CN115181730A - 一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法 - Google Patents

一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法，包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10‑100ng/ml的EGF，20‑500ng/ml的Noggin，20‑500ng/ml的R‑spondin 1，20‑500ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1‑50ng/ml的SCF，10‑200ng/ml的IGF‑1，1‑50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。本发明培养基可以成功培养出胃间质瘤类器官，该类器官可以用于后续的药敏实验，可用于胃间质瘤组织的生理病理研究以及后续的基因治疗，为再生医学提供稳定的类器官研究材料。

Description

一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其是涉及一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法。
背景技术
胃间质瘤是消化道最常见的具有多向分化潜能的间叶组织源性肿瘤，是临床上较为常见的具有潜在恶性的消化系统肿瘤，其发病原因目前尚不十分清楚，认为可能与生活环境及其经常食用霉变、腌制、熏烤食物或食盐过多等饮食习惯有关，与遗传因素也有关系。在早期，肿瘤体积较小时无明显症状。伴随着瘤体的不断增大，可能导致胃部溃疡发生，病人可能会出现包括腹胀、腹痛、黑便和贫血的临床症状，但这些症状无特异性，不容易与其他疾病相鉴别，且直径小于2cm的胃小间质瘤一般无任何临床症状。
胃间质瘤的良恶性，常常与病变的大小密切相关，大多数小的间质瘤是良性的，仅仅表现为非常缓慢的生长，不会引发不适，也不会危及患者的生命健康。而大的间质瘤常常恶性程度高，容易转移复发。但大的间质瘤也是由小的间质瘤逐渐长大发展而来的，极少数小间质瘤在生长过程中会逐渐出现恶性肿瘤的特征，而且何时发生突变也难以预料，恶变时表现为快速生长，到后期合并溃疡、出血，甚至出现远处转移，危及生命。因此，研究其结构与功能将有助于帮助我们了解胃间质瘤的发病机制，从而为疾病的预防、控制和诊疗奠定坚实的基础。
类器官(Organoids)是衍生于干细胞或前体细胞的器官特异性细胞集合。体外培养的类器官在细胞成分和组织架构上与对应器官高度相似，并具备相应的功能学特征。与常规细胞培养在二维环境中培养单一细胞类群不同，类器官培养是在三维环境中培养出特定组织器官包含的多种细胞类群，其培养体系与体内微环境更为相似。因此，在各种器官生理病理的基础研究、精准医疗、药物筛选和开发、基因治疗、再生医学等方面，显示出巨大的应用前景。
虽然多种人源其他组织如肝脏、肠等使用不同的方法、不同的培养条件下可在体外成功培养成功为类器官，但是由于胃间质瘤的发生率相对来说比较罕见，因此，目前还没有关于胃间质瘤类器官的培养方法的研究及报道。
发明内容
有鉴于此，有必要针对上述问题，提供一种胃间质瘤类器官培养基及培养方法。
为了解决现有技术存在的问题，本发明采用的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种胃间质瘤类器官培养基，包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10-100ng/ml的EGF，20-500ng/ml的Noggin，20-500ng/ml的R-spondin 1，20-500ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1-50ng/ml的SCF，10-200ng/ml的IGF-1，1-50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
进一步地，按照终浓度组成，所述抑制剂包括：100-2000nM的CHIR99021，1-40μM的A83-01，2-50μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
进一步地，按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10ng/ml的EGF，20ng/ml的Noggin，20ng/ml的R-spondin 1，20ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1ng/ml的SCF(stem cell factor)，10ng/ml的IGF-1，50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，所述抑制剂包括：100nM的CHIR99021，1μM的A83-01，50μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
第二个方面，本发明提供一种胃间质瘤类器官培养方法，包括以下步骤：
①将新鲜来源的手术切除标本进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，收集细胞沉淀备用；
②取适量胃间质瘤类器官培养基，重悬步骤①获得的细胞沉淀，得到细胞悬液；
③将步骤②获得的细胞悬液滴加到细胞培养装置中，在转速为20-200rpm，温度为37℃，CO2浓度为5％的环境下进行培养；
④每隔2-3天更换一次胃间质瘤类器官培养基，培养4-7天后，得到胃间质瘤类器官。
进一步地，所述步骤①的预处理步骤包括：将标本经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液，直至将标本消化成大部分为3-50个细胞的细胞团后，加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质。
进一步地，所述步骤②中是按每1-10×105细胞使用2ml培养基重悬步骤①获得的细胞沉淀。
