JP6565928B2 - 胚様体形成用容器の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、胚様体を形成する際に用いる胚様体形成用容器の製造方法に関する。
本出願は、参照によりここに援用されるところの日本出願、特願2014-224752号優先権を請求する。

胚性幹細胞や体性幹細胞などの幹細胞は、試験管内で様々な細胞に分化する能力をもつ。幹細胞を試験管内で分化させる方法として、幹細胞を浮遊培養することによって胚様体と呼ばれる擬似的な胚を形成させる方法、ストローマ細胞のように分化と増殖を支持する細胞と幹細胞とを共培養する方法が利用されている。このうち浮遊培養は、幹細胞を試験管内で分化させる際に最も広く用いられる方法である。例えばマウス胚性幹細胞は、ＬＩＦ（白血病阻止因子：ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ）を加えずに、シャーレ等の培養容器において接着しないように浮遊培養させることにより細胞塊を形成する。浮遊培養で形成された細胞塊は、胚様体（ＥＢ）と呼ばれる。得られた細胞塊は、その後、様々な種類の細胞に分化することが知られている。

胚様体（ＥＢ）は、二重の細胞層から成るボールのような構造をもち、外層は近位内胚葉、内層は胚体外胚葉に該当する。２つの胚葉は、基底膜によって隔てられている。胚様体の構造は、マウスの６日胚である円筒胚によく似ており、その限りにおいて胚の正常な発生段階に近い。胚様体においては、中胚葉の誘導も起き、心筋細胞、血液細胞、更には原始的な血管網も発生する。また、胚様体を培養シャーレに付着させて培養を続けると様々な種類の細胞に分化する。例えば、神経細胞、ケラチノサイト、軟骨細胞、脂肪細胞等が含まれる。胚様体の形成を経て分化する細胞は、体細胞に限らず、最近では生殖細胞系譜への分化も起きることが確認されている。幹細胞の多分化能を利用するためには、胚様体を形成させることが好適である。

一般的に、細胞塊を形成する技術として、垂れ下がった液滴の中で細胞を培養するハンギング・ドロップ法や、非特許文献１に記載された旋回培養法や遠心法が知られている。しかしながら、これらの方法は培養条件の設定が煩雑である。

特許文献１には、細胞塊を形成させるための容器として、ポリヒドロキシルエチルメタクリレートやエチレンビニルアルコール共重合体などで形成された培養容器が開示されている。

また特許文献２には、幹細胞の一つであるＥＳ細胞を浮遊培養して胚様体を形成する方法が開示されている。特許文献２の胚様体形成方法では、ホスホリルコリン類似基を有する重合体で被覆した胚様体形成用容器が用いられている。特許文献２には、当該重合体により胚様体形成用容器を被覆するための方法が示されているものの、詳細な検討はなされていない。

特開平６−３２７４６２号公報 国際公開第２００５／００１０１９号パンフレット

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｊ． ２００８， ３， １１７２−１１８４

ホスホリルコリン類似基を有する重合体で被覆した胚様体形成用容器は、コーティング斑のために細胞接着性にばらつきが生じてしてしまうという問題や、コーティング膜厚が高いときには容器にコーティング膜の模様が生じてしまい、胚様体の形成を確認する等の顕微鏡観察時に、背景に模様が写り込んでしまうという問題がある。すなわち、ホスホリルコリン類似基を有する重合体で被覆した胚様体形成用容器では、胚様体形成及び胚様体から分化する細胞の光学観察時に問題がある。本発明はかかる従来の胚様体形成用容器の問題を解決することを目的とするものである。従って本発明の目的は、胚様体の形成性に優れ、光学観察に好適な胚様体形成用容器の製造方法を提供することである。

