CN110218700A - 一种制备动物成熟神经元单细胞的方法 - Google Patents

一种制备动物成熟神经元单细胞的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备动物成熟神经元单细胞的方法，属于成熟神经元单细胞分离技术领域。本发明首先利用D‑PBS对小鼠进行灌流，将血细胞去掉，避免了血细胞对后续分离的影响；利用Hibernate‑A作为消化过程中的培养基，可以不考虑预先通氧或者消化过程中通氧的问题，可有效节约至少30min时间，减少对神经元的伤害；此方法不需要特别的仪器即可进行单细胞制备；本方法可同时分离出寡突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元，可在同一批次样品中对不同类型的神经细胞进行测序或者功能分析，可减少实验误差，节约成本。

Description

一种制备动物成熟神经元单细胞的方法
技术领域
本发明涉及一种制备动物成熟神经元单细胞的方法，属于成熟神经元单细胞分离技术领域。
背景技术
在生物体内，每个细胞都是独一无二的，即使是同一器官或者组织中的同种类型的细胞也都具有异质性。大脑作为生物体最重要的器官，具有其独有的特征，如成熟神经元高度分化，不可进行细胞分裂，这可能会导致很多神经退行性疾病及精神类疾病的发生，如阿尔兹海默症、帕金森综合征等。
通过单细胞测序可以了解细胞之间的异质性，找到特异性参与某种疾病的特定类群神经元，同时也能对某一个脑区的神经元重新分类，原来由于技术的限制，对神经元的分类相对来讲不是很完善，单细胞测序技术可以解决这一问题。由于成熟神经元具有复杂的轴突树突系统，导致其在进行单细胞分离时会产生大量的杂质，同时，由于神经元对氧气和营养的需求量较其他细胞高，分离过程中神经元容易死亡。目前市场上仅有一款成熟神经元的分离试剂盒，即美天旎公司生产的大小鼠成熟神经元分离试剂盒，该试剂盒十分昂贵且需要用到美天旎公司特有的仪器，该仪器造价在30-50万/台，同时，该试剂盒最后进行血细胞的分离，会降低神经细胞的得率，所以其使用率很低，目前很少有使用该试剂盒发表的文章。而制备成熟神经元的文章虽然有很多可以参考，但是都存在需要特殊的设备、不能将神经细胞彻底地消化分离、不能同时分离神经元和不同类型的神经细胞等问题。因此，提供一种操作简便、成本低、省时、无需借助特定的仪器、适合工业化生产的成熟神经元分离的方法，对于神经单细胞测序或者进行其他分析有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备成熟神经元单细胞的方法，所述方法具体包括以下步骤：
(1)获取目的动物组织，所述目的动物组织中含目的动物神经细胞；
(2)将切碎后的目的动物组织与HABG消化缓冲液混合，每3-8mg组织添加1mLHABG，进行组织消化，消化条件为33-37℃恒温，100-200rpm消化20-50min；
(3)将消化后的组织进行离心，留沉淀，加入HABG消化缓冲液吹打沉淀；
(4)将(3)中获得的溶液中的未被消化的组织及大的碎片过滤掉；
(5)将(4)中获得的含有细胞的HABG溶液加入到细胞梯度分离液中，含有目的动物神经细胞的HABG溶液和梯度分离液的体积比为3:2-2:1，混匀后离心。
在本发明的一种实施方式中，步骤(3)中将消化好的组织于180-200g，3-5℃离心5-8min，弃上清，沉淀中加入无菌HABG，枪头先酒精灯上抛光，防止伤害细胞，用枪头轻轻吹打，3-6s吹打一个来回，共吹打3-5次，吹打过程中不要产生气泡，切记一定要轻轻吹打，防止伤害细胞；如果死亡率超过预想值或者最后的细胞碎片依然较多，降低减少吹打次数，但是细胞得率会降低，需求的组织量就要相应增加。
在本发明的一种实施方式中，步骤(4)中将预先用D-PBS浸润过的10-100μm的筛网套至干净的离心管中，将上述含有目的动物神经细胞的HABG溶液加入筛网中过滤未被消化的组织及大的碎片。
在本发明的一种实施方式中，于无菌环境中配置如下细胞梯度分离液并按表1从上到下小心依次加入到15mL离心管中待用，为减少各层之间的混合，预先将离心管内壁湿润，以便液体均匀缓慢留下。
表1梯度分离液
