KR102391270B1 - 배양체 형성용 용기의 제조 방법 - Google Patents

배양체 형성용 용기의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

(과제) 본 발명의 목적은, 배양체의 형성성이 우수하고, 광학 관찰에 바람직한 배양체 형성용 용기의 제조 방법을 제공하는 것이다.
(해결 수단) 특정한 양으로 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 용기 내면에 부여하여 건조시킴으로써 코팅막을 형성하고, 그 후 코팅막을 특정한 양의 처리액에 의해 레벨링한다는 2 개의 공정을 거침으로써, 효율적으로 배양체를 형성하고, 또한 광학 관찰성이 우수한 배양체 형성용 용기를 제조할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.

Description

배양체 형성용 용기의 제조 방법 {METHOD FOR PRODUCING CONTAINER FOR FORMING EMBRYOID BODY}
본 발명은, 배양체 (胚樣體) 를 형성할 때에 사용하는 배양체 형성용 용기의 제조 방법에 관한 것이다.
본 출원은, 참조에 의해 여기에 원용되는 일본 출원, 일본 특허출원 2014-224752호 우선권을 청구한다.
배성간세포나 체성간세포 등의 간세포는, 시험관 내에서 다양한 세포로 분화되는 능력을 갖는다. 간세포를 시험관 내에서 분화시키는 방법으로서, 간세포를 부유 배양함으로써 배양체로 불리는 의사적인 배 (胚) 를 형성시키는 방법, 스트로마 세포와 같이 분화와 증식을 지지하는 세포와 간세포를 공배양하는 방법이 이용되고 있다. 이 중 부유 배양은, 간세포를 시험관 내에서 분화시킬 때에 가장 널리 사용되는 방법이다. 예를 들어 마우스 배성간세포는, LIF (백혈병 저지 인자 : leukemia inhibitory factor) 를 첨가하지 않고, 샬레 등의 배양 용기에 있어서 접착하지 않도록 부유 배양시킴으로써 세포 덩어리를 형성한다. 부유 배양으로 형성된 세포 덩어리는, 배양체 (EB) 라고 불린다. 얻어진 세포 덩어리는, 그 후, 다양한 종류의 세포로 분화되는 것이 알려져 있다.
배양체 (EB) 는, 이중의 세포층으로 이루어지는 볼과 같은 구조를 가지며, 외층은 근위 내배엽, 내층은 배체 외배엽에 해당한다. 2 개의 배엽은, 기저막에 의해 가로막혀 있다. 배양체의 구조는, 마우스의 6 일배 (日胚) 인 원통배에 매우 닮아 있고, 그 범위에 있어서 배의 정상적인 발생 단계에 가깝다. 배양체에 있어서는, 중배엽의 유도도 일어나고, 심근 세포, 혈액 세포, 나아가서는 원시적인 혈관망도 발생한다. 또, 배양체를 배양 샬레에 부착시켜 배양을 계속하면 다양한 종류의 세포로 분화된다. 예를 들어, 신경 세포, 케라티노사이트, 연골 세포, 지방 세포 등이 포함된다. 배양체의 형성을 거쳐 분화되는 세포는, 체세포에 한정되지 않고, 최근에는 생식 세포 계보에 대한 분화도 일어나는 것이 확인되고 있다. 간세포의 다분화능을 이용하기 위해서는, 배양체를 형성시키는 것이 바람직하다.
일반적으로, 세포 덩어리를 형성하는 기술로서, 아래로 늘어진 액적 중에서 세포를 배양하는 행잉·드롭법이나, 비특허문헌 1 에 기재된 선회 배양법이나 원심법이 알려져 있다. 그러나, 이들 방법은 배양 조건의 설정이 번잡하다.
특허문헌 1 에는, 세포 덩어리를 형성시키기 위한 용기로서, 폴리하이드록실에틸메타크릴레이트나 에틸렌비닐알코올 공중합체 등으로 형성된 배양 용기가 개시되어 있다.
또 특허문헌 2 에는, 간세포의 하나인 ES 세포를 부유 배양하여 배양체를 형성하는 방법이 개시되어 있다. 특허문헌 2 의 배양체 형성 방법에서는, 포스포릴콜린 유사기를 갖는 중합체로 피복한 배양체 형성용 용기가 사용되고 있다. 특허문헌 2 에는, 당해 중합체에 의해 배양체 형성용 용기를 피복하기 위한 방법이 개시되어 있지만, 상세한 검토는 이루어지지 않았다.
