JP2015047084A - 細胞凝集塊の製造方法、及び薬剤のスクリーニング方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】コストや手間の増大を伴わない新規な細胞凝集塊の製造方法を提供する。【解決手段】細胞凝集塊の製造方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することを含む。この構成により、コストや手間の増大を伴わずに細胞凝集塊を形成することが可能となる。【選択図】図１
Description
本発明は、細胞凝集塊の製造方法、及び薬剤のスクリーニング方法に関する。
各種試験や研究に利用される動物細胞は、シャーレやマルチウェルプレートなどの培養容器内で培養されることが多い。培養容器内の細胞は、例えば、培養容器の表面に接着し、培養容器の培養面上で伸展することにより二次元的に増殖する。
一般的な培養容器は、ポリスチレンなどの生体内に存在しない材料で形成される。このような培養容器内は生体内と環境が大きく異なるため、培養容器の表面に接着して増殖した細胞は生体内における形態や機能を発現しない場合がある。
そのため、細胞が培養容器に接着しない培養技術が注目されている。このような技術で培養された細胞は細胞凝集塊となる。細胞凝集塊は、生体内の細胞に近い形態や機能を発現するため、広く利用されている。
細胞凝集塊を形成する技術として、垂れ下がった液滴の中で細胞を培養するハンギングドロップ法や、非特許文献１に記載された旋回培養法や遠心法が知られている。しかし、これらの方法では、培養条件の設定が煩雑である。
そこで、細胞が接着しにくい培養容器が注目されている。このような培養容器内の細胞は、培養容器に接着することなく細胞凝集塊を形成する。
例えば特許文献１には、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体がコーティングされた培養容器が開示されている。また、特許文献２には、ポリヒドロキシルエチルメタクリレートやエチレンビニルアルコール共重合体などで形成された培養容器が開示されている。
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ２００８， ３， １１７２−１１８４
しかしながら、特許文献１に記載の技術では、培養容器にコーティング処理を加えるための手間及びコストが増大する。また、特許文献２に記載の技術では、汎用の培養容器を使用することができないため、コストが増大する。
以上のような事情に鑑み、本発明の目的は、コストや手間の増大を伴わない新規な細胞凝集塊の製造方法、及びこれを用いた薬剤のスクリーニング方法を提供することにある。
上記目的を達成するため、本発明の一形態に係る細胞凝集塊の製造方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することを含む。
本発明の一形態に係る薬剤のスクリーニング方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することを含む。
上記細胞凝集塊に薬剤が添加される。
上記細胞凝集塊に対する薬剤の作用が評価される。
上記細胞凝集塊に薬剤が添加される。
上記細胞凝集塊に対する薬剤の作用が評価される。
本発明によれば、コストや手間の増大を伴わない新規な細胞凝集塊の製造方法、及びこれを用いた薬剤のスクリーニング方法を提供することができる。
本発明の一実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することを含む。
この構成により、コストや手間の増大を伴わずに細胞凝集塊を形成することが可能となる。
この構成により、コストや手間の増大を伴わずに細胞凝集塊を形成することが可能となる。
上記培地における上記共重合体の濃度が０．０１重量％以上５重量％以下の範囲内であってもよい。
上記共重合体における２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの共重合組成比が３０モル％以上９０モル％以下であってもよい。
上記共重合体の質量平均分子量は、５，０００以上１，０００，０００以下の範囲内であってもよい。
この構成により、細胞凝集塊をより良好に形成することが可能となる。
上記共重合体における２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの共重合組成比が３０モル％以上９０モル％以下であってもよい。
上記共重合体の質量平均分子量は、５，０００以上１，０００，０００以下の範囲内であってもよい。
この構成により、細胞凝集塊をより良好に形成することが可能となる。
本発明の一実施形態に係る薬剤のスクリーニング方法は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成することを含む。
上記細胞凝集塊に薬剤が添加される。
上記細胞凝集塊に対する薬剤の作用が評価される。
この構成により、薬剤のスクリーニングを良好に行なうことができるようになる。
上記細胞凝集塊に薬剤が添加される。
上記細胞凝集塊に対する薬剤の作用が評価される。
この構成により、薬剤のスクリーニングを良好に行なうことができるようになる。
上記細胞は癌細胞であってもよい。
この構成により、抗癌剤などのスクリーニングを良好に行なうことができるようになる。
この構成により、抗癌剤などのスクリーニングを良好に行なうことができるようになる。
以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
本発明の一実施形態に係る細胞凝集塊は、例えば、新薬のスクリーニング、人工臓器の開発、動物実験代替キットの開発に利用可能である。
また、本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法は、再生医療の分野にも適用可能である。例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を効率的に各種組織細胞（神経や心筋、肝臓、膵臓など）に誘導するために、これらの細胞から胚様体と呼ばれる細胞凝集塊を形成することが可能である。
［細胞凝集塊の製造方法］