顺序 Optiprep1.32(μL) HABG(μL) 合计(μL)
第一层(最底层) 173 827 1000
第二层 124 876 1000
第三层 99 901 1000
第四层(最上层) 74 926 1000
在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中获取目的组织的方法包括：将小鼠麻醉，利用冰上预冷的D-PBS进行心脏灌流至流出液体为无色，在冰上迅速取出小鼠大脑或脊髓，切取目的区域，迅速将所取区域切碎，然后放入冰上预冷的HABG中，每3-8mg需要1mL HABG；如需达到105数量级的细胞数，则需要至少10mg的组织进行消化。
在本发明的一种实施方式中，HABG消化缓冲液的配方是：在50mL离心管中分别加入30mL HA，600μL B27，75μL glutamax，300μL P/S双抗及终浓度为1mg/mL的pronase和终浓度为20U/mL的DNase，每管1mL进行分装，-20℃保存。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中加入细胞梯度分离液后600-1000g，20-24℃离心12-18min。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)离心后弃去最靠近管口的一层液体，取剩余溶液中从管口至管底的第三层。
在本发明的一种实施方式中，细胞梯度分离液现配现用。
在本发明的一种实施方式中，步骤(5)中离心管中加入细胞梯度分离液时，预先将离心管内壁湿润。
在本发明的一种实施方式中，离心分离细胞时使用水平转子的离心机。
本发明的另一个目的是提供上述方法在单细胞测序分析或者成熟神经元培养方面的应用。
本发明的有益效果：
1.与常规的蛋白酶如papain相比，利用pronase链蛋白酶可以更好地将神经细胞酶解成单个细胞；
2.本发明利用Hibernate-A(HA)作为消化过程中的培养基，可以不考虑预先通氧或者消化过程中通氧的问题，可有效节约至少30min时间，减少对神经元的伤害；
3.本发明不需要特别的仪器即可进行单细胞制备；
4.本发明首先利用D-PBS对小鼠进行灌流，将血细胞去掉，避免了血细胞对后续分离的影响；
5.本发明可同时分离出寡突胶质细胞、星形胶质细胞、神经元，可在同一批次样品中对不同类型的神经细胞进行测序或者功能分析，可减少实验误差，节约成本。
附图说明
图1是使用本发明得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的细胞图片。
图2是使用本方法得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的神经元细胞直径分布图。
图3是使用本方法得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的细胞聚团分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种制备成熟神经元单细胞的方法，该方法可以用于将动物发育成熟的神经元制备成单细胞，进一步用于单细胞测序分析或者成熟神经元的培养，也可用于特定的实验，如预先将不同类型的神经元进行荧光蛋白的标记，在利用本方法制备单细胞之后进行流式细胞仪分选，进而得到不同类型的神经元，在不同的处理条件下，如小鼠条件恐惧记忆或者水迷宫或者社交等处理后，将不同类型的神经元测序，分析他们在不同行为学中的不同作用等。
除特殊说明外，整个过程都要在4℃或冰上的无菌环境中进行。
具体步骤如下：
①配制HABG消化缓冲液
在50mL离心管中分别加入30mL HA，600μL B27，75μL glutamax，300μL P/S双抗及终浓度为1mg/mL的pronase和终浓度为20U/mL的DNase(试剂购于Thermo Fisher官网)，每管1mL进行分装，-20℃保存。
②将处理过的小鼠麻醉，利用冰上预冷的D-PBS进行心脏灌流至流出液体为无色，利用预冷的手术器械在冰上迅速取出小鼠大脑或脊髓，在冰上切取目的区域，在冰上利用手术刀片迅速将所取区域尽可能切碎，然后放入冰上预冷的HABG中，每5mg需要1mL HABG；根据我们的经验如想达到105数量级的细胞数则需要至少10mg的组织进行消化。