进一步地，所述步骤②中是按每2×105细胞使用2ml培养基重悬步骤①获得的细胞沉淀。
进一步地，所述步骤③中是将细胞培养装置置于摇床上。
进一步地，所述摇床转速为100rpm。
进一步地，所述细胞培养装置是30mm超低粘附培养皿。
本发明的有益效果是：
本发明一种胃间质瘤类器官培养基，是由基础细胞因子、胃间质瘤特异因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶进行复配获得的，该培养基细胞活性高、数量多，培养过程稳定。本发明培养基通过悬浮培养，可以成功培养出胃间质瘤类器官，该类器官可以用于后续的药敏实验，可用于胃间质瘤组织的生理病理研究以及后续的基因治疗，为肿瘤精准医疗提供稳定的类器官研究材料。
附图说明
图1为实施例4中培养的胃间质瘤类器官光镜图；
图2为实施例4中培养的胃间质瘤类器官HE染色鉴定图；
图3为实施例6中培养的胃间质瘤类器官光镜图；
图4为实施例6中培养的胃间质瘤类器官HE染色鉴定图；
图5为实施例7中培养的胃间质瘤类器官光镜图；
图6为实施例7中培养的胃间质瘤类器官HE染色鉴定图；
图7为实施例8中传代后的胃间质瘤类器官光镜图；
图8为实施例9中传代后的胃间质瘤类器官光镜图；
图9为实施例10中传代后的胃间质瘤类器官光镜图。
具体实施方式
本发明实施例采用的EGF购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的Noggin购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的R-spondin 1购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的Wnt3a购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的SCF(stem cell factor)购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的IGF-1购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的CCBE1购自Sigma-Aldrich公司；
本发明实施例采用的原代细胞抗生素购自美国Invivogen公司；
本发明实施例采用的Matrigel购自美国corning公司；
本发明实施例采用的DMEM/F12培养液购自赛默飞公司；
本发明实施例采用的CHIR99021购自MedChemExpress公司；
本发明实施例采用的A83-01购自MedChemExpress公司；
本发明实施例采用的Y-27632dihydrochloride购自MedChemExpress公司。
在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面结合附图和具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
实施例1
本实施例提供一种胃间质瘤类器官培养基,包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10ng/ml的EGF，20ng/ml的Noggin，20ng/ml的R-spondin 1，20ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1ng/ml的SCF(stem cell factor)，10ng/ml的IGF-1，50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，所述抑制剂包括：100nM的CHIR99021，1μM的A83-01，50μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
实施例2
本实施例提供一种胃间质瘤类器官培养基,包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：50ng/ml的EGF，100ng/ml的Noggin，100ng/ml的R-spondin 1，100ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括30ng/ml的SCF(stem cell factor)，100ng/ml的IGF-1，30ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，所述抑制剂包括：700nM的CHIR99021，20μM的A83-01，30μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
实施例3
本实施例提供一种胃间质瘤类器官培养基，包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：100ng/ml的EGF，500ng/ml的Noggin，500ng/ml的R-spondin 1，500ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括50ng/ml的SCF(stem cell factor)，200ng/ml的IGF-1，1ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，所述抑制剂包括：2000nM的CHIR99021，40μM的A83-01，2μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
实施例4
本实施例提供一种胃间质瘤类器官培养方法，包括以下步骤：
①将新鲜来源的胃间质瘤手术切除标本进行预处理：将标本经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液，直至将标本消化成大部分为3-50个细胞的细胞团后，加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心去除上清，收集细胞沉淀备用；
