CN115287280A - 一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法 - Google Patents

一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法，属于微生物紫外诱变技术领域。所述增强红曲霉紫外诱变效果的方法为：在紫外诱变前将红曲霉孢子悬液接种至含H2O2的液体培养基中培养，并筛选出色价/桔霉素比值前20%的菌株作为出发菌，再进行紫外诱变。经过试验对比，本发明采用过氧化氢诱变后，可以显著提高红曲霉正突变率、突变株得率，并且提高了紫外诱变后的红曲霉制备红曲米的色价/桔霉素比值，可以有助于快速获得色价/桔霉素高比值的红曲霉菌株，本发明所采用的先过氧化氢后紫外的诱变方法无需使用昂贵的设备，实验过程相对安全，且突变效率高，因此在基层科研单位的育种工作中具有极大的应用潜力。

Description

一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法
技术领域
本发明属于微生物紫外诱变技术领域，具体涉及一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法。
背景技术
红曲霉自古就被广泛应用在中国各行各业的产品中，拥有悠久的被安全食用的历史，作为当前唯一被允许用于生产天然可食用色素的微生物，在我国微生物资源中占据着重要的地位。红曲米是将红曲霉接种在籼米上进行固态发酵而成的红色米曲，是一种药食两用的食用添加剂，具有活血化瘀，健脾消食、降血脂、降血压等生理功效。红曲米被广泛应用于各类食品加工中，如红曲枣酒、红曲酸奶、红曲香肠等。从红曲米中制备而来的红曲色素则更为广泛地应用于食品的加工与生产，例如加入红曲色素生产的面包相比普通生产的面包味道更加清新，红曲馒头的色泽、弹性、韧性以及黏性相比普通馒头得到了有利改善。然而，红曲霉还会产生一种真菌毒素——桔霉素，它对人体肾脏具有致畸致癌的潜在危害，因此获得高产色素低产桔霉素的红曲霉菌株越来越受到研究人员的重视。
生物体暴露于紫外线照射下会形成不同类型的DNA损伤，因此，紫外线作为一种非电离辐射诱变剂，在诱变育种中发挥重要作用。在食品加工行业，过氧化氢可用于消毒、杀菌、漂白等。然而，作为一种较为安全、无残留且对环境友好的化学试剂，目前未有报道将过氧化氢用于诱变菌种的研究。本研究发现以过氧化氢诱变得到的突变株为出发菌株进行紫外诱变，可以显著增强紫红曲霉紫外诱变的效果。
发明内容
本发明为了解决紫外诱变获得的红曲霉正突变率、突变株得率低，紫外诱变的随机性大等问题，提出了一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法，具体增强红曲霉紫外诱变效果的方法为：在紫外诱变前将红曲霉孢子悬液接种至含H2O2的红曲霉液体培养基中培养，并筛选出色价/桔霉素比值前20%的菌株作为出发菌，再进行紫外诱变。
其中，所述含H2O2的红曲霉液体培养基中H2O2的终浓度为0.043~0.050%。
其中，所述培养温度为32~37℃。
其中，所述红曲霉孢子悬液的接种量为2~5%。
其中，所述红曲霉液体培养基的配方为，以质量体积比计：葡萄糖50~65g/L，蛋白胨20~25g/L，可溶性淀粉25~35g/L。
其中，所述紫外诱变是距离10~20w紫外灯20~40cm处磁力搅拌的作用下对红曲霉孢子悬液紫外照射60~300s。
其中，所述红曲霉孢子悬液浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL。
其中，所述H2O2的液体培养基中培养的时间为48~72h。
有益效果
过氧化氢作为一种强氧化剂，在食品工业中过氧化氢常被用于消毒、杀菌、漂白等，但目前为止国内外没有利用过氧化氢进行菌种诱变的报道。本发明首次发现，经过氧化氢诱变的紫红曲霉突变株对于紫外诱变的敏感性显著提高，可能是过氧化氢诱变所造成的DNA损伤部位与紫外线作用的DNA部位十分靠近，从而抑制了损伤部位的修复，造成DNA的结构发生显著改变，导致紫外诱变效果显著提升。此外，羟基自由基具有高度的反应活性和极强的氧化能力，是自然界中仅次于氟的氧化剂。本发明采用提高诱变温度的方法促使过氧化氢转化生成羟基自由基，显著提高了过氧化氢对红曲霉的诱变效果。传统的物理诱变剂有紫外线、超声波、微波、激光、离子束、常温等离子体等。与这些物理诱变方法相比，本发明所采用的先过氧化氢后紫外的诱变方法无需使用昂贵的设备，实验过程相对安全，且突变效率高，因此在基层科研单位的育种工作中具有极大的应用潜力。