일본 공개특허공보 평6-327462호 국제공개 제2005/001019호 팜플렛
Biotechnol. J. 2008, 3, 1172-1184
포스포릴콜린 유사기를 갖는 중합체로 피복한 배양체 형성용 용기는, 코팅 불균일 때문에 세포 접착성에 편차가 발생한다는 문제나, 코팅 막두께가 높을 때에는 용기에 코팅막의 모양이 생겨, 배양체의 형성을 확인하는 것 등의 현미경 관찰시에, 배경에 모양이 비친다는 문제가 있다. 즉, 포스포릴콜린 유사기를 갖는 중합체로 피복한 배양체 형성용 용기에서는, 배양체 형성 및 배양체로부터 분화되는 세포의 광학 관찰시에 문제가 있다. 본 발명은 이러한 종래의 배양체 형성용 용기의 문제를 해결하는 것을 목적으로 하는 것이다. 따라서 본 발명의 목적은, 배양체의 형성성이 우수하고, 광학 관찰에 바람직한 배양체 형성용 용기의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 특정한 양으로 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 용기 내면에 부여하여 건조시킴으로써 코팅막을 형성하고, 그 후 코팅막을 특정한 양으로 처리액을 사용하여 레벨링한다는 2 개의 공정을 거침으로써, 효율적으로 배양체를 형성하고, 또한 광학 관찰성이 우수한 배양체 형성용 용기를 제조할 수 있는 것을 알아내어, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하로 이루어진다.
1. 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성하기 위한 배양체 형성용 용기의 제조 방법으로서, 간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면을, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합한 알코올계 매질 용액을 사용하여, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 코팅하여, 건조시키는 공정 (A) 와,
공정 (A) 에 의해 제작된 그 용기 내면 상의 코팅막에, 물/알코올계 매질 용액을 15 ㎎ ∼ 150 ㎎/㎠ 로 첨가하여 코팅막을 팽윤시키고, 건조시키는 공정 (B) 를 포함하는, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
[화학식 1]
Figure 112017035177814-pct00001
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
2. 에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 그 용기의 내면을 멸균하는 공정 (C) 를 추가로 포함하는, 전항 1 에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
3. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 식 (2) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 적어도 1 종인, 전항 1 또는 2 에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
[화학식 2]
Figure 112017035177814-pct00002
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를, R4 는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기를, R5 는 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
4. 다른 단량체가, 알킬(메트)아크릴레이트 또는 글리시딜(메트)아크릴레이트를 포함하는, 전항 3 에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
5. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 부틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 및/또는 메타크릴산의 공중합체인, 전항 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
6. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 하나에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
7. 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체의 몰비가 10 ∼ 90 : 90 ∼ 10 인, 전항 6 에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
8. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 부틸메타크릴레이트 및 메타크릴산과의 공중합체인, 전항 1 ∼ 5 중 어느 하나에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
9. 전항 1 ∼ 8 중 어느 하나에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법으로 제조된 배양체 형성용 용기.
10. 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성하기 위한 배양체 형성용 용기를 사용한 배양체의 형성 방법으로서,
간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면을, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합한 알코올계 매질 용액을 사용하여, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 코팅하여, 건조시키는 공정 (A) 와, 공정 (A) 에 의해 제작된 그 용기 내면 상의 코팅막에, 물/알코올계 매질 용액을 15 ㎎ ∼ 150 ㎎/㎠ 로 첨가하여 코팅막을 팽윤시키고, 건조시키는 공정 (B) 에 의해 형성한 배양체 형성용 용기를 준비하는 공정 (D) 와,
배성간세포를, 공정 (D) 의 배양체 형성용 용기 내에 있어서 부유 배양하는 공정 (E) 를 포함하는 배양체의 형성 방법.
[화학식 3]
Figure 112017035177814-pct00003
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
11. 상기 공정 (B) 후에, 에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 그 용기의 내면을 멸균하는 공정 (C) 를 추가로 포함하는, 전항 10 에 기재된 배양체의 형성 방법.
12. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 식 (2) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 적어도 1 종인, 전항 11 또는 12 에 기재된 배양체의 형성 방법.
[화학식 4]
Figure 112017035177814-pct00004
(식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를, R4 는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기를, R5 는 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
13. 다른 단량체가, 알킬(메트)아크릴레이트 또는 글리시딜(메트)아크릴레이트를 포함하는, 전항 12 에 기재된 배양체의 형성 방법.
14. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 부틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 및/또는 메타크릴산의 공중합체인, 전항 10 ∼ 13 중 어느 하나에 기재된 배양체의 형성 방법.
15. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체인, 전항 10 ∼ 14 중 어느 하나에 기재된 배양체의 형성 방법.
16. 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체의 몰비가 10 ∼ 90 : 90 ∼ 10 인, 전항 15 에 기재된 배양체의 형성 방법.
17. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 부틸메타크릴레이트 및 메타크릴산과의 공중합체인, 전항 10 ∼ 14 중 어느 하나에 기재된 배양체의 형성 방법.
본 발명의 배양체 형성용 용기의 제조 방법은, 종래의 것과 비교하여, 용기 표면이 균질한 배양체 형성용 용기를 제공할 수 있다. 본 발명의 제조 방법에 의해 제작된 배양체 형성용 용기는, 배양체 형성 효율이 우수하고 또한 광학 관찰성이 우수하여, 유용하다.