③将含有目的组织的HABG放入37℃恒温摇床中，150rpm摇30min进行组织消化；如果死亡率超过预想值，降低摇床转速，以减少对细胞的机械损伤。
④在上述第三步消化的过程中，于无菌环境中配置如下细胞梯度分离液并按表1所示(Optiprep1.32购于Sigma-Aldrich，货号：D1556)从上到下小心地依次加入到15mL离心管中待用，为减少各层之间的混合，可以预先将离心管内壁湿润，这样有利于液体均匀缓慢留下。
表1梯度分离液
顺序 Optiprep1.32(μL) HABG(μL) 合计(μL)
第一层(最底层) 173 827 1000
第二层 124 876 1000
第三层 99 901 1000
第四层(最上层) 74 926 1000
⑤将消化好的组织于水平转子离心机中200g，4℃离心5min，弃上清，沉淀中加入1mL无菌HABG，用1mL枪头(酒精灯上抛光，防止伤害细胞)轻轻吹打，约5s吹打一个来回，共吹打3-5次，吹打过程中不要产生气泡，切记一定要轻轻吹打，防止伤害细胞；如果死亡率超过预想值(如10×genomics单细胞测序要求细胞的存活率在80％以上，根据不同仪器的要求可自行摸索最佳时间)或者最后的细胞碎片依然较多，降低减少吹打次数，但是细胞得率会降低，组织量就要相应增加。
⑥将吹打过的细胞放置室温下静置3-5分钟，待大块组织沉入底部之后，吸取上清至15mL无菌离心管中，剩下的组织块继续加入HABG，再轻轻吹打3-5次，如此反复加入HABG至最后收集的HABG为6mL。
⑦将预先用D-PBS浸润过的100μm的筛网套至50mL离心管中，D-PBS的浸润有利于加入液体的均匀流出，可有效保护细胞减少伤害，用移液枪将上述含有目的细胞的HABG溶液共计6mL加入筛网中过滤未被消化的组织及大的碎片。
⑧利用40μm的筛网重复上述过程；如果有孔径为10-20μm的筛网，可在使用40μm的筛网过滤后进一步用10-20μm的筛网过滤除杂。
⑨将过滤过的6mL含有目的细胞的HABG溶液非常小心地加入到第四步的细胞梯度分离液中，此时离心管中共计10mL溶液。
⑩800g，22℃水平转子离心15min，弃上面的6mL，此时剩余的4mL溶液中，从管口到管底的第一层约1mL是寡突胶质细胞，第二层约1mL是含有细胞碎片及髓鞘的神经元，第三层约1.5mL是纯净的神经元，第四层约0.5mL是小胶质细胞，如果只需要纯净的神经元可取第三层约1.5mL于新的15mL离心管中，加入5mL HABG，小心用移液枪混匀后，200g，22℃水平转子离心2min，弃上清，沉淀用HABG溶解均匀，胎盘蓝染色计算存活率后进行后续实验，如单细胞测序，流式细胞分选或者成熟神经元的培养等。
需注意以下事项：
(1)配制HABG消化缓冲液的具体配方是：在50mL离心管中分别加入30mL HA，600μLB27，75μL glutamax，300μL P/S双抗及终浓度为1mg/mL的pronase和终浓度为20U/mL的DNase，每管1mL进行分装，-20℃保存。
(2)DNase主要是消化各个神经细胞之间粘连的DNA，减少细胞之间的交联，可显著提高单细胞的得率。
(3)先将小鼠麻醉，然后用预冷的D-PBS通过心脏灌流去除血细胞，如果消化后再单独去除血细胞会降低神经细胞的得率。
(4)灌流后取出目的组织后应先用刀片将组织尽可能地切碎，因为神经组织对氧气的需求量较大，预先切碎可提高细胞的存活率；且蛋白酶首先是从组织由内向外消化，组织块大的话，会导致外层细胞消化时间过长增加死亡率，同时内部细胞还没有得到充分消化，从而使细胞得率降低。
(5)本方法利用蛋白酶pronase消化的同时还进行机械裂解，即将含有目的组织的HABG放入37℃恒温摇床中，150rpm摇30min进行组织消化，转速一般在120rpm-200rpm之间。
(6)在15mL离心管中加入细胞梯度分离液时，预先将离心管内壁湿润，可使用HABG或者血清湿润，以减少离心管壁的表面张力，使液体突然流下造成各层液面混合而影响分离效果。
(7)离心分离细胞时应使用水平转子的离心机，定角转子的分离效果较差。
