CN107075444B - 制备胚状体形成用容器的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于提供一种制备胚状体的形成性优异、适合光学观察的胚状体形成用容器的方法。本发明的发明人们发现，通过经过以特定量将侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物赋予于容器内面，使其干燥，形成涂布膜；之后通过特定量的处理液将涂布膜流平，这样的两个工序，能够制备有效地形成胚状体、且光学观察性优异的胚状体形成用容器，从而完成本发明。

Description

制备胚状体形成用容器的方法
技术领域
本发明涉及一种制备形成胚状体时使用的胚状体形成用容器的方法。
本申请请求通过参照而被引用于此的日本申请特愿2014-224752号的优先权。
背景技术
胚胎干细胞及成体干细胞等干细胞具有在试管内分化为各种细胞的能力。作为使干细胞在试管内分化的方法，利用以下方法：通过对干细胞进行悬浮培养，以形成被称为胚状体的疑似胚体的方法；共同培养像基质细胞那样支持分化与增殖的细胞和干细胞的方法。其中，悬浮培养为在使干细胞在试管内分化时最广泛使用的方法。例如，鼠胚胎干细胞通过在不加入LIF(白血病抑制因子：leukemia inhibitory factor)的情况下，在培养皿等培养容器中，以不粘合的方式悬浮培养而形成细胞团块(細胞塊)。悬浮培养中所形成的细胞团块被称为胚状体(EB)。已知所得到的细胞团块之后分化为各种种类的细胞。
胚状体(EB)具有由两层细胞层构成的如球状的结构，外层相当于近端内胚层、内层相当于胚体外胚层。两个胚层通过基底膜而被隔开。胚状体的结构与作为鼠的6日胚胎的圆筒胚非常相似，在其极限内接近于胚胎的正常的发育阶段。在胚状体中，也会导致中胚层的诱导，还会发育心肌细胞、血液细胞，进一步会发育原始的血管网。此外，若使胚状体附着于培养皿，继续进行培养，则分化为各种种类的细胞。例如，包括神经细胞、角蛋白细胞、软骨细胞、脂肪细胞等。经过胚状体的形成而分化的细胞，不限于体细胞，最近确认到还会发生向生殖细胞谱系的分化。为了利用干细胞的多分化能，最好形成胚状体。
通常，作为形成细胞团块的技术，已知有在垂下的液滴中培养细胞的悬滴(Hanging drop)法、非专利文献1中记载的回转培养法及离心法。然而，这些方法的培养条件的设定较为烦杂。
专利文献1中，作为用于形成细胞团块的容器，公开了一种利用聚甲基丙烯酸羟乙酯或乙烯-乙烯醇共聚物等而形成的培养容器。
此外，专利文献2中，公开了一种对作为干细胞的一种的ES细胞进行悬浮培养而形成胚状体的方法。在专利文献2的形成胚状体的方法中，使用了以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器。专利文献2中虽然公开了一种用于通过该聚合物包覆胚状体形成用容器的方法，但并未进行详细的研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特开平6-327462号公报
专利文献2：国际公开第2005/001019号手册
非专利文献
非专利文献1：Biotechnol.J.2008,3,1172-1184
发明内容
本发明要解决的技术问题
以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器，存在由于涂布斑点导致细胞粘合性产生偏差的问题；或涂布膜厚较高时，在容器上产生涂布膜的图案，导致在确认胚状体的形成等的显微镜观察时，背景中拍摄到图案的问题。即，在以具有磷酸胆碱类似基团的聚合物包覆的胚状体形成用容器中，在胚状体形成及从胚状体分化的细胞的光学观察时存在问题。本发明的目的在于，解决该以往的胚状体形成用容器的问题。因此，本发明的目的在于，提供一种胚状体的形成性优异的、适合光学观察的胚状体形成用容器的制备方法。
解决技术问题的技术方法
本发明的发明人们发现，通过经过以特定的量将侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物赋予于容器内面，使其干燥，而形成涂布膜；之后，以特定的量使用处理液，将涂布膜流平，这样的两个工序，能够制备有效地形成胚状体、且光学观察性优异的胚状体形成用容器，从而完成本发明。
即，本发明由以下内容而组成。
1.一种制备胚状体形成用容器的方法，该容器用于使干细胞悬浮培养，以形成胚状体，其中，该方法包括：
对用于形成用于悬浮培养干细胞的区域的容器内面，使用混合有侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，以侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为0.1～10mg/cm2的方式进行涂布并干燥的工序(A)；以及