도 1 은, 실시예 3 의 배양체 형성용 용기에 의해 형성한 배양체의 위상차 현미경 사진의 사본이다.
도 2 는, 비교예 3 의 배양체 형성용 용기에 의해 형성한 배양체의 위상차 현미경 사진의 사본이다.
본 발명은, 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성시키기 위해서 사용하는 배양체 형성용 용기를 제조하는 방법이다. 본 발명에 있어서 간세포란, 자기 복제능과 다양한 세포로 분화되는 능력 (다분화능) 을 갖는 세포이다. 간세포로는, 배성간세포 (ES 세포), 체성간세포, 인공 다능성 간세포 (iPS 세포) 등이 예시된다.
본 발명의 배양체 형성용 용기의 제조 방법은, 이하의 공정 (A) 및 공정 (B) 를 포함한다.
공정 (A) 는, 이하의 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합 (용해) 한 알코올계 매질 용액 (이하 간단히 「포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액」이라고 한다) 을, 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면 (내표면) 에, 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 부여하여 코팅하고, 건조시키는 공정이다.
[화학식 5]
Figure 112017035177814-pct00005
상기 식 (1) 에 있어서 R1, R2 및 R3 은, 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.
상기 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기로는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로헥실기, 페닐기 등을 들 수 있다. 상기 탄소수 1 ∼ 6 의 하이드록시알킬기로는, 예를 들어, 하이드록시메틸기, 2-하이드록시에틸기, 3-하이드록시프로필기, 4-하이드록시부틸기, 5-하이드록시펜틸기, 6-하이드록시헥실기 등을 들 수 있다.
상기 공정 (A) 에 의해, 원하는 용기 내면에 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 코팅막을 형성 (피복층을 부여) 할 수 있고, 당해 용기 내면에 포스포릴콜린 유사기를 갖는 표면으로 할 수 있다.
공정 (A) 에서는, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을, 원하는 용기 내면에 부여하여 코팅한 후, 즉 원하는 용기 내면 상에 당해 용액으로 이루어지는 용액층이 생긴 후, 당해 용액층을 건조시킨다. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을, 원하는 용기 내면에 코팅하는 수단으로는, 예를 들어, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액 중에 용기를 침지 처리하여 끌어 올리는 수단, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을 원하는 용기 내면에 첨가 또는 주입하는 수단, 또는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을 원하는 용기 내면에 분사하는 수단을 들 수 있다. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을 원하는 용기 내면에 첨가 또는 주입하는 수단은, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 확실하게 원하는 용기 내면에 부여할 수 있고, 또한 당해 용액의 코팅량을 조절할 수 있으므로 바람직하다. 또 용기 내면을 건조시키는 수단은, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 것이면, 어떠한 수단을 사용해도 된다.
포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 용액을 원하는 용기 내면에 코팅하는 조건으로는, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 용기 내면 1 ㎠ 당 0.1 ∼ 10 ㎎ (0.1 ∼ 10 ㎎/㎠), 바람직하게는 0.15 ∼ 1 ㎎ 이 되도록 부여한다. 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ㎎/㎠ 미만이면, 코팅이 불균일해지고, 세포가 용기 내면에 접착하여, 배양체 형성이 불충분해진다. 또 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 10 ㎎/㎠ 보다 높으면, 코팅 불균일이 크게 발생하여, 현미경에서의 관찰성이 나쁘다. 또한, 공정 (A) 후에 실시하는 레벨링 처리에 의해 해소할 수 없어, 표면에 모양이 발생한다. 또 원료 비용도 크게 들기 때문에 실용성이 부족하다.
식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물은, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 갖는 중합체가 바람직하고, 포스포릴콜린 유사기를 갖는 폴리머이면 된다. 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물은, 예를 들어 식 (2) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 의 단독 중합체, 및 그 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 적어도 1 종이 바람직하고, 그 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 적어도 1 종이 보다 바람직하다.
[화학식 6]
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상기 식 (2) 중, R1, R2, R3 및 n 은 식 (1) 과 동일하고, R4 는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기를 나타내고, R5 는 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다. 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기의 정의는, 식 (1) 과 동일하다.
식 (2) 로 나타내는 단량체 (M) 으로는, 예를 들어, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 3-((메트)아크릴로일옥시)프로필-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 4-((메트)아크릴로일옥시)부틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 5-((메트)아크릴로일옥시)펜틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 6-((메트)아크릴로일옥시)헥실-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리에틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리프로필암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리부틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리시클로헥실암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리페닐암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)프로필-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)부틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)펜틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트, 2-((메트)아크릴로일옥시)헥실-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트 등을 들 수 있다.
식 (2) 로 나타내는 단량체 (M) 으로는, 그 중에서도 2-((메트)아크릴로일옥시)에틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트가 바람직하고, 또한 2-(메타크릴로일옥시)에틸-2'-(트리메틸암모니오)에틸포스페이트 (2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린이라고도 한다. 이하, MPC 라고 약기) 가 입수성, 및 간세포의 용기에 대한 접착을 방지하여 배양체 형성능을 발현시키는 점에서 바람직하다.