(8)使用枪头吹打组织时应先将枪头的尖端在酒精灯上抛光，使枪头的尖端光滑防止伤害细胞，约5s吹打一个来回，共吹打10次，吹打过程中不要产生气泡，切记一定要轻轻吹打，防止伤害细胞；如果死亡率超过预想值或者最后的细胞碎片依然较多，降低减少吹打次数，但是细胞得率会降低，组织量就要相应增加。
(9)如果第三层的细胞数能满足实验需求，舍弃第二层的神经元，因为第二层同时也含有大量的杂质碎片，会影响后续的细胞分离效率。
(10)分离得到的细胞取20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，以便观察细胞的死亡率。
如图1所示，使用本发明得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的细胞图片，10mg脑组织得到的平均细胞密度是1.41×107/mL，细胞平均存活率88％。
如图2所示，使用本方法得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的神经元细胞直径分布图，细胞的平均直径为6.47μm。
如图3所示，使用本方法得到的神经元单细胞，在梯度分离的第三层中吸取的1.5mL神经元中吸出20μL加入终浓度为0.2％的台盘蓝，等待2min后利用countstar测量得到的细胞聚团分布图，只有少量的细胞是双细胞团聚，有极少数的细胞发生了多细胞团聚，但是机率很低，满足单细胞测序的要求。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种制备成熟神经元单细胞的方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：
(1)获取目的动物组织，所述目的动物组织中含目的动物神经细胞；
(2)将切碎后的目的动物组织与HABG消化缓冲液混合，每3-8mg组织添加1mL HABG，进行组织消化，消化条件为33-37℃恒温，100-200rpm消化20-50min；
(3)将消化后的组织进行离心，留沉淀，加入HABG消化缓冲液吹打沉淀；
(4)将(3)中获得的溶液中的未被消化的组织及大的碎片过滤掉；
(5)将(4)中获得的含有细胞的HABG溶液加入到细胞梯度分离液中，含有目的动物神经细胞的HABG溶液和梯度分离液的体积比为(3:2)-(2:1)，混匀后离心。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中将消化好的组织于180-200g，3-5℃离心5-8min。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中将预先用D-PBS浸润过的10-100μm的筛网套至干净的离心管中，将上述含有目的动物神经细胞的HABG溶液加入筛网中过滤未被消化的组织及大的碎片。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中获取目的组织的方法包括：将小鼠麻醉，利用冰上预冷的D-PBS进行心脏灌流至流出液体为无色，在冰上迅速取出小鼠大脑或脊髓，切取目的区域，迅速将所取区域切碎。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中加入细胞梯度分离液后600-1000g，20-24℃离心12-18min。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)离心后弃去最靠近管口的一层液体，取剩余溶液中从管口至管底的第三层。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，细胞梯度分离液现配现用。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中离心管中加入细胞梯度分离液时，预先将离心管内壁湿润。
9.如权利要求1或2或5或6所述的方法，其特征在于，离心分离细胞时使用水平转子的离心机。
10.权利要求1-9任一所述的方法在单细胞测序分析或者成熟神经元培养方面的应用。
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