CN116218687A - 一株产黄色素的臭曲霉菌及其应用 - Google Patents

一株产黄色素的臭曲霉菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产黄色素的臭曲霉菌及其应用。该臭曲霉菌的名称为臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32，于2023年01月03日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63106。该臭曲霉菌是在新会陈皮自然发酵分离得到的菌株，通过紫外诱变，得到的高产胞内黄色素的菌株。通过该菌株发酵可制备得到组分较明确的天然黄色素。

Description

一株产黄色素的臭曲霉菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌种选育的技术领域，特别涉及一株产黄色素的臭曲霉菌及其应用。
背景技术
天然色素具有无毒、安全性高，色泽自然鲜艳的特点，日益受到重视和青睐。天然色素现在主要来源是植物和微生物。但植物源色素因植物生长周期较长，受季节、气候、产地、规模、成本等因素的影响，其加工工艺也常常导致产品批次间的差异，从中提取的色素价格昂贵，使其在大规模应用中受限。而利用微生物资源采取发酵方法生产天然色素，不受季节、场地影响，微生物生长速度快、生产成本低，转化率高，易于工业化。因此，采用微生物生产天然色素将逐渐成为天然色素来源的主流。
天然黄色素的需求量较大，但适合生产的菌种资源缺乏，目前国内获批由微生物发酵生产的黄色素只有红曲黄色素一种，且因红曲霉所产色素中黄色素含量较低，实际生产中采用的是化学转化方法，将红曲红色素经硫化物磺化后制成红曲黄色素。严格来说，转化后形成的红曲黄色素为非天然色素，因此，天然黄色素生产技术有待进一步开发。
臭曲霉是一种已经应用在生产淀粉酶、柠檬酸、糖化曲以及酿造酱油、酒和醋等领域的菌种，通过对原始菌株进行紫外诱变，筛选出高产天然黄色素的突变菌株，对天然黄色素的生产及应用具有直接现实的重要意义和价值。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株产黄色素的臭曲霉菌。
本发明的另一目的在于提供上述产黄色素的臭曲霉菌的应用。
本发明的再一目的在于提供一种黄色素，通过上述臭曲霉菌生产得到。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株产黄色素的臭曲霉菌，名称为臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32，于2023年01月03日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63106。
所述的臭曲霉HC32具有如下形态学特征：在种子平板(PDA)上培养7天，形成圆形菌落，菌落直径在30～40mm，菌落呈黄色，短绒毛状、无褶皱，气生菌丝白色，基内菌丝黄色，有内容物；不具辐射状沟纹；菌落背面亦不具辐射状沟纹，背面呈深黄棕色。
上述产黄色素的臭曲霉菌在黄色素生产中的应用。
一种黄色素的生产方法，包括如下步骤：
(1)将上述产黄色素的臭曲霉菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵菌液；
(2)将步骤(1)得到的发酵菌液进行固液分离，取菌体；
(3)用有机溶剂振荡提取步骤(2)得到的菌体的胞内容物，得到的提取液即为胞内黄色素溶液。
步骤(1)中所述的臭曲霉菌种子液为处于对数生长期的臭曲霉菌；优选通过如下步骤制备得到：将臭曲霉菌保存菌种活化后接种于种子培养基中进行摇瓶培养，得到处于对数生长期的臭曲霉菌。
所述的活化的步骤优选如下：将臭曲霉菌保存菌种划线于PDA培养基平板中，于25～30℃培养4～7天，进行活化。
所述的接种的接种量为每50mL种子培养基接种两块直径为0.5～1cm的平板菌块。
所述的种子培养基优选为PDB液体培养基。
所述的摇瓶培养的条件优选为于25～35℃、100～200rpm培养24～48h；更优选为于28～30℃、180～200rpm培养48h。
步骤(1)中所述的臭曲霉菌种子液的接种量为体积百分比5～15％；更优选为体积百分比10％。
步骤(1)中所述的发酵培养基的组成优选如下：碳源20～80g/L、氮源4～60g/L、KH2PO4 0～1g/L、MgSO4·7H2O 0～0.5g/L、KCl 0～0.5g/L和FeSO4·7H2O0～0.01g/L，用蒸馏水定容至1000mL，pH值自然。
