CN105219644A - 温度敏感型细胞培养表面及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种温度敏感型细胞培养表面及其制备方法。该制备方法包括如下步骤：(1)配制温敏原液：将温敏化合物和自由基引发剂加入至溶剂中，搅拌溶解，得温敏原液，所述温敏化合物与所述溶剂的质量比为(2-50)：100，所述自由基引发剂与所述温敏化合物的摩尔比为(0.5-50)：100；(2)将所述温敏原液分布于细胞培养表面后，将该细胞培养表面置于50-150℃条件下反应5-120min，即可。该制作方法利用普通的化学自由基引发剂直接引发温敏化合物在细胞培养表面接枝聚合，即可获得具有温度敏感性应答功能的细胞培养表面，且较现有技术极大的降低了温度敏感型细胞培养表面的生产成本，接枝率高，环境友好。

Description

温度敏感型细胞培养表面及其制备方法
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，特别是涉及一种温度敏感型细胞培养表面及其制备方法。
背景技术
近年来，组织再生工程、生物医学工程、细胞治疗行业技术飞速发展，通过将动物或人体细胞在体外进行大规模培养的方式来获得大量细胞、细胞胞外分泌物、细胞治疗产品已成为目前细胞临床应用的重要方向。例如组织创伤、烧伤治疗中皮肤细胞的培养和新皮肤的获得、肿瘤的细胞治疗、细胞美容、细胞减肥等，都需要对目标细胞进行体外培养。
细胞按照其体外培养的特性主要分为悬浮细胞和贴壁细胞，悬浮细胞是悬浮于培养装置中培养液里面的，贴壁细胞的生长需要粘附在培养装置的表面才能生长。当贴壁细胞培养结束后，主要采用胰蛋白酶消化的方式从粘附表面将其处理下来完成收集，而这种消化方法会破坏细胞表面的膜蛋白，进而破坏细胞的完整性，失去完整性的细胞其应用受到极大的限制，尤其是在细胞临床应用领域。
目前市场上已有商品化的温度敏感型细胞培养表面，主要通过将温敏材料接枝到培养装置的表面来实现。该种表面能够在细胞培养结束后，通过改变温度使细胞自动脱落下来，减小对细胞的损伤。
现有的温度敏感性型细胞培养表面的制备方法中，部分通过直接在细胞培养装置表面物理涂布温敏化合物的方式，这种方式实现的温度敏感响应功能不稳定，在培养过程中，温敏化合物会脱落下来，因此细胞自动脱落效果无法保证；其它大部分是通过高能电子束引发温敏化合物在细胞培养表面的接枝，少部分采用紫外光辐照引发接枝、或者等离子引发接枝、或者原子转移自由基引发接枝，这些实现培养表面温敏化合物接枝的方式中，有的生产装备昂贵(例如高能电子束、等离子)，有的工艺复杂、所需原料成本高不利于产业化(例如原子转移自由基引发、紫外光辐照引发)，有的接枝效率低、环境污染严重(如等离子)。
发明内容
基于此，有必要提供一种接枝率高，生产成本低且环境友好的温度敏感型细胞培养表面的制备方法。
一种温度敏感型细胞培养表面的制备方法，包括如下步骤：
(1)配制温敏原液：将温敏化合物和自由基引发剂加入至溶剂中，搅拌溶解，得温敏原液，所述温敏化合物与所述溶剂的质量比为(2-50)：100，所述自由基引发剂与所述温敏化合物的摩尔比为(0.5-50)：100；
(2)将所述温敏原液分布于细胞培养表面后，将该细胞培养表面置于50-150℃条件下反应5-120min，即得所述温度敏感型细胞培养表面。
根据需要，步骤(2)所述反应可在氮气保护下进行。
在其中一个实施例中，步骤(2)所述分布的方法为浸渍、雾化、喷涂或涂抹。
在其中一个实施例中，所述浸渍的方法为：将所述细胞培养表面浸渍在所述温敏原液中0.1-60min，然后取出；
所述雾化的方法为：先将所述温敏原液雾化为粒径在2-1000微米的颗粒，再将所述细胞培养表面曝露在所述雾化的氛围中5-100min，然后取出；
所述喷涂的方法为：利用高压喷涂或空气喷涂将所述温敏原液喷涂在所述细胞培养表面。
在其中一个实施例中，所述温敏化合物为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺低聚物、N-异丙基甲基丙烯酰胺低聚物中的一种或多种；制备所述细胞培养表面的材料为聚烯烃或聚羧酸酯。
在其中一个实施例中，所述聚烯烃为聚苯乙烯、聚丙烯或聚乙烯；所述聚羧酸酯为聚碳酸酯、聚脂肪酸酯、聚芳香酸酯或聚丙烯酸酯。