对通过工序(A)而制作的该容器内面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm2添加水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀后干燥的工序(B)。
[化学式1]
(式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；n为1～4的整数。)
2.根据上述1所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，进一步包括使用环氧乙烷气体对该容器的内面进行灭菌的工序(C)。
3.根据上述1或2所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为以式(2)所表示的含磷酸胆碱类似基团的单体(M)与其他单体的共聚物中的至少一种。
[化学式2]
(式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；R4表示碳原子数为1～6的烷基；R5表示氢原子或甲基；n为1～4的整数。)
4.根据上述3所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，其他单体包括(甲基)丙烯酸烷基酯或(甲基)丙烯酸缩水甘油酯。
5.根据上述1～4中任一项所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物。
6.根据上述1～5中任一项所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。
7.根据上述6所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物的摩尔比为10～90:90～10。
8.根据上述1～5中任一项所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物。
9.一种胚状体形成用容器，其由上述1～8中任一项所述的制备胚状体形成用容器的方法而被制备。
10.一种形成胚状体的方法，其使用用于使干细胞悬浮培养、以形成胚状体的胚状体形成用容器，其中，该方法包括：
准备胚状体形成用容器的工序(D)、以及在工序(D)的胚状体形成用容器内对胚胎干细胞进行悬浮培养的工序(E)，
所述胚状体形成用容器通过以下工序形成：
对用于形成用于悬浮培养干细胞的区域的容器内面，使用混合有侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，以侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为0.1～10mg/cm2的方式进行涂布并干燥的工序(A)；以及
对通过工序(A)而制作的该容器内面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm2添加水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀后干燥的工序(B)。
[化学式3]
(式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；n为1～4的整数。)
11.根据上述10所述的形成胚状体的方法，其中，其进一步包括在所述工序(B)之后，使用环氧乙烷气体对所述容器的内面进行灭菌的工序(C)。
12.根据上述10或11所述的形成胚状体的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为以式(2)所表示的含磷酸胆碱类似基团的单体(M)与其他单体的共聚物中的至少一种。
[化学式4]
(式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基、R4表示碳原子数为1～6的烷基，R5表示氢原子或甲基；n为1～4的整数。)
13.根据上述12所述的形成胚状体的方法，其中，其他单体包括(甲基)丙烯酸烷基酯或(甲基)丙烯酸缩水甘油酯。
14.根据上述10～13中任一项所述的形成胚状体的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物。
15.根据上述10～14中任一项所述的形成胚状体的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。
16.根据上述15所述的形成胚状体的方法，其中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物的摩尔比为10～90:90～10。