附图说明：
图1：紫外照射时间对实施例1得到的过氧化氢诱变菌株H7正突变率、突变株得率的影响。
图:2：紫外照射时间对对比例1紫红曲霉X7正突变率、突变株得率的影响。
图3：紫外照射时间对对比例1紫红曲霉X7致死率的影响。
图4：过氧化氢浓度对对比例2紫红曲霉X7致死率的影响。
图5：过氧化氢诱变对对比例2紫红曲霉菌落形态的影响，其中，左图为经0.05%过氧化氢诱变的紫红曲霉，右图为未经过氧化氢诱变的对照紫红曲霉。
具体实施方式
下面结合具体实施例子进一步阐明本发明，应理解这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，在阅读了本发明之后，本领域的技术人员对本发明各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所规定的范围。
所有的实施例中根据国标GB 1886.19-2015的方法测量成品的色价。
所有的实施例中红曲米中红曲色素和桔霉素的测定的方法如下。
①红曲米发酵完成后将其置于60℃下烘干48 h，将烘干的红曲米用粉碎研磨机粉碎，并过60目筛，收集备用。
②称取粉碎后混合均匀的红曲米粉0.2 g，用100 mL 70%的乙醇溶液溶解并将其转入100 mL容量瓶中，定容至刻度线。置于60℃下恒温水浴1 h后取出冷却至室温，继续添加70%乙醇溶液至刻度线，摇匀，用滤纸过滤。以70%乙醇溶液做参照，在波长505 nm下，测定其试样的吸光度A。红曲色素提取液色价X（U/g）计算公式如下：
X=A×100/m×b
式中：A ——试样的吸光度；
m ——称取试样的质量，单位为克（g）;
b ——稀释倍数。
③称取粉碎混合均匀的红曲米粉2.0 g于50 mL离心管中，加入8 mL 70%的甲醇溶液溶解，涡旋振荡摇匀3 min后使用超声振荡30 min助溶，8000 r/min离心10 min后收集上清液，向沉淀中继续加入8 mL 70%甲醇后重复上述操作一次，最后将两次得到的上清液富集，置于60℃下干燥3 d。干燥完成后向离心管中加入20 mL pH为1.5的甲醇溶液进行复溶，溶解完成后搅拌均匀将其稀释600、700倍，在激发波长λex=330 nm，发射波长λem=485nm，狭缝宽度分别为Ex=10 nm,Em=5 nm的条件下使用荧光分光光度计测量其荧光值，将荧光值带入桔霉素标准曲线方程式y=1865.4x+2.0566（R2=0.999）中得出桔霉素含量。
过氧化氢诱变的致死率的计算方法如下：将菌株发酵液全部取出，加入到已烘干称重的50 mL 离心管中，在10000 r/min下离心10 min，菌体沉淀用无菌水清洗2-3遍至离心后的上清液呈无色状态，将含有菌体的离心管放入烘箱，60℃烘干至恒重，冷却至室温后称取其重量。菌体量=烘干后整体重量-空离心管重量，使用以下公式计算致死率。
致死率=（空白对照组菌体量-实验组菌体量）/空白对照组菌体量×100%。
紫外诱变后采用以下公式计算致死率、正突变率和突变株得率。
致死率=（空白对照组每毫升活菌数-实验组每毫升活菌数）/空白对照组每毫升活菌数×100%。
正突变率=实验组中颜色较深的菌落数/对照组中生长出的菌落数×100%；
突变株得率=实验组中所有颜色发生变化的菌落数/对照组中生长出的菌落数×100%。
实施例1
本实施例中，采用的菌株为紫红曲霉X7，紫红曲霉液体培养基（g/L）：葡萄糖60，蛋白胨20，可溶性淀粉30；紫红曲霉固体培养基（g/L）：葡萄糖60，蛋白胨20，可溶性淀粉30，琼脂18。
本实施例提供了一种增强紫红曲霉紫外诱变效果的方法，具体方法如下：
紫红曲霉单孢子悬液的制备：取菌龄7 d且产孢情况好的紫红曲霉X7平板，在超净工作台中向平板内加入5 mL加有0.5%吐温80的无菌生理盐水，使用灼烧灭菌冷却后的玻璃棒轻刮平板表面，对刮洗下的孢子悬液使用375目细胞筛过滤，对滤液进行计数，调整其浓度至（5.0 ± 0.5）×106个/mL后置于灭菌后的空锥形瓶中备用。
过氧化氢诱变：配制10 mL紫红曲霉液体培养基，高压蒸汽灭菌后分别加入过滤除菌的0.0048 mL的30% H2O2溶液，即H2O2终浓度为0.048%。将浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL的紫红曲霉孢子悬液以3%接种量即0.3 mL/瓶接入H2O2的液体培养基中，于35℃下振荡培养60h。