本発明者らは、特定の量でホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を容器内面に付与して乾燥させることによりコーティング膜を形成し、その後コーティング膜を特定の量で処理液を用いてレベリングするという２つの工程を経ることにより、効率的に胚様体を形成し、かつ光学観察性に優れた胚様体形成用容器を製造し得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下よりなる。
１．幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器の製造方法であって、幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器内面を、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合したアルコール系媒質溶液を用いて、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングして、乾燥する工程（Ａ）と、
工程（Ａ）により作製された該容器内面上のコーティング膜に、水／アルコール系媒質溶液を１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／ｃｍ^２で添加してコーティング膜を膨潤させ、乾燥する工程（Ｂ）と
を含む、胚様体形成用容器の製造方法。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
２．エチレンオキサイドガスを用いて該容器の内面を滅菌する工程（Ｃ）をさらに含む、前項１記載の胚様体形成用容器の製造方法。
３．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、式（２）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）と他の単量体との共重合体の少なくとも１種である、前項１または２記載の胚様体形成用容器の製造方法。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を、Ｒ^４は炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ^５は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
４．他の単量体が、アルキル（メタ）アクリレートまたはグリシジル（メタ）アクリレートを含む、前項３に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
５．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート及び／又はメタクリル酸との共重合体である、前項１〜４のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
６．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体である、前項１〜５のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
７．２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートの共重合体のモル比が、１０〜９０：９０〜１０である、前項６に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
８．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びメタクリル酸との共重合体である、前項１〜５のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
９．前項１〜８のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法から製造された胚様体形成用容器。
１０．幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器を用いての胚様体の形成方法であって、
幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器内面を、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合したアルコール系媒質溶液を用いて、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングして、乾燥する工程（Ａ）と、工程（Ａ）により作製された該容器内面上のコーティング膜に、水／アルコール系媒質溶液を１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／ｃｍ^２で添加してコーティング膜を膨潤させ、乾燥する工程（Ｂ）により形成した胚様体形成用容器を準備する工程（Ｄ）と、
胚性幹細胞を、工程（Ｄ）の胚様体形成用容器内において浮遊培養する工程（Ｅ）と
を含む胚様体の形成方法。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
１１．前記工程（Ｂ）の後に、エチレンオキサイドガスを用いて該容器の内面を滅菌する工程（Ｃ）をさらに含む、前項１０記載の胚様体の形成方法。
１２．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、式（２）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）と他の単量体との共重合体の少なくとも１種である、前項１１または１２記載の胚様体の形成方法。
（式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を、Ｒ^４は炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ^５は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
１３．他の単量体が、アルキル（メタ）アクリレートまたはグリシジル（メタ）アクリレートを含む、前項１２に記載の胚様体の形成方法。
１４．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート及び／又はメタクリル酸との共重合体である、前項１０〜１３のいずれか１に記載の胚様体の形成方法。
１５．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体である、前項１０〜１４のいずれか１に記載の胚様体の形成方法。
１６．２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートの共重合体のモル比が、１０〜９０：９０〜１０である、前項１５に記載の胚様体の形成方法。
１７．ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びメタクリル酸との共重合体である、前項１０〜１４のいずれか１に記載の胚様体の形成方法。

本発明の胚様体形成用容器の製造方法は、従来のものに比較して、容器表面が均質な胚様体形成用容器を提供することができる。本発明の製造方法により作製された胚様体形成用容器は、胚様体形成効率に優れ且つ光学観察性に優れており、有用である。

図１は、実施例３の胚様体形成用容器により形成した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。 図２は、比較例３の胚様体形成用容器により形成した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しである。

本発明は、幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成させるために使用する胚様体形成用容器を製造する方法である。本発明において幹細胞とは、自己複製能と様々な細胞に分化する能力（多分化能）を有する細胞である。幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体性幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが例示される。

本発明の胚様体形成用容器の製造方法は、以下の工程（Ａ）および工程（Ｂ）を含む。
工程（Ａ）は、以下の式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合（溶解）したアルコール系媒質溶液（以下単に「ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液」と称する）を、浮遊培養するための領域を形成するための容器内面（内表面）に、０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるよう付与してコーティングし、乾燥する工程である。
前記式（１）においてＲ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６の、アルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。

