CN110272828B - 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生宁博炭疽菌 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)HS7‑1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019386。该菌株来源于蛇足石杉内生真菌，它具有产石杉碱甲的能力，本发明为石杉碱甲工业化发酵生产提供了另一种微生物资源，对满足石杉碱甲的原料药供应具有重要意义。

Description

一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生宁博炭疽菌
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)。
背景技术
随着世界范围内人口老龄化进程加剧，老年痴呆的发病率也随之在剧增。石杉碱甲(Huperzine A)是一种强效及高选择性的的可逆性抑制药剂，是医学界普遍公认的治疗老年痴呆的一线药物。目前，石杉碱甲的原料大都来自野生蛇足石杉，然而蛇足石杉的生长速度十分缓慢，大面积的农业推广难以进行，从而限制了原料供应。目前已有大批学者探索了Huperzine A的化学合成途径，然而合成的工艺复杂、成本昂贵、且疗效不及天然产物，尤其是很难获得纯光学活性的Huperzine A，目前研究进展仍旧极其缓慢，极大的阻碍了规模化生产及利用。
植物的体内可获得大量的内生真菌，从这些菌体中可以提取分离得到许多有活性的天然化合物。韩文霞从野生蛇足石杉中筛选并鉴定青霉菌属真菌和轮枝镰孢菌两个菌株产石杉碱甲(韩文霞2015)；徐晓苗从蛇足石杉中分离出一株产石杉碱甲的胶孢炭疽菌(徐晓苗2011)；赖政等发现蛇足石杉内生真菌Phaeosphaeriaceae科中一未知菌株菌体总生物碱对ACh E活性的抑制率均达到40％以上(赖政等2014)。目前，产石杉碱甲菌株为开发乙酰胆碱酯酶抑制剂提供了菌种资源，但仍存在可利用的菌种少，筛选出的菌株产石杉碱甲的产量较低等不足。
本研究分离出了大量蛇足石杉内生真菌，根据协同进化的理论，蛇足石杉内生真菌有能力产生与蛇足石杉相同或相似的药用功能代谢产物，这为发现新的先导化合物、开发新药及保护蛇足石杉物种提供了重要资源。基于此理论，本实验团队经过不懈努力从野生石杉属植物体内分离到了180株内生真菌，经过分子鉴定和形态学鉴定，共鉴定出50株生真菌，对这些真菌进行培养和测定，最终发现并获得了一株产Huperzine A的内生真菌宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)。
发明内容
本发明的目的是提供一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生真菌——宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)。
申请人通过对野生蛇足石杉内生真菌进行分离，然后对分离出来的单菌落进行形态鉴定和高通量测序，共鉴定出50株内生真菌，将已鉴定的内生真菌活化、培养后提取生物碱，最后对提取物中的成分运用ESI-MS进行检测，发现一株宁博炭疽菌(Colletotrichumboninense)，命名为HS7-1，该菌株具有产石杉碱甲的能力，每克干菌丝石杉碱甲的产率是3.7μg，处于较高水平。
所分离出的宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)HS7-1菌株已于2019年5月23日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2019386。
本发明为石杉碱甲工业化发酵生产提供了另一种新微生物资源，对满足石杉碱甲的原料药供应具有重要意义。
附图说明
图1是50株蛇足石杉内生真菌基于ITS序列构建的系统进化树。
图2是粗生物碱提取物与石杉碱甲标准品的HPLC色谱图。
图3是粗生物碱提取物与石杉碱甲标准品的ESI-MS质谱图。
具体实施方式
实施例1产石杉碱甲内生真菌的筛选和鉴定
1.蛇足石杉内生真菌的分离
采自重庆石柱县(经度108.4585，纬度30.3137，海拔1427m)，由湖北省中医院生药学专家王克勤教授鉴定为野生蛇足石杉(Huperzia serrata)。
用毛刷去除野生蛇足石杉表面灰尘等附着物，将其分为茎段、叶片、根段，加入含量75％的酒精溶液轻轻摇晃5min。滤干后加入含量为0.2％升汞浸泡1.5min，用无菌水清洗5次。清洗水收集作为对照。最后将消毒处理后的组织样品转移到无菌的滤纸上吸干水分。用无菌的镊子轻轻夹取经过消毒处理的组织，分别轻放于PDA培养基的表面，接种后放于28℃生化培养箱内，并合理控制湿度，防止过于干燥培养基失水影响菌体的正常生长。经常观察其生长状态，如果发现有染菌或者叶片组织坏死的样品移出培养箱淘汰并记录。将分离出来的单菌落进行-80℃保存备用。
2.蛇足石杉内生真菌的鉴定
对分离出来的单菌落进行形态和分子鉴定：
形态鉴定：在-80℃中保存的内生菌菌株接种于PDA平板上，置于25℃的恒温箱中进行活化后，用6mm直径无菌打孔器在菌落边缘取菌丝块。然后将菌丝块移植到新的PDA平板上。将接种后的平板置于28℃的恒温箱中培养。逐日观察各菌株菌落形态、菌丝颜色，是否产生色素等特征，以及是否产生孢子、菌核。
分子鉴定：1)将保存在-80℃的内生真菌株重新放在PDA平板上进行活化，待内生菌生长到能够收集到足够的菌丝，将内生菌收集起来，利用改良的CTAB法提取内生真菌的DNA。在Nanodrop2000超微量核酸仪上进行DNA质量和浓度的检测。同时，1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。基因组DNA统一稀释至50ng/μL备用。
2)真菌ITS序列扩增和高通量测序：利用引物ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)扩增内生菌的ITS序列。PCR产物利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，对应的阳性克隆菌液送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。测序结果通过BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)程序与GenBank核酸数据库进行比对，获得鉴定信息，并将得到的PCR产物序列利用Sequin软件上传至GenBank数据库，获得Accession Number。所有真菌的ITS序列，利用MEGA7.0软件的neighbor-joining计算方法进行系统进化树构建(图1)。