菌株的分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的过氧化氢诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32℃下培养5 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉。
发酵过氧化氢诱变后的紫红曲霉：分别将所有纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉接种至浸泡灭菌后的30g籼米中，接种量为2mL孢子含量为（4.0 ± 0.2）×106个/mL的紫红曲霉单孢子悬液。随后置于32℃的条件下发酵9d，得到发酵后的红曲米。其中，第1-2 d每隔24 h加2 mL无菌水，加水后在超净工作台中使用无菌玻璃棒进行翻曲搅匀，翻匀后置于32℃下继续培养，第3 d开始每隔24 h加4 mL无菌水。
选出最佳过氧化氢诱变后的紫红曲霉：按照红曲米中红曲色素和桔霉素的测定的方法测定色价和桔霉素，选出色价/桔霉素比值最高的菌株，本实施例中色价/桔霉素比值最高的菌株为H7，经过计算，色价/桔霉素的比值为61.87 ± 0.92。
纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉单孢子悬液的制备：将纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉置于紫红曲霉液体培养基中培养7 d，并制作紫红曲霉平板，在超净工作台中向平板内加入5 mL加有0.5%吐温80的无菌生理盐水，使用灼烧灭菌冷却后的玻璃棒轻刮平板表面，对刮洗下的孢子悬液使用375目细胞筛过滤，对滤液进行计数，调整其浓度至（6.5 ±0.2）×106个/mL后置于灭菌后的空锥形瓶中备用。
紫外诱变：将色价/桔霉素比值最高的菌株H7制备成浓度为（6.5 ± 0.2）×106个/mL单孢子悬液，分成5份于灭菌后的空锥形瓶中，每份3 mL，在220V，15w的紫外灯和磁力搅拌器分别预热20 min后，在超净工作台中距离紫外灯30 cm处磁力搅拌的作用下对其中4份单孢子悬液分别进行60 s、150 s、210 s、300 s的紫外线照射，其中未经紫外线照射处理的菌液即照射时间为0 s的菌液作为空白对照。在红光灯下取经过不同时长照射后的菌液0.5 mL使用4.5 mL无菌生理盐水依次连续10倍稀释，稀释10-2、10-3梯度后，取200 μL原液及10-2、10-3稀释度的孢子液用十字混匀法接种至红曲霉平板，每梯度处理设置三个平行对照，32℃下避光培养5 d。选取平板上的单菌落互不重叠的平板进行计数。每三组平行对照的菌落数取平均值，每毫升活菌数=菌落平均数×5×稀释倍数（个/mL）。
二次分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32℃下培养5 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到分离纯化后的紫红曲霉。
发酵：使用天平称取30 g籼米置于250 mL烧杯中，加入100 mL pH为3.5的水浸泡10 h，浸泡完成后使用纱布过滤，沥干定重至含水量为45%后用6层纱布和2层报纸封口，于121℃下灭菌20 min，灭菌后在工作台中趁热使用无菌玻璃棒翻拌使米粒分散开，待米粒冷却至室温后接种紫红曲霉单孢子悬液2 mL，第1-2 d每隔24 h加2 mL无菌水，加水后在超净工作台中使用无菌玻璃棒进行翻曲搅匀，翻匀后置于32℃下继续培养，第3 d开始每隔24 h加4 mL无菌水，共计发酵9 d，发酵完成后按照上述方法计算致死率、正突变率和突变株得率。
对比例1（不采用过氧化氢诱变筛选后的菌株）
紫红曲霉单孢子悬液的制备：取菌龄7 d且产孢情况好的紫红曲霉X7平板，在超净工作台中向平板内加入5 mL加有0.5%吐温80的无菌生理盐水，使用灼烧灭菌冷却后的玻璃棒轻刮平板表面，对刮洗下的孢子悬液使用375目细胞筛过滤，对滤液进行计数，调整其浓度至（6.5 ± 0.2）×106个/mL后置于灭菌后的空锥形瓶中备用。