상기 공중합체를 얻기 위한 다른 단량체로는, 소수성 단량체, 2-하이드록시에틸(메트)아크릴레이트, 2-하이드록시부틸(메트)아크릴레이트, 4-하이드록시부틸(메트)아크릴레이트 등의 수산기 함유 (메트)아크릴레이트, 아크릴산, 메타크릴산, 스티렌술폰산, (메트)아크릴로일옥시포스폰산, 2-하이드록시-3-(메트)아크릴로일옥시프로필트리메틸암모늄클로라이드 등의 이온성기 함유 단량체, (메트)아크릴아미드, 아미노에틸메타크릴레이트, 디메틸아미노에틸(메트)아크릴레이트 등의 함질소 단량체, 폴리에틸렌글리콜(메트)아크릴레이트, 글리시딜(메트)아크릴레이트 또는 이들의 2 종 이상의 혼합물 등을 들 수 있다.
상기 소수성 단량체로는, 예를 들어, 메틸(메트)아크릴레이트, 에틸(메트)아크릴레이트, 부틸(메트)아크릴레이트, 2-에틸헥실(메트)아크릴레이트, 라우릴(메트)아크릴레이트, 스테아릴(메트)아크릴레이트 등의 직사슬 또는 분기 알킬(메트)아크릴레이트, 시클로헥실(메트)아크릴레이트 등의 고리형 알킬(메트)아크릴레이트, 벤질(메트)아크릴레이트, 페녹시에틸(메트)아크릴레이트 등의 방향족 (메트)아크릴레이트, 폴리프로필렌글리콜(메트)아크릴레이트 등의 소수성 폴리알킬렌글리콜(메트)아크릴레이트, 스티렌, 메틸스티렌, 클로로메틸스티렌 등의 스티렌계 단량체, 메틸비닐에테르, 부틸비닐에테르 등의 비닐에테르계 단량체, 아세트산비닐, 프로피온산비닐 등의 비닐에스테르계 단량체 또는 이들의 2 종 이상의 혼합물 등을 들 수 있다.
상기 공중합체에 있어서, 단량체 (M) 에서 유래되는 구성 단위는, 공중합체의 구성 단위 중 10 몰％ 이상 90 몰％ 이하, 바람직하게는 30 몰％ 이상 80 몰％ 이하이다. 단량체 (M) 에서 유래되는 구성 단위가 10 몰％ 이상 90 몰％ 이하이면, 용기 표면을 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기에 의해 피복할 수 있고, 피복 효과가 충분히 발휘된다.
상기 공중합체에 있어서, 다른 단량체로서 소수성 단량체가 포함되는 경우, 소수성 단량체에서 유래되는 구성 단위는, 공중합체의 구성 단위 중 90 몰％ 이하가 바람직하고, 특히 20 ∼ 90 몰％ 가 바람직하다. 소수성 단량체에서 유래되는 구성 단위를 갖는 공중합체는, 내용출성이 향상되는데, 소수성 단량체에서 유래되는 구성 단위가 90 몰％ 를 초과하면, 용기 표면에 있어서의 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기의 피복량이 적어지고, 피복 효과를 충분히 발휘할 수 없게 될 우려가 있으므로 바람직하지 않다.
다른 단량체로서, 상기 서술한 소수성 단량체 이외의 단량체에서 유래되는 구성 단위가 공중합체에 포함되면 내용출성이 향상되고, 배지 등에 계면 활성제, 유기 용제를 사용할 수 있게 되므로 바람직하다. 예를 들어, 소수성 단량체 이외의 다른 단량체로서, 글리시딜(메트)아크릴레이트를 사용한 공중합체는, 용기 표면의 아미노기, 카르복실기 등과 반응시킬 수 있고, 그 공중합체를, 원하는 표면에 화학적으로 결합시킬 수 있다. 상기 공중합체에 있어서, 소수성 단량체 이외의 다른 단량체에서 유래되는 구성 단위의 비율은, 70 몰％ 이하가 바람직하다.
식 (2) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 의 단독 중합체, 또는 그 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 분자량은, 중량 평균 분자량으로 통상 5,000 ∼ 5,000,000 이고, 간세포의 용기에 대한 접착을 유효하게 방지할 수 있고, 배양체 형성능을 발현시키고, 중합체의 내용출성을 향상시키는 점에서 10,000 ∼ 2,000,000 이 바람직하다. 중량 평균 분자량은, 후술하는 실시예에 기재된 방법에 의해 측정할 수 있다.
포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 포함하는 알코올계 매질 용액은, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 알코올계 용매에 혼합하여 용해시킨 용액이면 어떠한 것이어도 된다. 알코올계 용매로는, 저급 알코올이 바람직하고, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올 등이나 그들의 혼합물이 예시된다.
포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물은, 바람직하게는 이하를 예시할 수 있는데 특별히 한정되지 않는다.