所述的碳源为葡萄糖、果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、大米粉、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖酸钠和马铃薯淀粉中的至少一种；优选为葡萄糖。
所述的葡萄糖在所述的发酵培养基中的浓度优选为50～80g/L；更优选为55～65g/L。
所述的氮源为大豆蛋白胨、细菌学蛋白胨、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酵母粉、黄豆粉、谷氨酸钠、氯化铵和硫酸铵中的至少一种；优选为大豆蛋白胨。
所述的大豆蛋白胨在所述的发酵培养基中的浓度优选为5～20g/L；更优选为10～15g/L。
所述的发酵培养基的组成优选如下：K2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、KCl0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、葡萄糖50～80g/L、大豆蛋白胨5～20g/L，pH自然；更优选如下：K2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、葡萄糖55～65g/L、大豆蛋白胨10～15g/L，pH自然。
步骤(1)中所述的发酵培养的条件优选如下：于25～35℃、100～200rpm培养4～12天；更优选如下：于25～30℃、150～200rpm培养5～10天；最优选如下：于28～30℃、150～200rpm培养6～7天。本发明人发现，菌株的培养时间并非越长越好，而是存在着波动。本发明的变异株臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32，其发酵周期显著短于原始菌株，其能够在发酵起始后的短时间内达到黄色素的大量产生。因此，本发明的变异株臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32的培养时间可以为4～12天、较佳地5～10天、更佳地6～7天。
步骤(2)中所述的固液分离的方式包括滤纸过滤、抽滤和离心；优选为滤纸过滤。
步骤(3)中所述的有机溶剂优选pH值为1.5～2.5、浓度为体积百分比60～80％的乙醇水溶液；更优选pH值为2.0、浓度为体积百分比70％的乙醇水溶液。
所述的pH优选为用盐酸调节得到。
步骤(3)中所述的提取液可经过进一步浓缩、干燥，得到黄色素。
一种黄色素，通过上述生产方法得到；其主要成分为4个成分，分子量分别为472.30、574.42、486.31和412.37。
所述的黄色素在经过适当的加工、提纯、无毒化处理后，可作为色素添加剂。
所述的黄色素为天然黄色素，能在医药、化妆品、食品、饲料和工业制品等需要增色处理的产品中应用。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)现有用来生产微生物天然色素的红曲霉，能产生的红曲色素已被鉴定出有111种，主要有红色素、橙色素和、黄色素三大类，且因所产色素中黄色素占比较低，实际生产中黄色素是将红曲红色素经硫化物磺化后制成红曲黄色素，严格来说是采用化学转化方法获得，形成的红曲黄色素为非天然色素。而本发明选育出来的臭曲霉菌株HC32产生的黄色素主要是四个成分，易于制备出组分明确的产品，不需经化学转化。
(2)本发明提供的高产胞内黄色素臭曲霉菌株，在选用常规的碳源(葡萄糖)和氮源(大豆蛋白胨)的条件下，可实现胞内黄色素高产。
(3)本发明提供的选育方法简单，发酵条件温和，投入少、易掌握。
附图说明
图1是原始菌株臭曲霉HC16的系统进化树图。
图2是臭曲霉HC32所产胞内黄色素的光谱图。
图3是臭曲霉HC32的菌落与细胞形态图；其中，a为菌落正面图，b为菌落背面图，c为放大400倍的光学显微镜下的菌丝图，d为放大100倍的光学显微镜下的菌丝图。
图4是原始菌株与臭曲霉HC32在基本发酵培养基发酵所产胞内黄色素的色价和菌丝生物量结果图。
图5是原始菌株与臭曲霉HC32在改进的发酵培养基发酵所产胞内黄色素的色价和菌丝生物量结果图。
图6是臭曲霉HC32发酵所产胞内黄色素4个主要组分的超高效液相-质谱联用分析谱图；其中，a为样品质谱图，b为组分A的分子量检测结果，c为组分B的分子量检测结果，d为组分C的分子量检测结果，e为组分D的分子量检测结果。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA固体培养基)：葡萄糖20g，马铃薯浸粉4g，琼脂20g，用蒸馏水定容到1000mL，pH自然。
马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB液体培养基)：葡萄糖20g，马铃薯浸粉4g，用蒸馏水定容到1000mL，pH自然。