前記炭素数１〜６のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、ヘキシル基、シクロヘキシル基、フェニル基等が挙げられる。前記炭素数１〜６のヒドロキシアルキル基としては、例えば、ヒドロキシメチル基、２−ヒドロキシエチル基、３−ヒドロキシプロピル基、４−ヒドロキシブチル基、５−ヒドロキシペンチル基、６−ヒドロキシヘキシル基等が挙げられる。

上記工程（Ａ）により、所望の容器内面にホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含むコーティング膜を形成（被覆層を付与）することができ、当該容器内面にホスホリルコリン類似基を有する表面とすることができる。

工程（Ａ）では、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液を、所望の容器内面に付与してコーティングした後、すなわち所望の容器内面上に当該溶液からなる溶液層ができた後、当該溶液層を乾燥させる。ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液を、所望の容器内面にコーティングする手段としては、例えば、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液中に容器を浸漬処理して引き上げる手段、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液を所望の容器内面に添加または注入する手段、または、ホスホリルコリン類似基の化合物を含む溶液を所望の容器内面に吹き付ける手段が挙げられる。ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液を所望の容器内面に添加または注入する手段は、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を確実に所望の容器内面に付与することができ、且つ当該溶液のコーティング量を調節することができるため好ましい。また容器内面を乾燥させる手段は、本発明の目的を損なわないものであれば、いかなる手段を用いてもよい。

ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含む溶液を所望の容器内面にコーティングする条件としては、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が容器内面１ｃｍ^２あたり０．１〜１０ｍｇ（０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２）、好ましくは０．１５〜１ｍｇとなるように付与する。ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１ｍｇ／ｃｍ^２未満であると、コーティングが不均一となり、細胞が容器内面に接着してしまい、胚様体形成が不十分となる。またホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が１０ｍｇ／ｃｍ^２より高いと、コーティング斑が大きく生じてしまい、顕微鏡での観察性が悪い。さらに、工程（Ａ）の後に行うレベリング処理により解消することができず、表面に模様が生じてしまう。また原料コストも大きくかかるため実用性に乏しい。

式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物は、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を有する重合体が好ましく、ホスホリルコリン類似基を有するポリマーであれば良い。式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物は、例えば式（２）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）の単独重合体、及び該単量体（Ｍ） と他の単量体との共重合体の少なくとも１種が好ましく、該単量体（Ｍ）と他の単量体との共重合体の少なくとも１種がより好ましい。
上記式（２）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３及びｎは式（１）と同様であり、Ｒ^４は炭素数１〜６のアルキル基を示し、Ｒ^５は水素原子又はメチル基を示す。炭素数１〜６のアルキル基の定義は、式（１）と同様である。

式（２）で表される単量体（Ｍ）としては、例えば、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、３−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリエチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリプロピルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリブチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリシクロヘキシルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリフェニルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）プロピル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ブチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ペンチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（（メタ）アクリロイルオキシ）ヘキシル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート等が挙げられる。

式（２）で表される単量体（Ｍ）としては、中でも２−（（メタ）アクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェートが好ましく、さらに２−（メタクリロイルオキシ）エチル−２'−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート（２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンともいう。以下、ＭＰＣと略記）が入手性、および、幹細胞の容器への接着を防止して胚様体形成能を発現させる点で好ましい。

前記共重合体を得るための他の単量体としては、疎水性単量体、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート、４−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート等の水酸基含有（メタ）アクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、スチレンスルホン酸、（メタ）アクリロイルオキシホスホン酸、２−ヒドロキシ−３−（メタ）アクリロイルオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロライド等のイオン性基含有単量体、（メタ）アクリルアミド、アミノエチルメタクリレート、ジメチルアミノエチル（メタ）アクリレート等の含窒素単量体、ポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、グリシジル（メタ）アクリレート又はこれらの２種以上の混合物等が挙げられる。