2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 부틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 및/또는 메타크릴산의 공중합체
2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체
2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체로서, 몰비가 10 ∼ 90 : 90 ∼ 10 인 공중합체
2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 부틸메타크릴레이트 및 메타크릴산과의 공중합체
본 발명의 배양체 형성용 용기의 제조 방법은, 공정 (A) 를 거친 후, 용기 내면에 형성된 요철이나 불균일을 갖는 코팅막 상에, 물/알코올계 매질 용액을 부여하여 코팅막을 팽윤시켜, 코팅막을 건조시키는 공정 (B) 를 포함한다. 공정 (B) 에서는, 공정 (A) 에 의해 형성된 코팅막을 물/알코올계 매질 용액으로 팽윤시킨 후에 다시 건조시킴으로써, 레벨링 처리가 실시된다. 레벨링 처리란, 코팅막의 노출 표면을 평활화하여 균질화하고, 코팅막을 균일한 막두께로 하여 요철이나 불균일을 형성시키지 않도록 하는 처리를 말한다. 공정 (B) 에서는 물/알코올계 매질 용액을 사용함으로써, 물/알코올계 매질 용액의 증산 속도를 저하시킴으로써, 레벨링 처리하는 것으로 하였다. 일반적인 레벨링 처리에는 증점제나 소포제 등의 첨가제의 첨가가 있지만, 이들 첨가제는, 본 발명의 효과를 가질 수 없다.
그 용기 내면의 코팅막 상에 첨가되는 물/알코올계 매질 용액의 양은, 15 ㎎ ∼ 250 ㎎/㎠ 이고, 바람직하게는 30 ∼ 190 ㎎/㎠ 이다. 용액의 양이 30 ㎎ ∼ 190 ㎎/㎠ 의 범위 내이면, 코팅막에 균일하게 용액이 널리 퍼지고, 코팅막을 충분히 팽윤시킬 수 있고, 레벨링 처리를 실시할 수 있다.
공정 (B) 에 있어서의 물/알코올계 매질 용액은, 공정 (A) 에 있어서 형성된 코팅막을 레벨링 처리 가능한 것이면 어떠한 것이어도 된다. 물/알코올계 매질 용액에 포함되는 알코올계 용매는, 저급 알코올이 바람직하다. 물/알코올계 매질 용액은, 예를 들어 물과 메탄올, 물과 에탄올, 물과 2-프로판올, 또는 이들의 혼합액을 조합한 혼합 용매를 들 수 있다. 물과 알코올계 용매의 비율은, 공정 (A) 에 의해 얻어진 코팅막의 레벨링 처리가 가능한 것이면 되는데, 증산 속도의 관계로부터, 물 10 ∼ 50 중량％, 알코올계 용매 50 ∼ 90 중량％ 가 바람직하다.
본 발명의 배양체 형성용 용기의 제조 방법은, 공정 (A) 및 공정 (B) 를 거친 후, 균질화된 코팅막을 갖는 용기 내면을 멸균하는 공정 (C) 를 포함하는 것이 바람직하다. 멸균하는 수단으로는, 본 발명의 목적을 저해하지 않는 것이면, 어떠한 멸균 수단을 사용해도 된다. 예를 들어, 에틸렌옥사이드 가스 (EOG) 에 의한 멸균 처리, 감마선에 의한 멸균 처리, 전자선에 의한 멸균 처리 등이 예시되는데, EOG 에 의한 멸균 처리가 다른 멸균 처리와 비교하여 세포 접착 억제 면에서 바람직하다.
본 발명의 배양체 형성용 용기의 형상은, 간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성할 수 있는 형상이라면 어떠한 것이어도 된다. 배양체 형성용 용기의 형상으로는, 평저, 깔때기 형상의 V 바닥, 반구상의 환저 등의 용기를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 평저이다. 본 발명의 배양체 형성용 용기로는, 세포 배양용 디쉬, 세포 배양용 멀티 디쉬, 세포 배양용 플레이트, 세포 배양용 백, 세포 배양용 플라스크 등의 기존의 플라스틱제 세포 배양 용기를 들 수 있다. 적당한 크기의 배양체를 얻기 위해서는, 세포 배양용 디쉬 또는 세포 배양용 플레이트인 것이 바람직하다. 배양체 형성용 용기의 재질은, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 아크릴 수지를 들 수 있다.
본 발명의 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성하기 위한 배양체 형성용 용기를 사용한 배양체의 형성 방법에서는, 적어도 이하의 공정 (D) 및 (E) 를 갖는다.
간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면을, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합한 알코올계 매질 용액을 사용하여, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 코팅하여, 건조시키는 공정 (A) 와, 공정 (A) 에 의해 제작된 그 용기 내면 상의 코팅막에, 물/알코올계 매질 용액을 15 ㎎ ∼ 150 ㎎/㎠ 로 첨가하여 코팅막을 팽윤시키고, 건조시키는 공정 (B) 에 의해 형성한 배양체 형성용 용기를 준비하는 공정 (D).