基本发酵培养液：K2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、葡萄糖20g/L、鱼粉蛋白胨5g/L，pH自然。
实施例1高产胞内黄色素的臭曲霉菌株的分离、鉴定及诱变
本发明使用的臭曲霉HC16分离自新会陈皮，具体分离步骤如下：将新会陈皮放置于装有100mL无菌水的250mL锥形瓶中，在180rpm转速的摇床上振荡30min后，吸取100μL液体在PDA培养基上涂布，在28℃恒温培养箱培养3天后，挑取菌落形态不同的菌落在PDA培养基上进行平板划线分离，于28℃培养，直至单个平板上出现形态单一的单菌落。再将得到的单菌落接种到PDB培养基中，发现一瓶呈黄色的菌液，提取该菌的总DNA，采用真菌ITSrRNAPCR扩增通用引物ITS4和ITS5，进行PCR扩增，送由金唯智测序，测序结果如下所示：
Figure BDA0004080611520000051
将所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，利用MEGA6.0软件构建系统进化树，如图1所示，可见，该菌株(命名为HC16)与Aspergillus foetidusCBS128.28同源性为99.17％，确定该菌为臭曲霉(Aspergillus foetidus)。以臭曲霉HC16为原始菌株进行诱变，将诱变后得到的臭曲霉HC32经过PDB液体培养基发酵后，再使用70％的乙醇溶液对胞内物质进行提取，经过紫外分光光度计的光谱扫描后，如图2所示，发现其在422nm出有一个最大吸收峰。诱变的具体步骤如下：
(Ⅰ)霉菌孢子悬液制备：原始菌株HC16接种于PDA固体培养基上，在28℃培养15天，待平板上的菌体长出孢子时，用无菌生理盐水冲洗菌体表面，用灭菌后玻璃珠打散，经8层无菌纱布过滤后，在显微镜下使用血球计数板对孢子数量进行计数，进行适当稀释，制成孢子数量在1×105个/mL的悬浮液。
(Ⅱ)紫外诱变：将步骤(Ⅰ)中得到的含有孢子的悬浮液，吸取20mL置于直径90mm的平底培养皿中，在距离19W紫外灯30cm处放置，边磁力搅拌边照射6分钟，进行紫外诱变。
(Ⅲ)平板分离筛选：将步骤(Ⅱ)诱变后的悬浮液稀释后涂布于PDA固体培养基平板上，28℃恒温避光倒置培养，待长出菌落后，挑选出与原始菌株相比菌落形态发生变化的菌株(包括黄色素颜色的深浅、半径大小和菌丝半径大小)，进行单菌落划线分离，经反复分离纯化得到较纯的诱变菌株，于4℃保藏。
(Ⅳ)发酵选育：将步骤(Ⅲ)分离纯化得到的诱变菌株进行发酵实验，即将步骤(Ⅲ)分离纯化得到的诱变菌株接种于灭菌的50mL PDB液体培养基中进行培养增殖，每50mLPDB液体培养基接种1个2mm×2mm大小的菌块，180rpm培养48小时，使得臭曲霉菌处于对数生长期，得到种子液；将种子液按10％的比例(V/V)接入50mL PDB液体培养基中，180rpm培养7天，将发酵好的发酵液进行固液分离，取菌体，以70％浓度的乙醇水溶液(pH值用稀盐酸调节至2.00)提取菌体内容物，检测提取液中胞内黄色素的色价和组分，得到高产胞内黄色素的臭曲霉菌株。
经过选育，得到一株高产胞内黄色素的臭曲霉菌株，其具有以下特点：在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上生长良好，形成圆形菌落，不具辐射状沟纹；如图3中a所示，菌落呈黄色，质地丝绒状，菌丝体周围形成边缘区，边缘区的菌丝稀疏向四周延伸。培养6～7天后直径可达30～40mm，如图3中b所示，菌落背面亦不具辐射状沟纹，背面呈深黄棕色；如图3中的c和d所示，菌丝体呈黄绿色，有内容物。将其命名为臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32，于2023年01月03日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63106。
实施例2利用高产胞内黄色素的臭曲霉菌株按常规方法制备黄色素
(1)种子液的制备：将划线于PDA平板上的原始菌株(HC16)和突变菌株(HC32)平板种子分别接种于灭菌的50mL PDB液体培养基中进行培养增殖，接种量为2个直径为0.5cm的菌块，置于摇床控制180rpm培养48h，得到种子液。
(2)发酵培养：将种子液按10％(V/V)接种量接种到50mL基本发酵培养液中，在摇床条件下控制180rpm、30℃发酵培养7天，将发酵好的发酵液进行过滤分离，取菌体，加入50mL 70％浓度的乙醇水溶液(pH值用稀盐酸调节至2.00)，在180rpm条件下的摇床中振荡3h，提取菌体内容物，滤纸过滤后测定滤液色价和菌丝体干重。