前記疎水性単量体としては、例えば、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、ラウリル（メタ）アクリレート、ステアリル（メタ）アクリレート等の直鎖又は分岐アルキル（メタ）アクリレート、シクロヘキシル（メタ）アクリレート等の環状アルキル（メタ）アクリレート、ベンジル（メタ）アクリレート、フェノキシエチル（メタ）アクリレート等の芳香族（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコール（メタ）アクリレート等の疎水性ポリアルキレングリコール（メタ）アクリレート、スチレン、メチルスチレン、クロロメチルスチレン等のスチレン系単量体、メチルビニルエーテル、ブチルビニルエーテル等のビニルエーテル系単量体、酢酸ビニル、プロピオン酸ビニル等のビニルエステル系単量体又はこれらの２種以上の混合物等が挙げられる。

前記共重合体において、単量体（Ｍ）に由来する構成単位は、共重合体の構成単位中１０モル％以上９０モル％以下、好ましくは３０モル％以上８０モル％以下である。単量体（Ｍ）に由来する構成単位が１０モル％以上９０モル％以下であると、容器表面を式（１）で表されるホスホリルコリン類似基により被覆することができ、被覆の効果が十分に発揮される。

前記共重合体において、他の単量体として疎水性単量が含まれる場合、疎水性単量体に由来する構成単位は、共重合体の構成単位中９０モル％以下が好ましく、特に２０〜９０モル％が好ましい。疎水性単量体に由来する構成単位を有する共重合体は、耐溶出性が向上するが、疎水性単量体に由来する構成単位が９０モル％を超えると、容器表面における式（１）で表されるホスホリルコリン類似基の被覆量が少なくなり、被覆の効果が十分に発揮できなくなる恐れがあるので好ましくない。

他の単量体として、上述の疎水性単量体以外の単量体に由来する構成単位が共重合体に含まれると耐溶出性が向上し、培地等に界面活性剤、有機溶剤を使用できることになるので好ましい。例えば、疎水性単量体以外の他の単量体として、グリシジル（メタ）アクリレートを用いた共重合体は、容器表面のアミノ基、カルボキシル基等と反応させることができ、該共重合体を、所望表面に化学的に結合させることができる。前記共重合体において、疎水性単量体以外の他の単量体に由来する構成単位の割合は、７０モル％以下が好ましい。

式（２）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）の単独重合体、又は該単量体（Ｍ）と他の単量体との共重合体の分子量は、重量平均分子量で通常５，０００〜５，０００，０００であり、幹細胞の容器への接着を有効に防止でき、胚様体形成能を発現させ、重合体の耐溶出性を向上させる点から１０，０００〜２，０００，０００が好ましい。重量平均分子量は、後述する実施例に記載の方法により測定することができる。

ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を含むアルコール系媒質溶液は、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物をアルコール系溶媒に混合して溶解させた溶液であればいかなるものであってもよい。アルコール系溶媒としては、低級アルコールが好ましく、例えばメタノール、エタノール、プロパノール等やそれらの混合物が例示される。

ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物は、好ましくは、以下を例示することができるが特に限定されない。
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート及び／又はメタクリル酸との共重合体
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートの共重合体であって、モル比が、１０〜９０：９０〜１０である共重合体
２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びメタクリル酸との共重合体

本発明の胚様体形成用容器の製造方法は、工程（Ａ）を経た後、容器内面に形成された凹凸やムラを有するコーティング膜上に、水／アルコール系媒質溶液を付与してコーティング膜を膨潤させて、コーティング膜を乾燥する工程（Ｂ）を含む。工程（Ｂ）では、工程（Ａ）により形成されたコーティング膜を水／アルコール系媒質溶液にて膨潤させた後に再び乾燥させることにより、レベリング処理が行われる。レベリング処理とは、コーティング膜の露出表面を平滑化して均質化し、コーティング膜を均一な膜厚にして凹凸やムラを形成させないようにする処理をいう。工程（Ｂ）では水／アルコール系媒質溶液を用いることで、水／アルコール系媒質溶液の蒸散速度を低下させることにより、レベリング処理することとした。一般的なレベリング処理には増粘剤や消泡剤といった添加剤の添加があるが、これらの添加剤は、本発明の効果を有することができない。