紫外诱变：取上述15 mL浓度为（6.5 ± 0.2）×106个/mL紫红曲霉单孢子悬液，分成5份于灭菌后的空锥形瓶中，每份3 mL，在220V，15w的紫外灯和磁力搅拌器分别预热20min后，在超净工作台中距离紫外灯30 cm处磁力搅拌的作用下对其中4份单孢子悬液分别进行60 s、150 s、210 s、300 s的紫外线照射，其中未经紫外线照射处理的菌液即照射时间为0 s的菌液作为空白对照。在红光灯下取经过不同时长照射后的菌液0.5 mL使用4.5 mL无菌生理盐水依次连续10倍稀释，稀释10-2、10-3梯度后，取200 μL原液及10-2、10-3稀释度的孢子液用十字混匀法接种至红曲霉平板，每梯度处理设置三个平行对照，32℃下避光培养5d。选取平板上的单菌落互不重叠的平板进行计数。每三组平行对照的菌落数取平均值，每毫升活菌数=菌落平均数×5×稀释倍数（个/mL）。
二次分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32℃下培养5 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到分离纯化后的紫红曲霉。
发酵：使用天平称取30 g籼米置于250 mL烧杯中，加入100 mL pH为3.5的水浸泡10 h，浸泡完成后使用纱布过滤，沥干定重至含水量为45%后用6层纱布和2层报纸封口，于121℃下灭菌20 min，灭菌后在工作台中趁热使用无菌玻璃棒翻拌使米粒分散开，待米粒冷却至室温后接种紫红曲霉单孢子悬液2 mL，第1-2 d每隔24 h加2 mL无菌水，加水后在超净工作台中使用无菌玻璃棒进行翻曲搅匀，翻匀后置于32℃下继续培养，第3 d开始每隔24 h加4 mL无菌水，共计发酵9 d，发酵完成后按照上述方法计算致死率、正突变率和突变株得率。
实验结果分析
本实施例紫外诱变的正突变率和突变株得率的结果如图1所示，在150 s时，正突变率达到9.70%，而突变株得率达到16.90%，此正突变率结果相比于单一紫外诱变的正突变率4.68%得到显著提高，由此可以证明采用过氧化氢诱变能显著增强紫红曲霉紫外诱变的效果。
以过氧化氢诱变得到的最优突变株作为出发菌株进行紫外诱变，结果显示最优F2菌株色价/桔霉素比值达123.78 ± 4.19；未经诱变的空白对照组色价/桔霉素比值为31.39 ± 1.75，F2的色价/桔霉素比值相比于空白对照组提高了294.33%。大幅度提升了紫外诱变的效果。
对比例1测定的结果如图2，以正突变率和突变株得率为指标，对浓度为（6.5 ±0.2）×106个/mL紫红曲霉单孢子悬液进行不同时长的紫外照射，稀释涂布于紫红曲霉平板上，每个实验组设置3个平行，避光培养5 d后统计菌落数，取菌落数的平均值计算诱变致死率，并通过平板上生长出的菌落颜色差异计算正突变率和突变株得率，结果如图2所示，紫外照射150 s相比于其他照射时间可以显著提高正突变率与突变株得率，其中正突变率达到4.68%，突变株得率达到7.68%，此时的致死率为77.3%，图3为紫外照射时间对紫红曲霉X7致死率的影响，这与文献报道的紫红曲霉紫外诱变最高正突变率所对应的致死率基本一致。
对比例2
不同的过氧化氢浓度处理诱变紫红曲霉，并测定紫红曲霉的致死率实验。
过氧化氢浓度对紫红曲霉的影响：配制9份紫红曲霉液体培养基10 mL，高压蒸汽灭菌后分别加入过滤除菌的0 mL、0.001 mL、0.002 mL、0.003 mL、0.0035 mL、0.004 mL、0.0043 mL、0.0048 mL、0.005 mL的30% H2O2溶液，即H2O2终浓度依次为0%、0.01%、0.02%、0.03%、0.035%、0.04%、0.043%、0.048%、0.05%。每实验组设置三个平行对照，其中H2O2终浓度为0%的组别记为空白对照CK。将滤下的浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL的紫红曲霉孢子悬液以3%接种量即0.3 mL/瓶接入加有不同浓度H2O2的液体培养基中，于32℃下振荡培养，自24 h起每隔12 h观察紫红曲霉生长状态，将实验组与空白对照组进行菌落形态的比较，在菌体出现明显变化时将菌落形态发生明显变化的组别中的菌丝接种于正常培养基，继续培养相同时间观察其形态有无变化。