本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法では、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」とも呼ぶ。）とｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」とも呼ぶ。）とグリセロールメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」とも呼ぶ。）との共重合体（以下、「ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体」とも呼ぶ。）を培地に添加する。
本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法では、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、「ＭＰＣ」とも呼ぶ。）とｎ−ブチルメタクリレート（以下、「ＢＭＡ」とも呼ぶ。）とグリセロールメタクリレート（以下、「ＧＭＡ」とも呼ぶ。）との共重合体（以下、「ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体」とも呼ぶ。）を培地に添加する。
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体を培地に添加することにより、細胞が培養容器に接着しなくなる。そのため、本実施形態に係る製造方法では、静置培養にて細胞凝集塊を容易に形成することができる。
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体は、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン単量体（以下、「ＭＰＣ単量体」とも呼ぶ。）とｎ−ブチルメタクリレート単量体（以下、「ＢＭＡ単量体」とも呼ぶ。）とグリセロールメタクリレート単量体（以下、「ＧＭＡ単量体」とも呼ぶ。）とを重合させることにより得られる。ＭＰＣ単量体とＢＭＡ単量体とＧＭＡ単量体との重合方法としては、例えば、溶液重合、乳化重合、懸濁重合などが挙げられる。
一例として、溶液重合では、まずＭＰＣ単量体、ＢＭＡ単量体及びＧＭＡ単量体を低級アルコールなどの有機溶媒に溶解させた溶液を作成する。そして、窒素やアルゴンなどの不活性ガス雰囲気中で、過酸化物やアゾ化合物などのラジカル重合開始剤を添加した溶液を加熱しつつ攪拌することにより、ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体が得られる。
なお、ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体として、市販品（商品名「リピジュア」（登録商標）、日油株式会社製）を用いることも好ましい。また、ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体は、粉状であっても、溶液状であってもよい。
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体は、ＭＰＣの共重合組成比が３０モル％以上９０モル％以下の範囲内となるように調整される。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体は、ＭＰＣの共重合組成比が４０モル％以上８０モル％以下の範囲内である場合に、細胞の培養容器への接着をより効果的に防止することができる。
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体の質量平均分子量は、５，０００以上１，０００，０００以下の範囲内で適宜決定することができる。また、ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体は、質量平均分子量が１０，０００以上５００，０００以下の範囲内である場合に、培地への優れた溶解性が得られるとともに細胞凝集塊を特に良好に形成することができる。
ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体の添加量は、培地に対して０．０１重量％以上５重量以下％の範囲内で適宜決定することができる。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体の添加量が培地に対して０．０６重量％以上の場合に細胞凝集塊を特に良好に形成することができる。また、培地への溶解性及び経済性の観点から、ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体の添加量は培地に対して１重量％以下であることが好ましい。
本実施形態に係る細胞凝集塊の製造方法を適用可能な動物細胞は特に限定されない。このような動物細胞としては、例えば、ヒト、マウス、ラットなどの哺乳類由来細胞が挙げられる。
本実施形態に利用可能な培地は特に限定されない。このような培地としては、例えば、市販されている各種培地（αＭＥＭ、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＩＭＤＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ１２等）や、これらの組み合わせが挙げられる。
培地には、必要に応じて、各種増殖因子（上皮成長因子やインスリン様成長因子、神経成長因子、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、塩基性繊維芽細胞増殖因子、トランスフェリン、ステロイドホルモン、２−メルカプトエタノール等）や各種動物血清（ウシ胎児血清（ＦＢＳ）やウシ血清等）、血清代替物などが添加される。
本実施形態に適用可能な培養容器としては、一般的な培養容器を採用することができる。このような培養容器としては、例えば、マルチウェルプレートやシャーレや培養フラスコが挙げられる。これらの培養容器の材質としては、例えば、ポリスチレンが挙げられる。
本実施形態における培養条件は、通常の動物細胞の培養条件でよく、例えば、５％ＣＯ２雰囲気で、温度が３７℃である条件とすることができる。
［薬剤のスクリーニング方法］
本実施形態で得られる細胞凝集塊を用いた薬剤のスクリーニング方法について説明する。
本実施形態で得られる細胞凝集塊を用いた薬剤のスクリーニング方法について説明する。
まず、本実施形態に係る製造方法で細胞凝集塊を用意し、細胞凝集塊に対して薬剤を添加する。そして、薬剤が細胞凝集塊を形成する細胞に対して目的とする作用を及ぼしているか否かを判定する。これにより、薬細胞凝集塊を形成する細胞に対して目的とする作用を及ぼしている薬剤を抽出することができる。