17.根据上述10～14中任一项所述的形成胚状体的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物。
发明效果
本发明的制备胚状体形成用容器的方法，与以往的方法相比，能够提供一种容器表面均质的胚状体形成用容器。通过本发明的制备方法而制作的胚状体形成用容器，胚状体形成效率优异、且光学观察性优异，为有用的胚状体形成用容器。
附图说明
图1为通过实施例3的胚状体形成用容器而形成的胚状体的相差显微镜照片的副本。
图2为通过比较例3的胚状体形成用容器而形成的胚状体的相差显微镜照片的副本。
具体实施方式
本发明为制备一种用于使干细胞悬浮培养、以形成胚状体的胚状体形成用容器的方法。本发明中，干细胞是指：具有自我复制能力和分化为各种细胞的能力(多分化能)的细胞。作为干细胞，可列举胚胎干细胞(ES细胞)、成体干细胞、人工多能性干细胞(iPS细胞)等。
本发明的制备胚状体形成用容器的方法包括以下的工序(A)以及工序(B)。
工序(A)为：将混合(溶解)有侧链上具有以以下式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液(以下简称为“含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液”)，以0.1～10mg/cm2的方式赋予并涂布在用于形成用于悬浮培养的区域的容器内面(内表面)上，进行干燥的工序。
[化学式5]
所述式(1)中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的、烷基或羟烷基；n为1～4的整数。
作为所述碳原子数为1～6的烷基，可列举例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、环己基、苯基等。作为所述碳原子数为1～6的羟烷基，可列举例如羟甲基、2-羟乙基、3-羟丙基、4-羟丁基、5-羟戊基、6-羟己基等。
通过上述工序(A)，能够在所需的容器内面上形成含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的涂布膜(赋予包覆层)，能够将该容器内面制作成具有磷酸胆碱类似基团的表面。
在工序(A)中，在将含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液赋予并涂布在所希望的容器内面上之后，即，在所希望的容器内面上形成由该溶液形成的溶液层之后，使该溶液层干燥。作为将含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液涂布在所希望的容器内面上的方法，可列举以下方法，例如，在含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液中对容器进行浸渍处理、打捞的方法；将含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液添加或注入到所希望的容器内面的方法；或将含有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液喷在所希望的容器内面上的方法。将含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液添加或注入到所希望的容器内面的方法，能够将侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物可靠地赋予于所希望的容器内面，且能够调整该溶液的涂布量，因而优选。此外，使容器内面干燥的方法，只要不损害本发明的目的，可使用任何方法。
作为将含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的溶液涂布在所希望的容器内面上的条件，以使侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为每1cm2容器内面为0.1～10mg(0.1～10mg/cm2)、优选为0.15～1mg的方式而赋予。若侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量小于0.1mg/cm2，则涂布变得不均匀，细胞粘合在容器内面上，胚状体形成变得不充分。此外，若侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量高于10mg/cm2，则会较大地产生涂布斑点，显微镜下的观察性差。进一步，通过在工序(A)之后进行的流平处理无法消除，导致表面产生图案。此外，由于原料成本也变大，因此缺乏实用性。
侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物，优选为以式(1)所表示的具有磷酸胆碱类似基团的聚合物，只要是具有磷酸胆碱类似基团的聚合物即可。侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物，例如优选为以式(2)所表示的含磷酸胆碱类似基团的单体(M)的均聚物、及该单体(M)与其他单体的共聚物中的至少一种，更优选为该单体(M)与其他单体的共聚物中的至少一种。
[化学式6]
上述式(2)中，R1、R2、R3及n与式(1)相同，R4表示碳原子数为1～6的烷基，R5表示氢原子或甲基。碳原子数为1～6的烷基的定义与式(1)相同。
作为以式(2)所表示的单体(M)，可列举例如，2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、3-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、4-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、5-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、6-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三乙基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三丙基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三丁基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三环己基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三苯基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丙基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)丁基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)戊基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯、2-((甲基)丙烯酰氧基)己基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯等。
作为以式(2)所表示的单体(M)，其中，优选2-((甲基)丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯，进一步，2-(甲基丙烯酰氧基)乙基-2’-(三甲基铵基)乙基磷酸酯(也称作2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱。以下简记为MPC)从获得性、以及防止干细胞向容器的粘合，表达胚状体形成能的方面出发而优选。
作为用于得到所述共聚物的其他单体，可列举疏水性单体、(甲基)丙烯酸-2-羟乙酯、(甲基)丙烯酸-2-羟丁酯、(甲基)丙烯酸-4-羟丁酯等含羟基的(甲基)丙烯酸酯；丙烯酸、甲基丙烯酸、苯乙烯磺酸、(甲基)丙烯酰氧基膦酸、2-羟基-3-(甲基)丙烯酰氧基丙基三甲基氯化铵等含离子性基团的单体；(甲基)丙烯酰胺、甲基丙烯酸氨基乙酯、(甲基)丙烯酸二甲氨基乙酯等含氮单体；聚乙二醇(甲基)丙烯酸酯、(甲基)丙烯酸缩水甘油酯或这些的两种以上的混合物等。
作为所述疏水性单体，例如可列举出，(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸丁酯、(甲基)丙烯酸-2-乙基己酯、(甲基)丙烯酸月桂酯、(甲基)丙烯酸十八酯等直链或支链(甲基)丙烯酸烷基酯；(甲基)丙烯酸环己酯等环状(甲基)丙烯酸烷基酯；(甲基)丙烯酸苄酯、(甲基)丙烯酸苯氧基乙酯等芳香族(甲基)丙烯酸酯；聚丙二醇(甲基)丙烯酸酯等疏水性聚亚烷基二醇(甲基)丙烯酸酯；苯乙烯、甲基苯乙烯、氯甲基苯乙烯等苯乙烯类单体；甲基乙烯基醚、丁基乙烯基醚等乙烯基醚类单体；乙酸乙烯酯、丙酸乙烯酯等乙烯酯类单体或这些的两种以上的混合物等。
所述共聚物中，来自单体(M)的结构单元，在共聚物的结构单元中为10摩尔％以上且为90摩尔％以下，优选为30摩尔％以上且为80摩尔％以下。若来自单体(M)的结构单元为10摩尔％以上且为90摩尔％以下，则能通过以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团包覆容器表面，充分发挥包覆效果。