배성간세포를, 공정 (D) 의 배양체 형성용 용기 내에 있어서 부유 배양하는 공정 (E).
본 발명의 배양체 형성용 용기를 사용하여 간세포를 부유 배양하기 위해서는 공지된 배양 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 피더 세포 상에서 배양한 미분화 상태의 간세포를, 상기 배양체 형성용 용기 내에서 공지된 방법이나 조건 등에 따라 부유 배양함으로써 실시할 수 있다. 이 때, 배양체 형성용 용기 내의 배양액은, 정치 (靜置) 상태에서도, 천천히 진탕해도 된다.
상기 배양액을 구성하는 배지로는, 종래의 행잉·드롭법 등에 사용되고 있는 소 태아 혈청이나 각종 성장 인자를 첨가한 배지이면 된다. 예를 들어, 20 체적％ 소 태아 혈청과 각종 성장 인자를 첨가한 이스코브의 변형 둘베코 배지 (Iscove's modified Dulbecco's medium) (IMDM 배지) 나 10 체적％ 소 태아 혈청과 각종 성장 인자를 첨가한 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle medium) (DMEM 배지) 등을 사용할 수 있다.
상기 배양액 중의 간세포의 농도는, 준비하는 배양체 형성용 용기의 크기나 형태 등에 따라 상이한데, 통상 1.0 × 102 ∼ 1.0 × 106 cells/㎖ 이다. 특히, 배양체 형성용 용기로서, 96 웰 플레이트를 사용하는 경우의 상기 간세포의 농도는, 1.0 × 103 ∼ 1.0 × 105 cells/㎖ 인 것이, 양호한 재현성으로 배양체를 형성할 수 있으므로 바람직하다.
실시예
이하, 실시예 및 비교예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않는다.
먼저 이하의 합성예 1 ∼ 4 에 있어서, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물인 공중합체 (1) ∼ (4) 의 합성예를 나타낸다.
(합성예 1)
MPC 35.7 g 및 n-부틸메타크릴레이트 (BMA) 4.3 g (MPC/BMA = 80/20 (몰비))을, 에탄올 160 g 에 용해하여 4 구 플라스크에 넣고, 30 분간 질소를 불어 넣은 후, 60 ℃ 에서 아조비스이소부티로니트릴 0.82 g 을 첨가하여 8 시간 중합 반응시켰다. 중합액을 3 ℓ 의 디에틸에테르 중에 교반하면서 적하하고, 석출된 침전을 여과하고, 48 시간 실온에서 진공 건조를 실시하여 분말 29.6 g 을 얻었다. 이하에 나타내는 조건의 GPC 에 의해 측정한 중량 평균 분자량은 153000 이었다. 1H-NMR 로 조성 분석한 결과, MPC/BMA = 80/20 (몰비) 이었다. 이것을 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 의 공중합체 (1) 로 한다.
＜GPC 의 측정 조건＞
(1) 시료 : 0.5 중량％ 브롬화리튬을 포함하는 클로로포름/메탄올 (6/4 (체적비)) 혼합 용매에 시료를 용해하고, 0.5 중량％ 의 중합체 용액을 조제하였다. 시료 용액의 사용량은 20 ℓ 이다.
(2) 칼럼 : PLgel 5 ㎛ MIXED-C, 2 개 직렬 (폴리머·래보러토리사 제조), 칼럼 온도는 40 ℃, 도소사 제조의 인터그레이터 내장 분자량 계산 프로그램 (SC-8020 용 GPC 프로그램) 으로 준비하였다.
(3) 용출 용매 : 0.5 중량％ 브롬화리튬을 포함하는 클로로포름/메탄올 (6/4 (체적％)) 혼합 용매, 유속은 1.0 ㎖/분이다.
(4) 검출 : 시차 굴절계,
(5) 표준 물질 : 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) (폴리머·래보러토리사 제조).
(합성예 2)
MPC 23.5 g 및 n-부틸메타크릴레이트 (BMA) 26.5 g (MPC/BMA = 30/70 (몰비)) 을 에탄올 75 g 에 용해하여 4 구 플라스크에 넣고, 30 분간 질소를 불어 넣은 후, 55 ℃ 에서 아조비스이소부티로니트릴 0.41 g 을 첨가하여 24 시간 중합 반응시켰다. 중합액을 3 ℓ 의 디에틸에테르 중에 교반하면서 적하하고, 석출된 침전을 여과하고, 48 시간 실온에서 진공 건조를 실시하여 분말 32.0 g 을 얻었다. 합성예 1 과 동일하게 GPC 에 의해 측정한 중량 평균 분자량은 353,000 이었다. 1H-NMR 로 조성 분석한 결과, MPC/BMA = 30/70 (몰비) 이었다. 이것을 공중합체 (2) 로 한다.