本実施形態に係るスクリーニング方法を適用可能な薬剤としては、例えば、マイトマイシンＣやパクリタキセル、フルオロウラシル、ブレオマイシン、デキサメサゾンといった抗癌剤や、各種増殖因子や抗体を含むタンパク質などが挙げられる。
薬剤が細胞凝集塊を形成する細胞に対して目的とする作用を及ぼしているか否かは、薬剤が、細胞凝集塊の増殖挙動や、タンパク質の発現や、遺伝子の発現などに影響を与えているか否かにより判定する。
細胞凝集塊の増殖挙動は、例えば、ＷＳＴ−８アッセイ、アラマーブルーアッセイ、ＭＴＴアッセイで評価することができる。また、タンパク質の発現及び遺伝子の発現は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、免疫染色等の方法で評価することができる。
以下に本発明の実施例について説明するが、本発明はこれらに限定されない。
１．重合体の合成
まず、本実施例に係るＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体、及び比較例に係る重合体を合成した。比較例に係る重合体としては、ＭＰＣとメタクリル酸（ＭＡｃ）との共重合体（ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体）、ＭＰＣとｎ−ステアリルメタクリレート（ＳＭＡ）との共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体）、ＭＰＣとベンジルメタクリレート（ＢｚＭＡ）との共重合体（ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体）、及びＭＰＣ単独重合体を合成した。
まず、本実施例に係るＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体、及び比較例に係る重合体を合成した。比較例に係る重合体としては、ＭＰＣとメタクリル酸（ＭＡｃ）との共重合体（ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体）、ＭＰＣとｎ−ステアリルメタクリレート（ＳＭＡ）との共重合体（ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体）、ＭＰＣとベンジルメタクリレート（ＢｚＭＡ）との共重合体（ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体）、及びＭＰＣ単独重合体を合成した。
具体的には、以下の８種類の重合体１〜８を合成した。
重合体１：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝４０／４０／２０）
重合体２：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝４０／２０／４０）
重合体３：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／３０／４０）
重合体４：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝７０／２０／１０）
重合体５：ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体（ＭＰＣ／ＭＡｃ＝３０／７０）
重合体６：ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＳＭＡ＝８０／２０）
重合体７：ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＢｚＭＡ＝８０／２０）
重合体８：ＭＰＣ単独重合体
（括弧内には各重合体の仕込み組成におけるモル比が示されている。）
重合体１：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝４０／４０／２０）
重合体２：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝４０／２０／４０）
重合体３：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／３０／４０）
重合体４：ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝７０／２０／１０）
重合体５：ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体（ＭＰＣ／ＭＡｃ＝３０／７０）
重合体６：ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＳＭＡ＝８０／２０）
重合体７：ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体（ＭＰＣ／ＢｚＭＡ＝８０／２０）
重合体８：ＭＰＣ単独重合体
（括弧内には各重合体の仕込み組成におけるモル比が示されている。）
各重合体の合成方法について説明する。いずれの重合体も以下に示す方法によって合成される。
まず、各重合体のモノマーを重合容器に秤量する。反応溶媒としては、エタノールと水との混合溶媒を用い、総モノマー濃度が１．０ｍｏｌ／リットルとなるように調整する。そして秤量したモノマーに、重合開始剤としてアゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）を添加する。重合開始剤の濃度は１ｍｏｌ％とした。
次に、重合容器内を十分に窒素置換した後に、重合容器を６０℃で２４時間保持することにより重合反応を行なう。そして、得られた反応混合物を氷冷した後、ジエチルエーテルに滴下することによりポリマーを沈殿させる。沈殿したポリマーを濾別し、ジエチルエーテルで洗浄した後に、減圧乾燥させる。これにより、白色粉末状の各重合体が得られる。得られた各重合体は、純水に溶解させ、５重量％の水溶液として保存する。
得られた各重合体の元素分析を行ったところ、仕込み組成どおりの共重合体が得られていることがわかった。
また、各重合体をテトラヒドロフランに溶解し、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ：Ｇｅｌ Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）を用いて各重合体の分子量を測定した。
重合体１〜８の分子量の測定結果を以下に示す。
重合体１：２２，０００
重合体２：９８，０００
重合体３：１００，０００
重合体４：５００，０００
重合体５：６８０，０００
重合体６：４３，０００