②取适量的实施例1所述的培养基，按每2×105细胞使用2ml培养基重悬细胞沉淀，得到细胞悬液；
③用移液器将细胞悬液滴加到30mm超低粘附培养皿中；将30mm超低粘附培养皿置于摇床上，启动摇床，摇床转速为100rpm。然后将30mm超低粘附培养皿置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2浓度下培养；
④每隔2天更换一次培养基，培养5天后，得到胃间质瘤类器官如图1所示。
实施例5
本实施例提供一种胃间质瘤类器官形态鉴定方法，本实施例是对实施例4获得的胃间质瘤类器官形态进行鉴定，将其进行石蜡包埋、切片，然后进行HE染色观察，具体步骤如下：
1)类器官收集与固定：收集实施例4制备的胃间质瘤类器官，4％的多聚甲醛溶液固定2小时。固定完成后1200rpm离心5min，弃去多聚甲醛固定液。
2)梯度脱水：将固定后的类器官依次浸入体积浓度为85％酒精、95％酒精和100％酒精中各脱水30min。
3)透明浸蜡：将梯度脱水后的类器官中加入二甲苯，使其没过类器官处理20min，该步骤重复两次；然后在60℃的石蜡中浸蜡1.5h。
4)包埋切片：用包埋模具包裹类器官，然后用切片机将其切成4-6μm的切片，用防脱载玻片进行收集。
5)烤片：将上述载玻片置于玻片架上，放入烘箱中65℃烘烤30min，直至将载玻片上的水分烤干、石蜡烤融即可。
6)脱蜡：使用二甲苯将上述载玻片脱蜡三次，每次10min；然后用100％酒精润洗三次，每次1分钟；最后用流水浸洗1分钟。
7)H&E染色：先用苏木素染色8min，再水洗1min，接着置于1％盐酸酒精1-2秒钟，然后再用流水冲洗30min，再接着用1％伊红浸染1-2min，最后用流水冲洗1min。
8)染色后固定：依次浸入95％酒精和100％酒精，该步骤重复两次，每次2min。
9)透明及封固：使用二甲苯透明2min，取出晾干后用中性树胶封固。本实施例所述百分含量均为体积浓度。
10)在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图2所示。
实施例6
本实施例提供一种胃间质瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
①将新鲜来源的胃间质瘤手术切除标本进行预处理：将标本经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液，直至将标本消化成大部分为3-50个细胞的细胞团后，加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心去除上清，收集细胞沉淀备用；
②取适量的实施例2所述的培养基，按每6×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
③用移液器将细胞悬液滴加到30mm超低粘附培养皿中；将30mm超低粘附培养皿置于摇床上，启动摇床，摇床转速为150rpm。然后将30mm超低粘附培养皿置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2浓度下培养；
④每隔3天更换一次培养基，培养6天后，得到胃间质瘤类器官在光镜下如图3所示。
采用实施例5的鉴定方法对本实施例获得的胃间质瘤类器官形态进行鉴定，将其进行石蜡包埋、切片，然后进行HE染色观察，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图4所示。
实施例7
本实施例提供一种胃间质瘤类器官的培养方法，包括以下步骤：
①将新鲜来源的胃间质瘤手术切除标本进行预处理：将标本经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液，直至将标本消化成大部分为3-50个细胞的细胞团后，加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质，离心去除上清，收集细胞沉淀备用；
②取适量的实施例3所述的培养基，按每4×105细胞使用2ml培养基重悬细胞，得到细胞悬液；
③用移液器将细胞悬液滴加到30mm超低粘附培养皿中；将30mm超低粘附培养皿置于摇床上，启动摇床，摇床转速为50rpm。然后将30mm超低粘附培养皿置于恒温培养箱中，在37℃，5％CO2浓度下培养；
④每隔3天更换一次培养基，培养6天后，得到胃间质瘤类器官如图5所示。
采用实施例5的鉴定方法对本实施例获得的胃间质瘤类器官形态进行鉴定，将其进行石蜡包埋、切片，然后进行HE染色观察，在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图6所示。
实施例8
胃间质瘤类器官的多次传代：
按照实施例4得到胃间质瘤类器官后，对其进行传代培养，传代培养操作如下：
①将实施例4得到胃间质瘤类器官在普通光学显微镜下进行观察，拍照后弃去其培养基，保留胶滴，然后加入TrypLE消化液消化5分钟。
②消化期间实时进行镜下观察，待其消化成3-50个细胞的细胞团后终止消化，1200rpm离心3分钟收集细胞沉淀。
③取适量的DMEM/F12培养基与Matrigel基质胶按1：1.3的比例混匀后重悬上述细胞沉淀，均匀将胶滴铺至板底，凝固9min后倒置固定20min。
④向培养皿内加入实施例1液体培养基，培养基液面使胶滴完全浸没，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
⑤培养5天后，得到传代后的胃间质瘤类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图7所示，经过传代后类器官结构形态良好。
实施例9
胃间质瘤类器官的多次传代：
按照实施例6得到胃间质瘤类器官后，对其进行传代培养，传代培养操作如下：
①将实施例6得到胃间质瘤类器官在普通光学显微镜下进行观察，拍照后弃去其培养基，保留胶滴，然后加入TrypLE消化液消化5分钟。
②消化期间实时进行镜下观察，待其消化成3-50个细胞的细胞团后终止消化，1200rpm离心3分钟收集细胞沉淀。
③取适量的DMEM/F12培养基与Matrigel基质胶按1：1.3的比例成混匀后重悬上述细胞沉淀，均匀将胶滴铺至板底，凝固9min后倒置固定20min。