(3)色价的测定方法：取胞内色素提取液稀释至合适浓度，使用分光光度计检测过滤后所得滤液的黄色素的色价(即波长为422nm处的吸光度值)。结果如图4所示，突变菌株发酵胞内色素提取液用紫外分光光度计测定422nm处的吸光度为14.05AU/mL；原始菌株发酵胞内提取液用紫外分光光度计测定422nm处的吸光度分别为8.25AU/mL。可见突变菌株胞内黄色素色价是原始菌株的1.703倍。
(4)菌体干重测定方法：用过滤将菌体过滤到事先称量好质量的滤纸片上，用去离子水反复冲洗直至滤液变为无色；将滤纸取下，放入烘箱中在120℃下烘2h烘干，然后在干燥器内放至室温，使用精密分析天平称量滤纸片和菌体的总重，最后求出菌体干重。结果如图4所示，突变菌株发酵后菌丝干重为4.45g/L；原始菌株发酵的菌丝干重为2.66g/L。可见突变菌株菌丝干重是原始菌株的1.71倍。
实施例3利用高产胞内黄色素的臭曲霉菌株按优化后碳氮源制备胞内黄色素
将高产胞内黄色素臭曲霉菌株HC32和原始菌株HC16，按照实施例2的方法进行菌体的种子活化，与实施例2所不同的是在发酵培养基(即基本发酵培养液)中改变，碳源为葡萄糖且葡萄糖的浓度提升至为60g/L，氮源改变为大豆蛋白胨，且浓度改变为15g/L。发酵7天后，按照实施例2的方法测定胞内色素提取液的色价及菌丝干重。结果如图5所示，突变菌株发酵胞内液用紫外分光光度计测定422nm处的吸光度分别为99.42AU/mL，原始菌株发酵胞内色素提取液用紫外分光光度计测定422nm处的吸光度为37.68AU/mL。可见，在优化后的发酵培养基条件下，突变菌株胞内黄色素色价是原始菌株的2.64倍。而突变菌株在发酵结束后菌丝干重为11.04g/L，原始菌株在发酵结束后菌丝干重为4.32g/L。可见，在优化后的发酵培养基条件下，突变菌株的菌丝干重是原始菌株的2.55倍。
实施例4检测高产胞内黄色素的臭曲霉菌株按优化后碳氮源制备的黄色素组分及分子量
将高产胞内黄色素臭曲霉菌株HC32，按照实施例2的方法进行菌体的种子活化，然后按照实施例3中的发酵培养基配方进行发酵培养，发酵7天后，按照实施例2的方法分离胞内色素提取液，使用超高效液相-质谱联用方法对其提取液进行检测。
超高效液相-质谱联用检测方法：胞内色素提取液用0.22μm有机膜进行过滤，使用赛默飞世尔科技Ultimate 3000超高效液相色谱系统与LTQ Orbitrap Elite质谱仪联用进行实验。在流动相流速为0.3mL min-1的ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(内径100mm×2.1mm，粒径1.8μm)上进行色谱分离。流动相由(A)含有0.1％甲酸的水和(B)乙腈组成。梯度洗脱程序如下：从20％到80％B保持0-13分钟，在80％B上保持13-18分钟，在20％B上保持18-30分钟。进样体积为1μL。色谱柱和样品温度分别保持在40和10℃。质谱仪所用参数设置如下：电喷雾离子化源，正离子模式检测，负极和正极毛细管电压分别为2.50KV和3.20KV，源汽化器温度250℃，毛细管温度275℃，护套气35arb，辅助气体10arb，载气为氦气，在100–1000的m/z范围内记录MS谱图。数据使用赛默飞世尔科技Xcalibur软件处理，根据质谱图得到相关的分子量等信息。
结果如图6中a所示，突变后臭曲霉HC32发酵所产生的胞内提取液中在422nm下主要包含4种组分(A-D)，进一步检测每个组分的分子量信息，结果如图6中b-e所示，其分子量大小分别为A:472.30，B：574.42，C：486.31，D：412.37。
本发明公开的菌株是活体细胞，一旦获得了本发明的臭曲霉(Aspergillusfoetidus)HC32菌株，就可以通过接种传代、再生等手段来大批量地获得该菌株。这通常是将其接种到固体平板培养基或液体培养基中进行菌株的扩大培养而获得本发明的活体细胞。而获得的活体细胞可进一步进行实验室驯化、遗传育种和分子遗传操作等来获得突变体和转化子。此外，也可利用本发明的菌株作为异源表达的生物工程宿主细胞。
进一步地，本发明的高产黄色素的臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32菌株可作为原始菌株，通过实验室驯化、遗传育种、分子遗传操作等手段进行进一步改良而获得产量更高或酶系更为优化的衍生菌株。以本发明的臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC16菌株作为原始菌株，通过这些人工操作手段进一步筛选优化获得的菌株，也应被包含在本发明的整体范围内。