該容器内面のコーティング膜上に添加される水／アルコール系媒質溶液の量は、１５ｍｇ〜２５０ｍｇ／ｃｍ^２であり、好ましくは３０〜１９０ｍｇ／ｃｍ^２である。溶液の量が３０ｍｇ〜１９０ｍｇ／ｃｍ^２の範囲内であれば、コーティング膜に均一に溶液が行き渡り、コーティング膜を十分に膨潤させることができ、レベリング処理を行うことができる。

工程（Ｂ）における水／アルコール系媒質溶液は、工程（Ａ）において形成されたコーティング膜をレベリング処理可能なものであればいかなるものであってもよい。水／アルコール系媒質溶液に含まれるアルコール系溶媒は、低級アルコールが好ましい。水／アルコール系媒質溶液は、例えば水とメタノール、水とエタノール、水と２‐プロパノール、またはこれらの混合液を組み合わせた混合溶媒が挙げられる。水とアルコール系溶媒の比率は、工程（Ａ）により得られたコーティング膜のレベリング処理が可能なものであればよいが、蒸散速度の関係から、水１０〜５０重量％、アルコール系溶媒５０〜９０重量％が好ましい。

本発明の胚様体形成用容器の製造方法は、工程（Ａ）および工程（Ｂ）を経た後、均質化されたコーティング膜を有する容器内面を滅菌する工程（Ｃ）を含むことが好ましい。滅菌する手段としては、本発明の目的を損なわないものであれば、いかなる滅菌手段を用いてもよい。例えば、エチレンオキサイドガス（ＥＯＧ）による滅菌処理、ガンマ線による滅菌処理、電子線による滅菌処理などが例示されるが、ＥＯＧによる滅菌処理が他の滅菌処理に比較して細胞接着抑制の点で好ましい。

本発明の胚様体形成用容器の形状は、幹細胞を浮遊培養するための領域を形成可能な容器であり、容器であればいかなるものであってもよい。胚様体形成用容器の形状はとしては、平底、ロート状のＶ底、半球状の丸底等の容器を用いることができるが、好ましくは平底である。本発明の胚様体形成用容器としては、細胞培養用ディッシュ、細胞培養用マルチディッシュ、細胞培養用プレート、細胞培養用バック、細胞培養用フラスコ等の既存のプラスチック製細胞培養容器が挙げられる。適度な大きさの胚様体を得るためには、細胞培養用ディッシュ又は細胞培養用プレートであることが好ましい。胚様体形成用容器の材質は、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、アクリル樹脂が挙げられる。

本発明の幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器を用いての胚様体の形成方法では、少なくとも、以下の工程（Ｄ）及び（Ｅ）を有する。
幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器内面を、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合したアルコール系媒質溶液を用いて、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングして、乾燥する工程（Ａ）と、工程（Ａ）により作製された該容器内面上のコーティング膜に、水／アルコール系媒質溶液を１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／ｃｍ^２で添加してコーティング膜を膨潤させ、乾燥する工程（Ｂ）により形成した胚様体形成用容器を準備する工程（Ｄ）。
胚性幹細胞を、工程（Ｄ）の胚様体形成用容器内において浮遊培養する工程（Ｅ）。

本発明の胚様体形成用容器を用いて幹細胞を浮遊培養するには公知の培養方法を用いることができる。例えば、フィーダー細胞上で培養した未分化状態の幹細胞を、前記形成胚様体形成用容器内で公知の方法や条件等に従って浮遊培養することにより行なうことができる。この際、胚様体形成用容器内の培養液は、静置状態でも、緩やかに振とうしても良い。