在所述共聚物中含有来自作为其他单体的疏水性单体的结构单元时，来自疏水性单体的结构单元在共聚物的结构单元中优选为90摩尔％以下，特别优选为20～90摩尔％。具有来自疏水性单体的结构单元的共聚物，虽耐溶出性得以提高，但若来自疏水性单体的结构单元超过90摩尔％，则容器表面上的以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的包覆量变少，可能导致不能充分发挥包覆效果，因而不优选。
作为其他单体，若共聚物中含有来自除上述疏水性单体以外的单体的结构单元时，则耐溶出性得到提高，在培养基等中能够使用表面活性剂、有机溶剂，因而优选。例如，作为除疏水性单体以外的其他单体，使用了(甲基)丙烯酸缩水甘油酯的共聚物，能够与容器表面的氨基、羧基等进行反应，能够使该共聚物化学结合于所希望的表面上。所述共聚物中，来自除疏水性单体以外的其他单体的结构单元的比例优选为70摩尔％以下。
以式(2)所表示的含磷酸胆碱类似基团的单体(M)的均聚物、或该单体(M)与其他单体的共聚物的分子量，以重均分子量计通常为5,000～5,000,000，从能够有效地防止干细胞对容器的粘合，表现出胚状体形成能，提高聚合物的耐溶出性的方面出发，优选为10,000～2,000,000。重均分子量可以通过后述的实施例中所记载的方法而测定。
含有侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，只要是将侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物混合溶解于醇类溶剂中而成的溶液，可以为任意的溶液。作为醇类溶剂，优选低级醇，可列举例如，甲醇、乙醇、丙醇等或它们的混合物。
侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，虽优选为以下列举的化合物，但无特别限定。
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物、摩尔比为10～90:90～10的共聚物
2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物
本发明的制备胚状体形成用容器的方法，在经过工序(A)之后，还包含在形成于容器内面的、具有凹凸及斑点的涂布膜上，赋予水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀，对涂布膜进行干燥的工序(B)。在工序(B)中，通过在使用水/醇类介质溶液使通过工序(A)而形成的涂布膜溶胀之后，再次使其干燥，来进行流平处理。流平处理是指进行处理，使得涂布膜的露出表面平滑化并均质化，以使涂布膜为均匀的膜厚，而不形成凹凸或斑点。工序(B)中，通过使用水/醇类介质溶液，通过降低水/醇类介质溶液的蒸腾速度，进行流平处理。通常的流平处理中添加有诸如增稠剂或消泡剂的添加剂，但这些添加剂不具有本发明的效果。
在该容器内面的涂布膜上所添加的水/醇类介质溶液的量为15mg～250mg/cm2，优选为30～190mg/cm2。溶液的量只要在30mg～190mg/cm2的范围内，则溶液能够均匀地遍及涂布膜上，能够使涂布膜充分溶胀，进行流平处理。
工序(B)中的水/醇类介质溶液，只要能对工序(A)中所形成的涂布膜进行流平处理，可以为任意的水/醇类介质溶液。水/醇类介质溶液中所含有的醇类溶剂，优选为低级醇。水/醇类介质溶液可列举例如，水和甲醇、水和乙醇、水和2‐丙醇、或组合这些混合液而成的混合溶剂。水和醇类溶剂的比例，只要能够进行使通过工序(A)所得到的涂布膜的流平处理即可，但从蒸腾速度的关系出发，优选水为10～50重量％、醇类溶剂为50～90重量％。
本发明的制备胚状体形成用容器的方法，在经过工序(A)以及工序(B)之后，还优选包括对具有经均质化的涂布膜的容器内面进行灭菌的工序(C)。作为灭菌方法，只要不损害本发明的目的，则可使用任何灭菌方法。例如，可列举通过环氧乙烷气体(EOG)进行的灭菌处理、通过γ射线进行的灭菌处理、通过电子束进行的灭菌处理等，但通过EOG进行的灭菌处理与其他灭菌处理相比较，在抑制细胞粘合的方面优选。
本发明的胚状体形成用容器的形状，只要是可形成用于悬浮培养干细胞的区域的形状即可。作为胚状体形成用容器的形状，可使用平底、漏斗状的V底、半球状的圆底等容器，但优选为平底。作为本发明的胚状体形成用容器，可列举细胞培养皿、细胞培养用多盘(multidisc)、细胞培养板、细胞培养培养袋、细胞培养烧瓶等现有的塑料制细胞培养容器。为了得到适度大小的胚状体，优选为细胞培养皿或细胞培养板。胚状体形成用容器的材质，可列举聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、丙烯酸树脂。
在使用本发明的、用于使干细胞悬浮培养以形成胚状体的胚状体形成用容器的、形成胚状体的方法中，至少具备以下的工序(D)及(E)。