实验中发现，在紫红曲霉液体培养基中添加过氧化氢时，会抑制紫红曲霉的生长，导致紫红曲霉菌体量大大减少，菌液中仅有少量絮状菌丝，这可能是因为过氧化氢能对细胞产生毒害作用从而造成细胞的突变甚至死亡，因此，本研究尝试在紫红曲霉液体培养基中添加不同浓度过氧化氢以探究过氧化氢浓度对紫红曲霉致死率的影响。结果显示，随着过氧化氢浓度的升高，对紫红曲霉的致死率也在不断升高，在过氧化氢终浓度为0.043%时，致死率为77.27%，而在过氧化氢终浓度为0.048%与0.05%时，致死率分别为83.29%、83.27%，曲线图见图4。由此可见，过氧化氢处理对紫红曲霉的生长有害。所以，一般情况下，不会采用过氧化氢处理紫红曲霉。
如图5所示，与未经过氧化氢处理的对照紫红曲霉菌落相比，经0.05%过氧化氢处理的菌丝接入平板后所生成的紫红曲霉菌落形态有显著改变，菌落生长较紧密、气生菌丝较少、菌落呈灰白色，表明紫红曲霉可能发生了明显的突变。
遗传稳定性的测定
为检验紫外诱变、过氧化氢诱变以及先过氧化氢诱变再紫外诱变这3种诱变方法得到最优突变株的遗传稳定性，对这3株菌进行传代培养，在培养5代后使用突变株的孢子进行红曲米的发酵，以色价/桔霉素比值为指标，与初始菌株进行比较，结果如表1所示，连续传5代后这3株菌的色价/桔霉素比值与初始菌株的比值相比误差均小于10%，无显著差异，可见，这3种诱变方法得到的突变株遗传稳定性较好。
表1各最优突变株初代和第五代色价/桔霉素比值的比较。
突变株 初始菌株 第五代菌株
Z9 41.77<sup>a</sup> ± 0.61 41.82<sup>a</sup> ± 1.08
H7 61.87<sup>a</sup> ± 0.92 58.98<sup>a</sup> ± 3.07
F2 123.78<sup>a</sup> ± 4.19 116.79<sup>a</sup> ± 8.94
综上，先用过氧化氢诱变再用紫外辐射的诱变方式所获得的最高正突变率、突变株得率和突变株色价/桔霉素比值分别是单一紫外诱变的2.1、2.2和3.0倍，由此可见，过氧化氢诱变紫红曲霉显著提升了紫外诱变紫红曲霉的正突变率和突变效果，同时也几乎没有降低其遗传稳定性。
实施例2
本实施例中，采用的菌株为紫红曲霉X7，紫红曲霉液体培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨25，可溶性淀粉35；紫红曲霉固体培养基（g/L）：葡萄糖50，蛋白胨25，可溶性淀粉35，琼脂15。
本实施例提供了一种增强紫红曲霉紫外诱变效果的方法，具体方法如下：
1、紫红曲霉单孢子悬液的制备：从产孢情况好的紫红曲霉X7平板表面刮洗下紫红曲霉X7孢子，并使用350~400目细胞筛过滤并调整孢子浓度至（5.0 ± 0.5）×106个/mL后置于灭菌后的空锥形瓶中备用，得到紫红曲霉单孢子悬液。
、过氧化氢诱变：配制10 mL紫红曲霉液体培养基，高压蒸汽灭菌后分别加入过滤除菌的0.0043 mL的30% H2O2溶液，即H2O2终浓度为0.043%。将浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL的紫红曲霉孢子悬液以2%接种量即0.2 mL/瓶接入H2O2的液体培养基中，于32℃下振荡培养48~72h。
、菌株的分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的过氧化氢诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32±1℃下培养3~7 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉。
、选出过氧化氢诱变后的紫红曲霉：将得到纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉接种于籼米中并发酵制得红曲米，按照红曲米中红曲色素和桔霉素的测定的方法测定色价和桔霉素，选出色价/桔霉素比值前20%的菌株。
、纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉单孢子悬液的制备：将纯化的过氧化氢诱变后的紫红曲霉置于紫红曲霉液体培养基中培养5~9 d，并制作紫红曲霉孢子悬液，调整浓度至（6.5 ± 0.2）×106个/mL。
、紫外诱变：在220V，20w的紫外灯和磁力搅拌器分别预热30 min后，在超净工作台中距离紫外灯40 cm处磁力搅拌的作用下对紫红曲霉孢子悬液紫外照射60s。
、二次分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32±1℃下培养3~7 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到纯化的诱变后的紫红曲霉。