(합성예 3)
MPC 38.0 g 및 글리시딜메타크릴레이트 2.0 g (GMA) (MPC/GMA = 90/10 (몰비)) 을 이소프로판올 358 g 에 용해하여 4 구 플라스크에 넣고, 30 분간 질소를 불어 넣은 후, 60 ℃ 에서 20 중량％ 의 t-부틸퍼옥시피발레이트의 톨루엔 용액 2.18 g 을 첨가하여 5 시간 중합 반응시켰다. 중합액을 3 ℓ 의 디에틸에테르 중에 교반하면서 적하하고, 석출된 침전을 여과하고, 4.8 시간 실온에서 진공 건조를 실시하여 분말 28.4 g 을 얻었다. 1H-NMR 로 조성 분석한 결과, MPC/GMA 는 90/10 (몰비) 이었다. 합성예 1 과 동일하게 GPC 에 의해 측정한 중량 평균 분자량은 53000 이었다. 이것을 공중합체 (3) 으로 한다.
(합성예 4)
MPC 25.9 g, BMA 16.6 g 및 메타크릴산 (MA) 7.5 g (MPC/BMA/MA = 30/40/30 (몰비)) 을 n-프로판올 75 g 에 용해하여 4 구 플라스크에 넣고, 30 분간 질소를 불어 넣은 후, 50 ℃ 에서 20 중량％ 의 t-부틸퍼옥시피발레이트의 톨루엔 용액 2.18 g 을 첨가하여 5 시간 중합 반응시켰다. 중합액을 3 ℓ 의 디에틸에테르 중에 교반하면서 적하하고, 석출된 침전을 여과하고, 48 시간 실온에서 진공 건조를 실시하여 분말 28.4 g 을 얻었다. 1H-NMR 로 조성 분석한 결과는, MPC/BMA/GMA = 30/40/30 (몰비) 이었다. 합성예 1 과 동일하게 GPC 에 의해 측정한 중량 평균 분자량은 108,000 이었다. 이것을 공중합체 (4) 로 한다.
(실시예 1) 배양체 형성용 용기의 제작
합성예 1 에서 합성한 공중합체 (1) 0.5 g 을 에탄올 100 ㎖ 에 용해하고, 공중합체 용액을 조제하였다. 조직 배양용 F 바닥 폴리스티렌제 96 웰 플레이트 (Nunc 사 제조) 의 각 웰 (1 웰당 면적은 약 0.33 ㎠) 에 상기 공중합체 용액 0.03 ㎖ 를 넣은 후, 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 계속해서 레벨링용 후처리액으로서 물/에탄올 혼합 용매 (중량비 : 70/30) 를 넣은 후, 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 얻어진 F 바닥 폴리스티렌제 96 웰 플레이트를 멸균용 백에 넣은 후, 용기를 ISO11135-1 에 기초하는 멸균 기준을 만족하도록 (SAL ＜ 10-6) 에틸렌옥사이드 가스 멸균 (EOG 멸균) 하여 배양체 형성용 용기를 제작하였다.
(실시예 2 ∼ 6, 비교예 1 ∼ 6) 배양체 형성용 용기의 제작
이하의 조건을 표 1 및 표 2 에 기재된 바와 같이 변경한 것 이외에는, 실시예 1 과 동일하게 하여, 배양체 형성용 용기를 제작하였다.
먼저 공중합체의 종류를 바꾸고, 0.5 g 칭량하여 100 ㎖ 에탄올을 첨가하고, 공중합체 용액을 조제하였다. 공중합체 용액의 첨가량을 바꾸고, 조직 배양용 F 바닥 폴리스티렌제 96 웰 플레이트의 각 웰에 주입한 후, 건조시켰다. 또한 레벨링용 후처리액의 종류를 바꾸고, 실온에서 하룻밤 건조시켰다. 또한, 레벨링용 후처리액을 첨가하지 않고 배양체 형성용 용기의 제작을 실시하였다 (비교예 3). 또 멸균을, EOG 멸균 외에, γ 선 멸균, 또는 전자선 멸균에 의해 실시하였다.
하기의 마우스 간세포의 현탁액의 조제법에 의해 조제한 5 × 103 cells/㎖ 의 마우스 간세포의 현탁액을, 실시예 1 ∼ 6 및 비교예 1 ∼ 6 에서 제작한 배양체 형성용 용기에, 각 웰 0.2 ㎖ 씩 파종하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 5 일간 배양한 후에, 위상차 현미경으로 배양체 형성 상태를 관찰하였다.
결과를 표 1 및 표 2 에 나타낸다. 또, 실시예 3 의 배양체 형성용 용기를 사용하여 배양한 배양체에 대한 위상차 현미경 사진의 사본을 도 1 에 나타낸다. 또, 비교예 3 의 배양체 형성용 용기에 의해 형성한 배양체의 위상차 현미경 사진의 사본을 도 2 에 나타낸다.
또한 표 1 및 표 2 에 있어서의 세포 접착성의 평가는, 부유 세포 제거 후의 웰에 잔존하는 세포를, MTT 시약을 사용한 포르마잔 산생량에 의해 정량 평가하여 실시하였다. 세포 접착률이 5 ％ 미만을 합격으로 하고, 그 이상을 불합격으로 하였다.