前記培養液を構成する培地としては、従来のハンギング・ドロップ法等に用いられているウシ胎児血清や各種成長因子を加えた培地であれば良い。例えば、２０体積％ウシ胎児血清と各種成長因子を添加したＩｓｃｏｖｅ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（ＩＭＤＭ培地）や１０％体積ウシ胎児血清と各種成長因子を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ' Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ培地）等を用いることができる。

前記培養液中の幹細胞の濃度は、準備する胚様体形成用容器の大きさや形態等によって異なるが、通常１．０×１０^２〜１．０×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬである。特に、胚様体形成用容器として、９６穴プレートを用いる場合の前記幹細胞の濃度は、１．０×１０^３〜１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬであることが、再現性良く胚様体を形成できるので好ましい。

以下、実施例及び比較例により本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

まず以下の合成例１〜４において、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物である共重合体（１）〜（４）の合成例を示す。
（合成例１）
ＭＰＣ３５．７ｇ及びｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）４．３ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０（モル比））を、エタノール１６０ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃でアゾビスイソブチロニトリル０．８２ｇを加えて８時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ化し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２９．６ｇを得た。以下に示す条件のＧＰＣにより測定した重量平均分子量は１５３０００であった。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝８０／２０（モル比）であった。これをホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）の共重合体（１）とする。

＜ＧＰＣの測定条件＞
（１）試料：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール（６／４（体積比））混合溶媒に試料を溶解し、０．５重量％の重合体溶液を調製した。試料溶液の使用量は２０Ｌである。
（２）カラム：ＰＬｇｅｌ ５μｍ ＭＩＸＥＤＣ−Ｃ、２本直列（ポリマー・ラボラトリー社製）、カラム温度は４０℃、東ソー社製のインテグレーター内蔵分子量計算プログラム（ＳＣ−８０２０用ＧＰＣプログラム）にて調製した。
（３）溶出溶媒：０．５重量％臭化リチウムを含むクロロホルム／メタノール（６／４（体積％））混合溶媒、流速は１．０ｍＬ／分である。
（４）検出：示差屈折計、
（５）標準物質：ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）（ポリマー・ラボラトリー社製）。

（合成例２）
ＭＰＣ２３．５ｇ及びｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡ）２６．５ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０（モル比））をエタノール７５ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、５５℃でアゾビスイソブチロニトリル０．４１ｇを加えて２４時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿をろ化し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末３２．０ｇを得た。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は３５３，０００であった。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＢＭＡ＝３０／７０（モル比）であった。これを共重合体（２）とする。

（合成例３）
ＭＰＣ３８．０ｇ及びグリシジルメタクリレート２．０ｇ（ＧＭＡ）（ＭＰＣ／ＧＭＡ＝９０／１０（モル比））をイソプロパノール３５８ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、６０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４．８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果、ＭＰＣ／ＧＭＡは９０／１０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は５３０００であった。これを共重合体（３）とする。

（合成例４）
ＭＰＣ２５．９ｇ、ＢＭＡ１６．６ｇ及びメタクリル酸（ＭＡ）７．５ｇ（ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＭＡ＝３０／４０／３０（モル比））をｎ−プロパノール７５ｇに溶解して４つ口フラスコに入れ、３０分間窒素を吹き込んだ後、５０℃で２０重量％のｔ−ブチルパーオキシピバレートのトルエン溶液２．１８ｇを加えて５時間重合反応させた。重合液を３Ｌのジエチルエーテル中に撹拌しながら滴下し、析出した沈殿を濾過し、４８時間室温で真空乾燥を行って粉末２８．４ｇを得た。^１Ｈ−ＮＭＲにて組成分析した結果は、ＭＰＣ／ＢＭＡ／ＧＭＡ＝３０／４０／３０（モル比）であった。合成例１と同様にＧＰＣにより測定した重量平均分子量は１０８，０００であった。これを共重合体（４）とする。