在其中一个实施例中，所述自由基引发剂为过氧化物类引发剂(如过氧化苯甲酰、过氧化异丙苯、过硫酸钾、叔丁基过氧化物等)、偶氮类引发剂(如偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁脒盐酸盐(AIBA)，偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐(AIBI)等)中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述溶剂为醇类(如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇)、酯类(如甲酸酯类如甲酸甲酯、甲酸乙酯、甲酸丙酯、甲酸丁酯；乙酸酯类如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯)、酮类(丙酮、丁酮等)、氯代烃类(氯仿、二氯甲烷、氯乙烷等)中的一种或多种。
本发明还提供所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法制备得到的温度敏感型细胞培养表面。
本发明还提供具有所述的温度敏感型细胞培养表面的细胞培养装置。
在其中一个实施例中，所述细胞培养装置为细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养皿、设置有多层纤维组成的三维网状结构的细胞培养装置或设置有颗粒微载体的细胞培养装置。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，合理配置所述温敏原液中温敏化合物和自由基引发剂的浓度，并将该温敏原液分布于细胞培养表面，可利用普通的化学自由基引发剂直接引发温敏化合物在细胞培养表面的接枝聚合，获得具有温度敏感性应答功能的细胞培养表面，相对于高能电子束和等离子接枝，无需购买大型昂贵设备，温敏原料用量低，接枝效率高；相对于紫外光辐照和原子转移自由基引发，引发剂原料来源广泛、成本低、工艺原理便于大规模制备。本发明制备的温敏细胞培养表面使贴壁型细胞培养结束后能够通过温度降低而实现温敏性脱落，减少化学消化脱落或者物理方法脱落对细胞造成的伤害，保证细胞膜蛋白的完整性，且较现有技术极大的降低了温度敏感型细胞培养表面的生产成本，接枝率高，环境友好。
进一步地，在对该制作方法的研究中发现，温敏原液的分布方式对最终的接枝率具有较为关键的影响，本发明优选为采用特定条件的浸渍、雾化、喷涂方式实现温敏原液在细胞培养表面的接枝，可有效提高接枝率。
附图说明
图1为利用本发明一实施例所述温度敏感型细胞培养表面将T3T细胞在37℃培养48小时后细胞贴附于装置表面的显微镜照片；
图2为将图1所述温度敏感型细胞培养表面在20℃处理10-40分钟后细胞成片自动脱附的显微镜照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的温度敏感型细胞培养表面及其制备方法作进一步详细的说明。
实施例1:
称取0.5gN-异丙基丙烯酰胺单体、与单体摩尔比为5：100的偶氮类引发剂溶解在7.5g异丙醇和乙酸乙酯的混合溶剂中；然后采用雾化器将该混合物溶液雾化为粒径在2-1000微米的颗粒，然后将欲处理的聚苯乙烯材料的细胞培养板表面暴露在该雾化汽氛围中50分钟使雾汽在欲处理的表面凝结，最后将其放置在充满氮气的烘箱中，在50-120℃保温50分钟后取出，即得具有温度敏感型细胞培养表面的细胞培养板，接枝率2.2μg/cm2。
实施例2：
称取0.7gN-异丙基甲基丙烯酰胺单体、与单体摩尔比为20：100的过氧化物类引发剂溶解在10g乙醇和甲酸丙酯、二氯甲烷混合溶剂中，然后采用高压喷涂将温敏混合物溶液均匀地喷涂在聚丙烯材料的细胞培养皿表面，最后将其放置在充满氦气的烘箱中，在90-120℃保温20分钟后取出，即得具有温度敏感型细胞培养表面的细胞培养皿，接枝率1.7μg/cm2。
实施例3：
称取0.6gN-异丙基丙烯酰胺单体、与单体摩尔比为30：100的偶氮类引发剂溶解在6g异丙醇、乙酸丁酯和二氯甲烷混合溶剂中，然后采用空气喷涂将该混合物溶液喷涂在聚苯乙烯材料的细胞培养瓶表面，然后将其放置在充满空气的烘箱中，在50-120℃保温30分钟后取出，即得具有温度敏感型细胞培养表面的细胞培养瓶，接枝率1.5μg/cm2。
实施例4：
称取3.5gN-异丙基丙烯酰胺单体、与单体摩尔比为40：100的偶氮类引发剂溶解在7g氯乙烷、乙醇和甲酸乙酯混合溶剂中，然后采用高压空气雾化法将该混合物溶液雾化为粒径在2-1000微米的颗粒，然后将欲处理的粒径为40-500微米的聚乙烯制备的微球载体暴露在该雾化汽氛围中10分钟使雾汽在欲处理微球载体表面凝结，最后将其放置在充满氮气的烘箱中，在50-120℃保温60分钟后取出，即得具有温度敏感型细胞培养表面的微球载体，接枝率1.6μg/cm2。