实施例3
本实施例中，采用的菌株为红曲霉M9，红曲霉液体培养基（g/L）：葡萄糖65，蛋白胨20，可溶性淀粉30；红曲霉固体培养基（g/L）：葡萄糖65，蛋白胨20，可溶性淀粉30，琼脂12。
本实施例提供了一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法，具体方法如下：
1、红曲霉单孢子悬液的制备：从产孢情况好的红曲霉M9平板表面刮洗下红曲霉M9孢子，并使用350~400目细胞筛过滤并调整孢子浓度至（5.0 ± 0.5）×106个/mL后置于灭菌后的空锥形瓶中备用，得到红曲霉单孢子悬液。
、过氧化氢诱变：配制10 mL红曲霉液体培养基，高压蒸汽灭菌后分别加入过滤除菌的0.0050mL的30% H2O2溶液，即H2O2终浓度为0.050%。将浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL的红曲霉孢子悬液以5%接种量即0.5 mL/瓶接入H2O2的液体培养基中，于37℃下振荡培养48~72h。
、菌株的分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的过氧化氢诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32±1℃下培养3~7 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到纯化的过氧化氢诱变后的红曲霉。
、选出过氧化氢诱变后的红曲霉：将得到纯化的过氧化氢诱变后的红曲霉接种于籼米中并发酵制得红曲米，按照红曲米中红曲色素和桔霉素的测定的方法测定色价和桔霉素，选出色价/桔霉素比值前20%的菌株。
、纯化的过氧化氢诱变后的红曲霉单孢子悬液的制备：将纯化的过氧化氢诱变后的红曲霉置于红曲霉液体培养基中培养5~9 d，并制作红曲霉孢子悬液，调整浓度至（6.5± 0.2）×106个/mL。
、紫外诱变：在220V，10w的紫外灯和磁力搅拌器分别预热10 min后，在超净工作台中距离紫外灯20 cm处磁力搅拌的作用下对红曲霉孢子悬液紫外照射300s。
、二次分离纯化：在超净工作台中使用灼烧灭菌后冷却的接种环分别蘸取生理盐水和平板上颜色较深的诱变后的目标菌株单菌落的孢子粉，进行三区划线分离，划线完成后置于32±1℃下培养3~7 d，每次均挑取颜色较深的单菌落孢子粉进行下一次划线，进行三次以上纯化至菌落形态一致，得到纯化的诱变后的红曲霉。

Claims (8)

1.一种增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述增强红曲霉紫外诱变效果的方法为：在紫外诱变前将红曲霉孢子悬液接种至含H2O2的红曲霉液体培养基中培养，并筛选出色价/桔霉素比值前20%的菌株作为出发菌，再进行紫外诱变。
2.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述含H2O2的红曲霉液体培养基中H2O2的终浓度为0.043~0.050%。
3.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述培养温度为32~37℃。
4.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述红曲霉孢子悬液的接种量为2~5%。
5.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述红曲霉液体培养基的配方为，以质量体积比计：葡萄糖50~65g/L，蛋白胨20~25g/L，可溶性淀粉25~35g/L。
6.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述紫外诱变是距离10~20w紫外灯20~40cm处磁力搅拌的作用下对红曲霉孢子悬液紫外照射60~300s。
7.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述红曲霉孢子悬液浓度为（5.0 ± 0.5）×106个/mL。
8.根据权利要求1所述的增强红曲霉紫外诱变效果的方法，其特征在于：所述H2O2的液体培养基中培养的时间为48~72h。
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