（実施例１） 胚様体形成用容器の作製
合成例１で合成した共重合体（１）０．５ｇをエタノール１００ｍＬに溶解し、共重合体溶液を調製した。組織培養用Ｆ底ポリスチレン製９６穴プレート（Ｎｕｎｃ社製）の各ウェル（１ウェルあたりの面積は約０．３３ｃｍ^２）に前記共重合体溶液０．０３ｍＬを入れた後、室温で一晩乾燥させた。続いてレベリング用の後処理液として水／エタノール混合溶媒（重量比：７０／３０）を入れた後、室温で一晩乾燥した。得られたＦ底ポリスチレン製９６穴プレートを滅菌用バッグに入れた後、容器をＩＳＯ１１１３５−１に基づく滅菌基準を満たすように（ＳＡＬ＜１０^−６）エチレンオキサイドガス滅菌（ＥＯＧ滅菌）して胚様体形成用容器を作製した。

（実施例２〜６、比較例１〜６） 胚様体形成用容器の作製
以下の条件を表１および表２の記載の通りに変更した以外は、実施例１と同様にして、胚様体形成用容器を作製した。
まず共重合体の種類を変え、０．５ｇ秤量して１００ｍＬエタノールを加えて、共重合体溶液を調製した。共重合体溶液の添加量を変えて、組織培養用Ｆ底ポリスチレン製９６穴プレートの各ウェルに注入した後、乾燥させた。さらにレベリング用の後処理液の種類を変えて、室温で一晩乾燥させた。なお、レベリング用の後処理液を添加しないで胚様体形成用容器の作製を行った（比較例３）。また滅菌を、ＥＯＧ滅菌のほか、γ線滅菌、または電子線滅菌により実施した。

下記のマウス幹細胞の懸濁液の調製法により調製した５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス幹細胞の懸濁液を、実施例１〜６および比較例１〜６で作製した胚様体形成用容器に、各ウェル０．２ｍＬずつ播種した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で５日間培養した後に、位相差顕微鏡にて胚様体形成状態を観察した。

結果を表１および表２に示す。また、実施例３の胚様体形成用容器を用いて培養した胚様体についての位相差顕微鏡写真の写しを図１に示す。また、比較例３の胚様体形成用容器により形成した胚様体の位相差顕微鏡写真の写しを図２に示す。

なお表１および表２における細胞接着性の評価は、浮遊細胞除去後のウェルに残存する細胞を、ＭＴＴ試薬を用いたホルマザン産生量により定量評価して行った。細胞接着率が５％未満を合格とし、それ以上を不合格とした。
また表１および表２における胚様体形成の評価は、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成された場合をＡ、胚様体は形成されたが大きさや形状が十分でない場合をＢ、胚様体が形成されなかった場合をＣとした。

実施例１〜６で示されたように共重合体の添加量をコントロールする工程（A）と、レベリング処理を行う工程（B）を組み合わせる事により、全てのウェルに細胞が接着すること無く、分化するのに十分な大きさの胚様体が形成され、さらに、良好な顕微鏡での観察性を達成できることがわかった。

＜マウス幹細胞の懸濁液の調製法＞
（１）フィーダー細胞の培養
フィーダー細胞としてＳＩＭマウスの繊維芽細胞（以下、ＳＴＯ細胞と略記）を用いた。ＳＴＯ細胞は、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０体積％非動化処理したウシ胎児血清（ＦＣＳ）を添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ'ｓ ｍｅｄｉｕｍ（以下ＤＭＥＭ培地と略記、Ｇｉｂｃｏ社製）を用い培養した。培養したＳＴＯ細胞を１０μｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ溶液（Ｓｉｇｍａ社製）で３時間処理した後、細胞懸濁液とした。ＳＴＯ細胞の懸濁液を各ウェルに５×１０^５ｃｅｌｌｓになるように組織培養用６穴マルチディッシュに播種した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で１６時間以上培養してフィーダー細胞を調製した。