鉴定结果：从蛇足石杉的根茎叶中共分离出180个单菌落，经观察各菌落形态、菌丝颜色、是否产生孢子等特征以及通过提取菌丝DNA、PCR扩增进行ITS测序，完成内生真菌的形态学鉴定和分子生物学鉴定。鉴定到属的有50株内生真菌，其中包含4个纲，7个目，11个科，12个属。分离鉴定出的优势种为：宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)、胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)、链格孢菌(Alternaria alternata)、草茎点霉(phoma herbarum)。胶孢炭疽菌、宁博炭疽菌属于Sordariomycetes,Glomerellales,Glomerellaceae,Colletotrichum；链格孢菌属于Dothideomycetes,Pleosporales,Pleosporaceae,Alternaria；草茎点霉属于Dothideomycetes,Pleosporales,Didymellaceae,Phoma。
3.产石杉碱甲内生真菌的筛选
将已鉴定的50株内生真菌活化后接种到PDB液体培养基中进行摇瓶培养。石杉碱甲为次级代谢产物，摇瓶需要在28℃、150r/min条件下培养15d，再通过布氏漏斗过滤，40℃烘干，按重量体积比1：30加0.5％的盐酸超声溶解45min，浸泡过夜；过滤取上清用浓氨水调pH至9.0，再用等体积氯仿萃取3次，合并氯仿液，旋转蒸发至氯仿蒸干，甲醇溶解后，得到粗生物碱提取物样品，保存于4℃冰箱。
采用HPLC法对上述粗生物碱提取物样品中的石杉碱甲进行测定，色谱条件：Kromasil-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5um)；检测波长：310nm；柱温：25℃；流动相流速：1mL/min；流动相配比：甲醇：醋酸铵(PH6.0，80mM)＝6.5：3.5。
结果发现一株宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)HS7-1，该菌株的菌丝生物碱提取物的特征吸收峰与同等液相条件下标准品的色谱峰保留时间一致，证明HS7-1菌株能够产生石杉碱甲(图2)。含量测定结果表明，该菌株每克干菌丝石杉碱甲的产率是3.7μg。
将粗生物碱提取物样品经过高速逆流色谱分离纯化各生物碱组分后，运用于测定化合物的分子量，并与标准品石杉碱甲的质谱图相比较。ESI-MS图谱检测表明，HS7-1菌株与标准品质谱图基本一致。表明两种化合物具有相同的分子量和相同的分子结构，即HS7-1可以发酵产生石杉碱甲(图3)。
HS7-1菌株菌落形态为浅灰色，圆形，菌丝绒状；菌落反面是淡黄色或灰色，后期中央有黑色孢子产生；菌丝有隔，附着胞形状为球形或近球形；分生孢子梗不分枝，形状为圆柱形或纺锤形，鉴定为宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)。
HS7-1菌株的ITS序列见序列表SEQ ID NO:1，该序列与宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)(GenBank Acc.No.FJ968604.1)具有100％同源性。
该菌株分类命名宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)HS7-1，于2019年5月23日保藏于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2019386。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一株产石杉碱甲的蛇足石杉内生宁博炭疽菌
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 599
<212> DNA
<213> 宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)
<400> 1
ttccgttgag gggtgtcctg cggagggatc attactgagt taccgctcta taaccctttg 60
tgaacatacc tacaactgtt gcttcggcgg gtaggccgtc ccctgaaaag gacgcctccc 120
ggcccggacc ggaccccccg tggggccgga ctcggcgccc gccggaggat aaccaaacgc 180
tattttaacg acgtttcttc tgagtggcat aagcaaaata atcaaaactt ttaacaacgg 240
atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tgtgaattgc 300
agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagca ttctggcggg 360
catgcctgtt cgagcgtcat ttcaaccctc aagctctgct tggtgttggg gctctacggt 420
cgacgtaggc cctcaaaggt agtggcggac cctcccggag cctcctttgc gtagtaacat 480
ttcgtctcgc actgggatcc ggagggactc ttgccgtaaa accccccaat ttttcaaggt 540
tgacctcgga tcaggtagga atacccgctg aacttaagca tatcaataag gcggaggaa 599

Claims (2)

1.一株宁博炭疽菌(Colletotrichum boninense)HS7-1，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2019386。
2.权利要求1所述的宁博炭疽菌HS7-1在发酵生产石杉碱甲中的应用。
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CN103103134A (zh) * 2011-11-10 2013-05-15 吴水生 一种蛇足石杉内生真菌及其产石杉碱甲的应用
KR20190044484A (ko) * 2017-10-20 2019-04-30 대한민국(농촌진흥청장) 식물의 생물 또는 비생물적 스트레스 저항성을 증진시키는 바실러스 시아멘시스 균주 및 이의 용도

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Title
Species from the Colletotrichum acutatum , Colletotrichum boninense and Colletotrichum gloeosporioides species complexes associated with tree tomato and mango crops in Colombia;C. J. Pardo‐De la Hoz等;《Plant Pathology》;20160215;第65卷;参见全文 *
产生物碱核石杉碱甲石杉科植物内生真菌的研究;苏经迁等;《福建师范大学》;20111231;参见全文 *

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