准备胚状体形成用容器的工序(D)，所述胚状体形成用容器通过以下工序形成：对用于形成用于悬浮培养干细胞的区域的容器内面，使用混合有侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，以侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为0.1～10mg/cm2的方式进行涂布、干燥的工序(A)；以及对通过工序(A)而制作的该容器内面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm2添加水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀，进行干燥的工序(B)；
在工序(D)的胚状体形成用容器内对胚胎干细胞进行悬浮培养的工序(E)。
对于使用本发明的胚状体形成用容器来对干细胞进行悬浮培养，可以使用公知的培养方法。例如，可通过将在饲养细胞上培养的未分化状态的干细胞，在所述胚状体形成用容器内按照公知的方法及条件等进行悬浮培养而进行。此时，胚状体形成用容器内的培养液可为静置状态，也可缓慢地进行振动。
作为构成所述培养液的培养基，可为加有以往的悬滴法等中所使用的胎牛血清及各种成长因子的培养基。例如，可使用添加有20体积％胎牛血清和各种成长因子的Iscove's modified Dulbecco's medium(IMDM培养基)或添加有10体积％胎牛血清和各种成长因子的Dulbecco's Modified Eagle medium(DMEM培养基)等。
所述培养液中的干细胞的浓度，因准备的胚状体形成用容器的大小及形态等而不同，但通常为1.0×102～1.0×106个细胞/mL。特别是，作为胚状体形成用容器，使用96孔板时的所述干细胞的浓度为1.0×103～1.0×105个细胞/mL，能够再现性良好地形成胚状体，因此优选。
实施例
以下，通过实施例及比较例对本发明进行更详细的说明，但本发明并不限定于此。
首先，以下的合成例1～4中，示出作为侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的共聚物(1)～(4)的合成例。
(合成例1)
将35.7g MPC及4.3g甲基丙烯酸正丁酯(BMA)(MPC/BMA＝80/20(摩尔比))溶解于160g乙醇中，放入四口烧瓶，在吹入30分钟氮气之后，在60℃下加入0.82g偶氮二异丁腈，使其进行8小时聚合反应。一边搅拌一边将聚合液滴入3L的二乙醚中，过滤所析出的沉淀，在室温下进行真空干燥48小时，得到29.6g粉末。通过以下所示条件的GPC而测定的重均分子量为153000。通过1H-NMR进行组成分析，结果为MPC/BMA＝80/20(摩尔比)。以此作为含磷酸胆碱类似基团的单体(M)的共聚物(1)。
<GPC的测定条件＞
(1)样品：在0.5重量％的含有溴化锂的氯仿/甲醇(6/4(体积比))混合溶剂中溶解样品，配制0.5重量％的聚合物溶液。样品溶液的使用量为20L。
(2)柱：通过Plgel 5μm MIXED-C、两根串联(Polymer Laboratories Ltd.制造)、柱温度为40℃、TOSOH CORPORATION制造的积分器内藏分子量计算程序(SC-8020用GPC程序)而配制。
(3)溶出溶剂：0.5重量％的含有溴化锂的氯仿/甲醇(6/4(体积％))混合溶剂，流速为1.0mL/分钟。
(4)检测：示差折光仪。
(5)标准物质：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)(Polymer Laboratories Ltd.制造)。
(合成例2)
将23.5g MPC及26.5g甲基丙烯酸正丁酯(BMA)(MPC/BMA＝30/70(摩尔比))溶解于75g乙醇中，放入四口烧瓶内，在吹入30分钟氮气之后，在55℃下加入0.41g偶氮二异丁腈，使其进行24小时聚合反应。一边搅拌一边将聚合液滴入3L的二乙醚中，过滤所析出的沉淀，在室温下进行真空干燥48小时，得到32.0g粉末。以与合成例1相同的方式通过GPC而测定的重均分子量为353,000。通过1H-NMR进行组成分析，结果为MPC/BMA＝30/70(摩尔比)。将其作为共聚物(2)。
(合成例3)
将38.0g MPC及2.0g甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)(MPC/GMA＝90/10(摩尔比))溶解于358g异丙醇中，放入四口烧瓶内，在吹入30分钟氮气之后，在60℃下加入20重量％的过氧化新戊酸叔丁酯的甲苯溶液2.18g，使其进行5小时聚合反应。一边搅拌一边将聚合液滴入3L的二乙醚中，过滤所析出的沉淀，在室温下进行真空干燥4.8小时，得到28.4g粉末。通过1H-NMR进行组成分析，其结果，MPC/GMA为90/10(摩尔比)。以与合成例1相同的方式通过GPC而测定的重均分子量为53000。将其作为共聚物(3)。