该球形颗粒微载体可放置于常规的细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿中，加入培养液，以细小的颗粒作为细胞粘附生长的载体，通过搅拌悬浮在培养液内，使细胞在载体表面繁殖成单层细胞。由于在该颗粒微载体上实现了温敏接枝，与常规的细胞培养板、瓶、皿等细胞培养器配套使用，成为温度敏感型的细胞培养装置。
实施例5：
称取0.3gN-异丙基丙烯酰胺单体、与单体摩尔比为1：100的过氧化物类引发剂溶解6g乙醇和乙酸乙酯、丙酮的混合溶剂中，然后将欲处理的聚碳酸酯制备的多层纤维三维网状多孔支架浸渍在温敏混合溶液中0.1-60分钟，然后取出风干，最后将其放置在充满氮气的烘箱中，在80-150℃保温30分钟后取出，即得具有温度敏感型细胞培养表面的多层纤维三维网状多孔支架，接枝率1.5μg/cm2。
该多层纤维三维网状多孔支架为多层网状结构，可以作为多层的温敏支架置于常规的细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿内，在不改变与之配套的常规的细胞培养板、细胞培养瓶或细胞培养皿的规格的前题下，成倍增加细胞贴壁生长的比表面积，在有限的体积下收获更多的细胞。
将实施例1制作得到的温度敏感型细胞培养装置用于T3T细胞培养，T3T细胞在37℃培养48小时后细胞贴附显微镜照片如图1所示；然后在20℃处理10-40分钟后细胞成片自动脱附的显微镜照片如图2所示。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)配制温敏原液：将温敏化合物和自由基引发剂加入至溶剂中，搅拌溶解，得温敏原液，所述温敏化合物与所述溶剂的质量比为(2-50)：100，所述自由基引发剂与所述温敏化合物的摩尔比为(0.5-50)：100；
(2)将所述温敏原液分布于细胞培养表面后，将该细胞培养表面置于50-150℃条件下反应5-120min，即得所述温度敏感型细胞培养表面。
2.根据权利要求1所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述分布的方法为浸渍、雾化、喷涂或涂抹。
3.根据权利要求2所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述浸渍的方法为：将所述细胞培养表面浸渍在所述温敏原液中0.1-60min，然后取出；
所述雾化的方法为：先将所述温敏原液雾化为粒径在2-1000微米的颗粒，再将所述细胞培养表面曝露在所述雾化的氛围中5-100min，然后取出；
所述喷涂的方法为：利用高压喷涂或空气喷涂将所述温敏原液喷涂在所述细胞培养表面。
4.根据权利要求1所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述温敏化合物为N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺低聚物、N-异丙基甲基丙烯酰胺低聚物中的一种或多种；制备所述细胞培养表面的材料为聚烯烃或聚羧酸酯。
5.根据权利要求4所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述聚烯烃为聚苯乙烯、聚丙烯或聚乙烯；所述聚羧酸酯为聚碳酸酯、聚脂肪酸酯、聚芳香酸酯或聚丙烯酸酯。
6.根据权利要求1-5任一项所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述自由基引发剂为过氧化物类引发剂和/或偶氮类引发剂。
7.根据权利要求1-5任一项所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法，其特征在于，所述溶剂为醇类、酯类、酮类、氯代烃类中的一种或多种。
8.权利要求1-7任一项所述的温度敏感型细胞培养表面的制备方法制备得到的温度敏感型细胞培养表面。
9.具有权利要求8所述的温度敏感型细胞培养表面的细胞培养装置。
10.根据权利要求9所述的细胞培养装置，其特征在于，该细胞培养装置为细胞培养板、细胞培养瓶、细胞培养皿、设置有多层纤维组成的三维网状结构的细胞培养装置或设置有颗粒微载体的细胞培养装置。
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