重合体７：２４０，０００
重合体８：１，０３０，０００
重合体１：２２，０００
重合体２：９８，０００
重合体３：１００，０００
重合体４：５００，０００
重合体５：６８０，０００
重合体６：４３，０００
重合体７：２４０，０００
重合体８：１，０３０，０００
２．細胞凝集塊の形成
本実施例では、マウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６（ＲＣＢ２３１８）の細胞凝集塊を形成する。
本実施例では、マウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６（ＲＣＢ２３１８）の細胞凝集塊を形成する。
２．１ 細胞懸濁液の作製
培地には、１０体積％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したαＭＥＭ（以下、「１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ培地」とも呼ぶ。）を用いた。ＦＢＳにはＧＩＢＣＯ社製のものを用い、ＭＥＭαにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のものを用いた。
培地には、１０体積％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したαＭＥＭ（以下、「１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ培地」とも呼ぶ。）を用いた。ＦＢＳにはＧＩＢＣＯ社製のものを用い、ＭＥＭαにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のものを用いた。
マウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから分譲されたものを用いた。マウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６は、予め１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ培地で培養した。
１０％ＦＢＳ−αＭＥＭ培地にマウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６を加え、マウス胚性癌細胞Ｐ１９．ＣＬ６の濃度が５００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる細胞懸濁液を作製した。
２．２ 細胞凝集塊の形成
以下のサンプル１〜６を作製した。
以下のサンプル１〜６を作製した。
（１）サンプル１
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（重合体１）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（重合体１）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（２）サンプル２
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂ（重合体２）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂ（重合体２）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｂの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（３）サンプル３
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃ（重合体３）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃ（重合体３）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｃの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（４）サンプル４
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄ（重合体４）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄ（重合体４）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ｄの終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（５）サンプル５
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体（重合体５）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体（重合体５）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（６）サンプル６
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体（重合体６）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体（重合体６）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＳＭＡ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（７）サンプル７
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体（重合体７）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体（重合体７）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（８）サンプル８
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ単独重合体（重合体８）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ単独重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ単独重合体（重合体８）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ単独重合体の終濃度を、０．２５重量％、０．１２５重量％、０．０６２５重量％の３通りとし、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