(合成例4)
将25.9g MPC、16.6g BMA及7.5g甲基丙烯酸(MA)(MPC/BMA/MA＝30/40/30(摩尔比))溶解于75g正丙醇中，放入四口烧瓶内，在吹入30分钟氮气之后，在50℃下加入20重量％的过氧化新戊酸叔丁酯的甲苯溶液2.18g，使其进行5小时聚合反应。一边搅拌一边将聚合液滴入3L的二乙醚中，过滤所析出的沉淀，在室温下进行真空干燥48小时，得到28.4g粉末。通过1H-NMR进行组成分析，结果为MPC/BMA/GMA＝30/40/30(摩尔比)。以与合成例1相同的方式通过GPC而测定的重均分子量为108,000。将其作为共聚物(4)。
(实施例1)胚状体形成用容器的制作
将0.5g合成例1中合成的共聚物(1)溶解于100mL乙醇中，配制共聚物溶液。在向组织培养用F底聚苯乙烯制96孔板(Nunc社制造)的各孔(每孔的面积约为0.33cm2)中加入0.03mL所述共聚物溶液之后，在室温下使其干燥一晚。接着，在加入水/乙醇混合溶剂(重量比：70/30)作为流平用的后处理液之后，在室温干燥一晚。将所得到的F底聚苯乙烯制造的96孔板放入灭菌袋中之后，以满足基于ISO11135-1的灭菌基准的方式(SAL<10-6)对容器进行环氧乙烷气体灭菌(EOG灭菌)，制作胚状体形成用容器。
(实施例2～6、比较例1～6)胚状体形成用容器的制作
除将以下的条件变更为如表1以及表2所记载的内容以外，以与实施例1相同的方式，制作胚状体形成用容器。
首先，改变共聚物的种类，称量0.5g，加入100mL乙醇，配制共聚物溶液。改变共聚物溶液的添加量，在注入组织培养用F底聚苯乙烯制96孔板的各孔之后，使其干燥。进一步改变流平用的后处理液的种类，在室温下使其干燥一晚。此外，在不添加流平用的后处理液的状态下进行胚状体形成用容器的制作(比较例3)。此外，除了通过EOG灭菌之外，通过γ射线灭菌、或电子束灭菌来实施灭菌。
将通过下述的鼠干细胞的悬浊液的配制法而配制的5×103个细胞/mL的鼠干细胞的悬浊液，以各孔0.2mL依次接种于实施例1～6以及比较例1～6中制作的胚状体形成用容器中。在37℃、5％CO2的条件下进行5天培养之后，使用相差显微镜观察胚状体形成状态。
结果示于表1以及表2。此外，关于使用实施例3的胚状体形成用容器而培养的胚状体的相差显微镜照片的副本示于图1。此外，使用比较例3的胚状体形成用容器而形成的胚状体的相差显微镜照片的副本示于图2。
此外，表1以及表2中的细胞粘合性的评价，对去除悬浮细胞后的残留在孔中的细胞，通过使用了MTT试剂的甲臜(formazan)产生量而进行定量评价。细胞粘合率若小于5％则为合格，若在其以上则为不合格。
此外，对于表1以及表2中的胚状体形成的评价，将形成分化充分大的胚状体的情况记为A；将虽形成了胚状体，但大小或形状不充分的情况记为B；将未形成胚状体的情况记为C。
如实施例1～6中所示可知，通过组合：控制共聚物的添加量的工序(A)和进行流平处理的工序(B)，形成了分化充分大的胚状体，而在全部的孔中细胞均未粘合，进一步，实现了良好的显微镜下的观察性。
[表1]
[表2]
<鼠干细胞的悬浊液的配制法＞
(1)饲养细胞的培养
使用SIM鼠的成纤维细胞(以下简记为STO细胞)作为饲养细胞。STO细胞使用添加有100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素及10体积％灭活处理的胎牛血清(FCS)的Dulbecco's modified Eagle's medium(以下简记为DMEM培养基，Gibco社制造)而进行培养。对培养后的STO细胞以10μg/mL的丝裂霉素C溶液(Sigma社制造)进行3小时处理之后，设作细胞悬浊液。将STO细胞的悬浊液以每孔5×105个细胞的方式接种于组织培养用6孔多盘中。在37℃、5％CO2的条件下进行16小时以上培养，配制饲养细胞。
(2)鼠干细胞的培养
使用129SV鼠ES细胞作为干细胞。干细胞的培养基为含有15％KnockOut(注册商标)血清替代品(serum replacement)(KSR：Gibco社制造)、1mM丙酮酸钠(Gibco社制造)、0.1mM MEM非必需氨基酸(non-Essential amino acids)(Gibco社制造)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma社制造)、100units/mL青霉素、100μg/mL链霉素及1000units/mL的小鼠白血病抑制因子(murineleukemia inhibitory factor)(mLIF：Chemicon社制造)的DMEM培养基(以下简记为干培养基)。在所述(1)中配制的饲养细胞上以2×105个细胞/孔接种干细胞。在37℃、5％CO2的条件下进行3天的鼠干细胞的培养。