④向培养皿内加入实施例2液体培养基，使液面完全浸没胶滴，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
⑤培养6天后，得到传代后的胃间质瘤类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图8所示，经过传代后类器官结构形态良好。
实施例10
胃间质瘤类器官的多次传代：
按照实施例7得到胃间质瘤类器官后，对其进行传代培养，传代培养操作如下：
①将实施例7得到胃间质瘤类器官在普通光学显微镜下进行观察，拍照后弃去其培养基，保留胶滴，然后加入TrypLE消化液消化5分钟。
②消化期间实时进行镜下观察，待其消化成3-50个细胞的细胞团后终止消化，1200rpm离心3分钟收集细胞沉淀。
③取适量的DMEM/F12培养基与Matrigel基质胶按1：1.3的比例成混匀后重悬上述细胞沉淀，均匀将胶滴铺至板底，凝固9min后倒置固定20min。
④向培养皿内加入实施例3液体培养基，使液面完全浸没胶滴，然后置于恒温培养箱在37℃，5％CO2浓度下培养。
⑤培养6天后，得到传代后的胃间质瘤类器官，其在普通光学显微镜下观察组织形态结构如图9所示，经过传代后类器官结构形态良好。
对比例1
本对比例提供的胃间质瘤类器官培养基中，不添加CCBE1，其余同实施例1。
使用上述培养基按照实施例4的方法进行胃间质瘤类器官培养。
结果培养7天后，细胞呈分散状态，无法形成胃间质瘤类器官。说明CCBE1对胃间质瘤类器官的形成至关重要。
对比例2
本对比例提供的胃间质瘤类器官培养基中，不添加SCF，其余同实施例1。
使用上述培养基按照实施例4的方法进行胃间质瘤类器官培养。
结果培养5天后，细胞活性差，无法形成胃间质瘤类器官。说明SCF对胃间质瘤类器官的培养至关重要。
对比例3
本对比例提供的胃间质瘤类器官培养基中，不添加IGF-1，其余同实施例1。
使用上述培养基按照实施例4的方法进行胃间质瘤类器官培养。
结果培养5天后，细胞逐渐凋亡。说明IGF-1对胃间质瘤类器官的生长至关重要。
对比例4
本对比例提供一种胃癌类器官培养方法，采用实施例1的类器官培养基、实施例4的类器官培养方法进行胃癌类器官培养。
结果培养7天后，培养的细胞活性差，无法形成胃癌类器官。传代3天后细胞逐渐凋亡，说明本发明培养基不适用于胃癌类器官培养。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种胃间质瘤类器官培养基，其特征在于：包括基础细胞因子、特异性细胞因子、抑制剂、原代细胞抗生素和基质胶；按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10-100ng/ml的EGF，20-500ng/ml的Noggin，20-500ng/ml的R-spondin 1，20-500ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1-50ng/ml的SCF，10-200ng/ml的IGF-1，1-50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
2.根据权利要求1所述的一种胃间质瘤类器官培养基，其特征在于，按照终浓度组成，所述抑制剂包括：100-2000nM的CHIR99021，1-40μM的A83-01，2-50μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
3.根据权利要求2所述的一种胃间质瘤类器官培养基，其特征在于，按照终浓度组成，所述基础细胞因子包括：10ng/ml的EGF，20ng/ml的Noggin，20ng/ml的R-spondin 1，20ng/ml的Wnt3a；所述特异性细胞因子包括1ng/ml的SCF，10ng/ml的IGF-1，50ng/ml的CCBE1，所述原代细胞抗生素浓度为100ug/ml；所述基质胶为体积浓度为1％的Matrigel，所述抑制剂包括：100nM的CHIR99021，1μM的A83-01，50μM的Y-27632dihydrochloride，以上成分均溶于DMEM/F12培养基中。
4.一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：包括以下步骤：
①将新鲜来源的手术切除标本进行预处理，得到细胞数量为3-50个细胞的细胞团后，离心去除上清，收集细胞沉淀备用；
②取适量胃间质瘤类器官培养基，重悬步骤①获得的细胞沉淀，得到细胞悬液；
③将步骤②获得的细胞悬液滴加到细胞培养装置中，在转速为20-200rpm，温度为37℃，CO2浓度为5％的环境下进行培养；
④每隔2-3天更换一次胃间质瘤类器官培养基，培养4-7天后，得到胃间质瘤类器官。
5.根据权利要求4所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述步骤①的预处理步骤包括：将标本经过多次生理盐水洗涤后切碎，加入消化液，直至将标本消化成大部分为3-50个细胞的细胞团后，加入HBSS缓冲液稀释并滤除残渣和杂质。
6.根据权利要求4所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述步骤②中是按每1-10×105细胞使用2ml培养基重悬步骤①获得的细胞沉淀。
7.根据权利要求6所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述步骤②中是按每2×105细胞使用2ml培养基重悬步骤①获得的细胞沉淀。
8.根据权利要求4所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述步骤③中是将细胞培养装置置于摇床上。
9.根据权利要求8所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述摇床转速为100rpm。
10.根据权利要求9所述的一种胃间质瘤类器官培养方法，其特征在于：所述细胞培养装置是30mm超低粘附培养皿。
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