（９）サンプル９
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。そして、重合体を添加せずに、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
得られた細胞懸濁液２００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。そして、重合体を添加せずに、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内で３日間培養した。
２．３ 各サンプルの評価
サンプル１〜９について、ウェル内の細胞を位相差倒立顕微鏡によって観察した。
サンプル１〜９について、ウェル内の細胞を位相差倒立顕微鏡によって観察した。
図１及び図２はウェル内の培養後の細胞を撮像した画像の一例である。図１では細胞凝集塊の形成が確認できる。一方、図２では細胞がウェルの底面に接着しており、細胞凝集塊の形成が確認できない。このように、細胞凝集塊の形成の有無は目視にて判別可能である。
表１は各サンプルにおける細胞凝集塊の形成の有無を示している。細胞凝集塊の形成が確認されたものを「○」と示し、細胞凝集塊の形成が確認されなかったものを「×」と示している。
表１に示すように、本実施例に係る重合体（ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）を用いたサンプル１〜４では、いずれも細胞凝集塊の形成が確認された。一方、比較例に係る重合体（ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体，ＭＰＣ−ＭＡｃ共重合体，ＭＰＣ−ＢｚＭＡ共重合体，ＭＰＣ単独重合体）を用いたサンプル５〜８では、いずれも細胞凝集塊の形成が確認されなかった。更に、重合体を用いないサンプル９では、細胞凝集塊の形成が確認されなかった。
以上のように、本実施例に係るＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体を用いることにより、細胞凝集塊が形成されることが確認された。
３．薬剤のスクリーニング
本実施例では、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２（ＲＣＢ１８８６）を用い、抗癌剤として知られるマイトマイシンＣの作用が確認できるか否かにより、抗癌剤のスクリーニングの可否を判断した。マイトマイシンＣにはＳｉｇｍａ社製のものを用いた。
本実施例では、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２（ＲＣＢ１８８６）を用い、抗癌剤として知られるマイトマイシンＣの作用が確認できるか否かにより、抗癌剤のスクリーニングの可否を判断した。マイトマイシンＣにはＳｉｇｍａ社製のものを用いた。
３．１ 細胞懸濁液の作製
培地には、１０体積％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地」とも呼ぶ。）を用いた。ＦＢＳにはＧＩＢＣＯ社製のものを用い、ＤＭＥＭにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のものを用いた。
培地には、１０体積％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、「１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地」とも呼ぶ。）を用いた。ＦＢＳにはＧＩＢＣＯ社製のものを用い、ＤＭＥＭにはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のものを用いた。
ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２は独立行政法人理化学研究所バイオリソースセンターから分譲されたものを用いた。ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２は、予め１０％ＦＢＳ−αＤＭＥＭ培地で培養した。
１０％ＦＢＳ−αＤＭＥＭ培地にヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を加え、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２の濃度が２００００ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなる細胞懸濁液を作製した。
３．２ 細胞凝集塊の形成
以下のサンプル１０，１１を作製した。
以下のサンプル１０，１１を作製した。
（１）サンプル１０
得られた細胞懸濁液１００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（重合体１）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａの終濃度を０．１２５重量％として、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内でヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を２４時間培養した。これにより、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２の細胞凝集塊が得られた。
得られた細胞懸濁液１００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。更に、各ウェルにＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａ（重合体１）の５重量％水溶液を添加した。ＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体Ａの終濃度を０．１２５重量％として、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内でヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を２４時間培養した。これにより、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２の細胞凝集塊が得られた。