将在所述(2)中培养的鼠干细胞以0.1％胰蛋白酶-EDTA通过常规方法进行剥离后，悬浮于含有15％胎牛血清(Gibco社制造)、0.1mM 2-巯基乙醇(Sigma社制造)、100units/mL青霉素及100μg/mL链霉素的IMDM培养基(Gibco社制造，不含mLIF)中，配制5×103个细胞/毫升的鼠干细胞的悬浊液。
工业实用性
本发明的胚状体形成用容器的制备方法，与以往的胚状体形成用容器相比，能够提供一种具有均匀化的容器表面、胚状体形成效率优异且光学观察性优异的容器。

Claims (10)

1.一种制备胚状体形成用容器的方法，该容器用于使干细胞悬浮培养，以形成胚状体，其中，该方法包括：
对用于形成用于悬浮培养干细胞的区域的容器内面，使用混合有侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，以侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为0.1～10mg/cm2的方式进行涂布并干燥的工序(A)；以及
对通过工序(A)而制作的该容器内面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm2添加水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀后干燥的工序(B)，
[化学式1]
式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；n为1～4的整数。
2.根据权利要求1所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，进一步包括使用环氧乙烷气体对该容器的内面进行灭菌的工序(C)。
3.根据权利要求1或2所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为以式(2)所表示的含磷酸胆碱类似基团的单体(M)与其他单体的共聚物中的至少一种，所述其他单体为(甲基)丙烯酸烷基酯或(甲基)丙烯酸缩水甘油酯，
[化学式2]
式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；R4表示碳原子数为1～6的烷基；R5表示氢原子或甲基；n为1～4的整数。
4.根据权利要求1所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或甲基丙烯酸的共聚物。
5.根据权利要求1所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物。
6.根据权利要求5所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱与甲基丙烯酸丁酯的共聚物的摩尔比为10～90:90～10。
7.根据权利要求1所述的制备胚状体形成用容器的方法，其中，侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物，为2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱、甲基丙烯酸丁酯及甲基丙烯酸的共聚物。
8.一种胚状体形成用容器，其由权利要求1～7中任一项所述的制备胚状体形成用容器的方法而被制备。
9.一种形成胚状体的方法，其使用用于使干细胞悬浮培养、以形成胚状体的胚状体形成用容器，其中，该方法包括：
准备胚状体形成用容器的工序(D)、以及在工序(D)的胚状体形成用容器内对胚胎干细胞进行悬浮培养的工序(E)，
所述胚状体形成用容器通过以下工序形成：
对用于形成用于悬浮培养干细胞的区域的容器内面，使用混合有侧链上具有以式(1)所表示的磷酸胆碱类似基团的化合物的醇类介质溶液，以侧链上具有磷酸胆碱类似基团的化合物的量为0.1～10mg/cm2的方式进行涂布并干燥的工序(A)；以及
对通过工序(A)而制作的该容器内面上的涂布膜，以15mg～150mg/cm2添加水/醇类介质溶液，使涂布膜溶胀后干燥的工序(B)，
[化学式1]
式中，R1、R2及R3为相同或不同的基团，表示氢原子、碳原子数为1～6的烷基或羟烷基；n为1～4的整数。
10.根据权利要求9所述的形成胚状体的方法，其进一步包括：在所述工序(B)之后，使用环氧乙烷气体对所述容器的内面进行灭菌的工序(C)。
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