本领域的技术人员熟知的方法能用于进一步诱变本发明的活体菌株，而造成活体细胞的基因编码改变、酶活特性和形态学上的改变。这些方法包括利用射线、粒子、激光等物理方法，利用烷化剂、碱基类似物、羟胺、吖啶色素等化学诱变方法。诱变可是以上一种方法或多种方法的多代诱变，且不限于这些方法。基于本发明提供的菌株，可以进一步进行物理化学等方式进行育种，也可以导入新的黄色素调控基因和其它相关调控基因，获得的突变体和转化子产酶性能可获得进一步提高，所述的育种方法为上述的一种或一种以上相结合。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建表达构建物(载体)和进一步改造本发明菌株。例如，对于菌株中已发现或新发现的与黄色素生产相关的信号途径、信号通路及其中涉及的蛋白进行进一步的改良。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。所用的步骤在本领域众所周知。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一株产黄色素的臭曲霉菌，其特征在于：所述的产黄色素的臭曲霉菌的名称为臭曲霉(Aspergillus foetidus)HC32，于2023年01月03日保藏于位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:63106。
2.权利要求1所述的产黄色素的臭曲霉菌在黄色素生产中的应用。
3.一种黄色素的生产方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将上述产黄色素的臭曲霉菌种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵菌液；
(2)将步骤(1)得到的发酵菌液进行固液分离，取菌体；
(3)用有机溶剂振荡提取步骤(2)得到的菌体的胞内容物，得到的提取液即为胞内黄色素溶液。
4.根据权利要求3所述的黄色素的生产方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的臭曲霉菌种子液通过如下步骤制备得到：将臭曲霉菌保存菌种活化后接种于种子培养基中进行摇瓶培养，得到处于对数生长期的臭曲霉菌；
所述的活化的步骤如下：将臭曲霉菌保存菌种划线于PDA培养基平板中，于25～30℃培养4～7天，进行活化，获得平板种子；
臭曲霉菌种子液的制备过程中：所述的接种的接种量为每50mL种子培养基接种两块直径为0.5～1cm的平板菌块；所述的种子培养基为PDB液体培养基；所述的摇瓶培养的条件为于25～35℃、100～200rpm培养24～48h；
步骤(1)中所述的发酵培养基的组成如下：碳源20～80g/L、氮源4～60g/L、KH2PO4 0～1g/L、MgSO4·7H2O 0～0.5g/L、KCl 0～0.5g/L和FeSO4·7H2O 0～0.01g/L，用蒸馏水定容至1000mL，pH值自然；
所述的碳源为葡萄糖、果糖、蔗糖、红糖、麦芽糖、大米粉、可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖酸钠和马铃薯淀粉中的至少一种；
所述的氮源为大豆蛋白胨、细菌学蛋白胨、鱼粉蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、酵母粉、黄豆粉、谷氨酸钠、氯化铵和硫酸铵中的至少一种。
5.根据权利要求3所述的黄色素的生产方法，其特征在于：
所述的发酵培养基的组成如下：K2HPO4 1g/L、MgSO4 0.5g/L、KCl 0.5g/L、FeSO4 0.01g/L、葡萄糖50～80g/L、大豆蛋白胨5～20g/L，pH自然；
步骤(1)中所述的臭曲霉菌种子液的接种量为体积百分比5～15％；
步骤(1)中所述的发酵培养的条件如下：于25～35℃、100～200rpm培养4～12天。
6.根据权利要求3所述的黄色素的生产方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的固液分离的方式包括滤纸过滤、抽滤和离心；
步骤(3)中所述的有机溶剂是浓度为pH值为1.5～2.5、体积百分比60～80％的乙醇水溶液。
7.根据权利要求3所述的黄色素的生产方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的提取液经过进一步浓缩、干燥，得到黄色素。
8.一种黄色素，其特征在于：通过权利要求1～7任一项所述的生产方法得到。
9.权利要求8所述的黄色素在制备色素添加剂中的应用。
10.权利要求8所述的黄色素作为天然黄色素在医药、化妆品、食品、饲料领域中的应用。
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