基因组学分析手段，挖掘与出发菌株TB01相比，镶片镰孢霉TB03中积累了非同义突变，其结果如表2所示。
菌株镶片镰孢霉TB01、TB03的基因组DNA和测序文库由诺禾致源（中国北京）公司提取和构建，采用Illumina HiseqXten-PE150高通量测序平台的150bp双端测序的方法测序。以Fusarium venenatumA3/5为参考基因组（RefSeq assembly accession: GCF_900007375.1），获得44.6百万Clean reads，测序深度为149x和98.1％的测序覆盖率。
表2.镶片镰孢霉TB03中积累的非同义突变Gene
Figure SMS_2
注：WT：野生型；MT：突变；Homo：纯合；Het：杂合。SIFT Score越小，说明该突变对蛋白结构和功能的影响越大。
根据DePristo等人报道的基因组分析流程，评价菌株中的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）突变和插入/缺失（insertion/deletion，InDels）突变（相关文献：DePristo MA,Banks E, Poplin R, et al. A framework forvariation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.Nat Genet.2011;43(5):491-498.）。然后，对发生在蛋白编码区的非同义突变利用SIFT进行突变对蛋白功能影响的预测分析（相关文献：Wagih O, Galardini M, Busby BP, MemonD, Typas A, Beltrao P. A resource of variant effect predictionsof singlenucleotide variants in model organisms. MolSyst Biol. 2018.14(12):e8430.）。
使用上述方法，通过基因组测序分析筛选出非同义突变，以镶片镰孢霉TB01和镶片镰孢霉TB03的基因组DNA为模板，进行PCR扩增突变DNA片段，并行测序验证，结果如表2所示。与镶片镰孢霉TB01相比，在镶片镰孢霉TB03中发现存在3个纯合突变，FVRRES_03271S170F、FVRRES_08256G153S、FVRRES_12735S298L。

Claims (10)

1.一种镶片镰孢霉（Fusarium venenatum）TB01的突变菌株，其特征在于，所述突变菌株中包括一个、二个或三个非同义突变，所述非同义突变选自镰孢霉的多聚腺苷酸结合蛋白存在S170F突变，和/或Tc5转座酶存在G153S，和/或纤维素合酶存在S298L突变；所述镶片镰孢霉TB01的保藏号为CGMCC NO.20740。
2.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于，所述突变菌株含有所述突变的纯合突变。
3.如权利要求1所述的突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是镶片镰孢霉TB03，其保藏号为CGMCC NO. 23058。
4.如权利要求1至3任一项所述的突变菌株在制备菌丝蛋白中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，其通过发酵的方式发酵所述突变菌株以生产菌丝蛋白。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，农副产品原料进行发酵。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述农副产品原料是大豆糖蜜和/或甘蔗糖蜜。
8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，采用葡萄糖发酵培养基进行发酵，所述葡萄糖发酵培养基为：每1000mL中含葡萄糖60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5。
9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基为甘蔗糖蜜发酵培养基，其按每1000mL计，含甘蔗糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5。
10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，发酵培养基为大豆糖蜜发酵培养基，其按每1000mL计，含大豆糖蜜60 g，磷酸二氢铵2.1 g，硫酸铵6.0 g，硫酸钾2.1 g，硫酸镁0.87 g，氯化铁3.64 mg，硫酸锌19.30 mg，硫酸锰15.46 mg，硫酸铜1.85 mg，调节pH至5.5。
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