（２）マウス幹細胞の培養
幹細胞として１２９ＳＶマウスＥＳ細胞を用いた。幹細胞の培地は、１５％ＫｎｏｃｋＯｕｔ（登録商標）ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｇｉｂｃｏ社製）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ＭＥＭ ｎｏｎ−Ｅｓｓｅｔｉａｌ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン及び１０００ｕｎｉｔｓ／ｍＬのｍｕｒｉｎｅｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｆａｃｔｏｒ（ｍＬＩＦ：Ｃｈｅｍｉｃｏｎ社製）を含むＤＭＥＭ培地（以下、幹培地と略記）とした。前記（１）で調製したフィーダー細胞上に２×１０^５ｃｅｌｌ／ウェルで幹細胞を播種した。３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で３日間、マウス幹細胞を培養した。
前記（２）で培養したマウス幹細胞を０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで常法により剥がした後、１５％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ社製）、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ社製）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社製、ｍＬＩＦを含まない）に懸濁して、５×１０^３ｃｅｌｌｓ／ｍＬのマウス幹細胞の懸濁液を調製した。

本発明の胚様体形成容器の製造方法は、従来の胚様体形成用容器に比較して、均一化された容器表面を有しており、胚様体形成効率に優れ且つ光学観察性に優れる容器を提供することができる。

Claims (10)

1. 幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器の製造方法であって、幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器内面を、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合したアルコール系媒質溶液を用いて、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングして、乾燥する工程（Ａ）と、
   工程（Ａ）により作製された該容器内面上のコーティング膜に、水／アルコール系媒質溶液を１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／ｃｍ^２で添加してコーティング膜を膨潤させ、乾燥する工程（Ｂ）と
   を含む、胚様体形成用容器の製造方法。
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
   
2. エチレンオキサイドガスを用いて該容器の内面を滅菌する工程（Ｃ）をさらに含む、請求項１記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
3. ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、式（２）で表されるホスホリルコリン類似基含有単量体（Ｍ）と他の単量体との共重合体の少なくとも１種である、請求項１または２記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を、Ｒ^４は炭素数１〜６のアルキル基を、Ｒ^５は水素原子又はメチル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
   
4. 他の単量体が、アルキル（メタ）アクリレートまたはグリシジル（メタ）アクリレートを含む、請求項３に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
5. ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンと、ブチルメタクリレート、グリシジルメタクリレート及び／又はメタクリル酸との共重合体である、請求項１〜４のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
6. ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートとの共重合体である、請求項１〜５のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
7. ２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンとブチルメタクリレートの共重合体のモル比が、１０〜９０：９０〜１０である、請求項６に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
8. ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物が、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ブチルメタクリレート及びメタクリル酸との共重合体である、請求項１〜５のいずれか１に記載の胚様体形成用容器の製造方法。
   
9. 幹細胞を浮遊培養させ胚様体を形成するための胚様体形成用容器を用いての胚様体の形成方法であって、
   幹細胞を浮遊培養するための領域を形成するための容器内面を、式（１）で表されるホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物を混合したアルコール系媒質溶液を用いて、ホスホリルコリン類似基を側鎖に有する化合物の量が０．１〜１０ｍｇ／ｃｍ^２となるようにコーティングして、乾燥する工程（Ａ）と、工程（Ａ）により作製された該容器内面上のコーティング膜に、水／アルコール系媒質溶液を１５ｍｇ〜１５０ｍｇ／ｃｍ^２で添加してコーティング膜を膨潤させ、乾燥する工程（Ｂ）により形成した胚様体形成用容器を準備する工程（Ｄ）と、
   胚性幹細胞を、工程（Ｄ）の胚様体形成用容器内において浮遊培養する工程（Ｅ）と
   を含む胚様体の形成方法。
   （式中、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は同一もしくは異なる基であって、水素原子、炭素数１〜６のアルキル基又はヒドロキシアルキル基を示す。ｎは１〜４の整数である。）
   
10. 前記工程（Ｂ）の後に、エチレンオキサイドガスを用いて前記容器の内面を滅菌する工程（Ｃ）をさらに含む、請求項９に記載の胚様体形成方法。