（２）サンプル１１
得られた細胞懸濁液１００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。そして、重合体を添加せずに、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内でヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を２４時間培養した。これにより、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２がウェルプレートの接着し、接着培養系細胞が得られた。
得られた細胞懸濁液１００μｌを、滅菌されたポリスチレン製のＵ底９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。そして、重合体を添加せずに、５％ＣＯ２雰囲気中で３７℃に保持したインキュベーター内でヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を２４時間培養した。これにより、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２がウェルプレートの接着し、接着培養系細胞が得られた。
３．３ 薬剤溶液の添加
薬剤溶液は、ＤＵＬＢＥＣＣＯ‘Ｓ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＢＵＦＦＥＲＥＤ ＳＡＬＩＮＥ（以下、「Ｄ−ＰＢＳ」とも言う。）にマイトマイシンＣを溶解させて作製した。マイトマイシンＣの濃度は２５μｇ／ｍｌとした。この薬剤溶液をサンプル１０，１１のウェル内にそれぞれ１０μｌ添加し、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を更に２４時間培養した。
薬剤溶液は、ＤＵＬＢＥＣＣＯ‘Ｓ ＰＨＯＳＰＨＡＴＥ ＢＵＦＦＥＲＥＤ ＳＡＬＩＮＥ（以下、「Ｄ−ＰＢＳ」とも言う。）にマイトマイシンＣを溶解させて作製した。マイトマイシンＣの濃度は２５μｇ／ｍｌとした。この薬剤溶液をサンプル１０，１１のウェル内にそれぞれ１０μｌ添加し、ヒト肝臓癌細胞Ｈｅｐ Ｇ２を更に２４時間培養した。
３．４ スクリーニング性の評価
細胞凝集塊は生体内の腫瘍に近い性状(細胞間相互作用、酸素分圧、栄養分の浸透性など)を示すことが知られている。したがって、細胞凝集塊は接着培養系細胞よりも薬剤の作用をより明確に観察することができる。本実施例でも、サンプル１０の細胞凝集塊では、サンプル１１の接着培養系細胞よりも薬剤の作用を良好に確認することができた。
細胞凝集塊は生体内の腫瘍に近い性状(細胞間相互作用、酸素分圧、栄養分の浸透性など)を示すことが知られている。したがって、細胞凝集塊は接着培養系細胞よりも薬剤の作用をより明確に観察することができる。本実施例でも、サンプル１０の細胞凝集塊では、サンプル１１の接着培養系細胞よりも薬剤の作用を良好に確認することができた。
さらに、サンプル１０，１１について、細胞凝集塊のうち生細胞の比率である細胞活性率について評価した。各サンプルについて、細胞活性率が高いほど生体内の性状に近い細胞でスクリーニングが実施されたことを示し、細胞活性率が低いほど生体内の性状とは異なる細胞でスクリーニングが実施されたことを示す。したがって、細胞活性率が高いほど、薬剤のスクリーニング性が高いことがわかる。
細胞活性率は、細胞内脱水素酵素の量を測定する方法、及びアデノシン三リン酸（ＡＴＰ：Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）の量を測定する方法の２種類の方法により測定した。
細胞内脱水素酵素の量を測定する方法には、キシダ化学社製のＷＳＴ−８を用いた。ＡＴＰの量を測定する方法には、Ｐｒｏｍｅｇａ社製のＡＴＰ測定キット（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−ＧｌｏＴＭ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ）を用いた。
図３は、サンプル１０，１１に係る細胞活性率の測定結果を示したグラフである。図３に示すように、本実施例に係るＭＰＣ−ＢＭＡ−ＧＭＡ共重合体を用いたサンプル１０は、重合体を用いないサンプル１１よりも細胞活性率が高い。以上のように、本実施例に係るＭＰＣ−ＢＭＡ共重合体を用いることにより、抗癌剤のスクリーニング性の高い細胞凝集塊が得られることが確認された。
以上、本発明の実施形態について説明したが、本発明は上述の実施形態にのみ限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。
Claims (6)
- ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成する
細胞凝集塊の製造方法。 - 請求項１に記載の細胞凝集塊の製造方法であって、
前記培地における前記共重合体の濃度が０．０１重量％以上５重量％以下の範囲内である
細胞凝集塊の製造方法。 - 請求項１又は２に記載の細胞凝集塊の製造方法であって、
前記共重合体における２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンの共重合組成比が３０モル％以上９０モル％以下である
細胞凝集塊の製造方法。 - 請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞凝集塊の製造方法であって、
前記共重合体の質量平均分子量は、５，０００以上１，０００，０００以下の範囲内である
細胞凝集塊の製造方法。 - ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとｎ−ブチルメタクリレートとグリセロールメタクリレートとの共重合体を添加した培地で細胞を培養して細胞凝集塊を形成し、
前記細胞凝集塊に薬剤を添加し、
前記細胞凝集塊に対する薬剤の作用を評価する
薬剤のスクリーニング方法。 - 請求項５に記載の薬剤のスクリーニング方法であって、
前記細胞は癌細胞である
薬剤のスクリーニング方法。
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-
2013
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