또 표 1 및 표 2 에 있어서의 배양체 형성 평가는, 분화되는 데에 충분한 크기의 배양체가 형성된 경우를 A, 배양체는 형성되었지만 크기나 형상이 충분하지 않은 경우를 B, 배양체가 형성되지 않은 경우를 C 로 하였다.
실시예 1 ∼ 6 에서 나타낸 바와 같이 공중합체의 첨가량을 컨트롤하는 공정 (A) 와, 레벨링 처리를 실시하는 공정 (B) 를 조합함으로써, 모든 웰에 세포가 접착하지 않고, 분화되는 데에 충분한 크기의 배양체가 형성되고, 또한 양호한 현미경에서의 관찰성을 달성할 수 있는 것을 알았다.
Figure 112017035177814-pct00007
Figure 112017035177814-pct00008
＜마우스 간세포의 현탁액의 조제법＞
(1) 피더 세포의 배양
피더 세포로서 SIM 마우스의 섬유아세포 (이하, STO 세포라고 약기) 를 사용하였다. STO 세포는, 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 10 체적％ 비동화 처리한 소 태아 혈청 (FCS) 을 첨가한 둘베코의 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium) (이하 DMEM 배지라고 약기, Gibco 사 제조) 를 사용하여 배양하였다. 배양한 STO 세포를 10 ㎍/㎖ 의 마이트마이신 C 용액 (Sigma 사 제조) 으로 3 시간 처리한 후, 세포 현탁액으로 하였다. STO 세포의 현탁액을 각 웰에 5 × 105 cells 가 되도록 조직 배양용 6 홀 멀티디쉬에 파종하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 16 시간 이상 배양하여 피더 세포를 조제하였다.
(2) 마우스 간세포의 배양
간세포로서 129 SV 마우스 ES 세포를 사용하였다. 간세포의 배지는, 15 ％ KnockOut (등록 상표) 혈청 대체물 (serum replacement) (KSR : Gibco 사 제조), 1 mM 피루브산나트륨 (Gibco 사 제조), 0.1 mM MEM 비필수 아미노산 (non-Essential amino acids) (Gibco 사 제조), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Sigma 사 제조), 100 units/㎖ 페니실린, 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 및 1000 units/㎖ 의 쥐백혈병 저해 인자 (murineleukemia inhibitory factor) (mLIF : Chemicon 사 제조) 를 포함하는 DMEM 배지 (이하, 간 (幹) 배지라고 약기) 로 하였다. 상기 (1) 에서 조제한 피더 세포 상에 2 × 105 cell/웰로 간세포를 파종하였다. 37 ℃, 5 ％ CO2 의 조건하에서 3 일간, 마우스 간세포를 배양하였다.
상기 (2) 에서 배양한 마우스 간세포를 0.1 ％ 트립신-EDTA 로 통상적인 방법에 의해 벗긴 후, 15 ％ 소 태아 혈청 (Gibco 사 제조), 0.1 mM 2-메르캅토에탄올 (Sigma 사 제조), 100 units/㎖ 페니실린 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신을 포함하는 IMDM 배지 (Gibco 사 제조, mLIF 를 포함하지 않는다) 에 현탁하여, 5 × 103 cells/㎖ 의 마우스 간세포의 현탁액을 조제하였다.
산업상 이용가능성
본 발명의 배양체 형성용 용기의 제조 방법은, 종래의 배양체 형성용 용기와 비교하여, 균일화된 용기 표면을 가지고 있고, 배양체 형성 효율이 우수하고 또한 광학 관찰성이 우수한 용기를 제공할 수 있다.

Claims (11)

  1. 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성하기 위한 배양체 형성용 용기의 제조 방법으로서, 간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면을, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합한 알코올계 매질 용액을 사용하여, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 코팅하여, 건조시키는 공정 (A) 와,
    공정 (A) 에 의해 제작된 그 용기 내면 상의 코팅막에, 물/알코올계 매질 용액을 15 ㎎ ∼ 150 ㎎/㎠ 로 첨가하여 코팅막을 팽윤시키고, 건조시키는 공정 (B) 를 포함하는, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
    Figure 112020048443739-pct00009

    (식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
  2. 제 1 항에 있어서,
    에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 그 용기의 내면을 멸균하는 공정 (C) 를 추가로 포함하는, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 식 (2) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기 함유 단량체 (M) 과 다른 단량체의 공중합체의 적어도 1 종인, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
    Figure 112020048443739-pct00010

    (식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를, R4 는 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기를, R5 는 수소 원자 또는 메틸기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
  4. 제 3 항에 있어서,
    다른 단량체가, 알킬(메트)아크릴레이트 또는 글리시딜(메트)아크릴레이트를 포함하는, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과, 부틸메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트 및/또는 메타크릴산의 공중합체인, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트와의 공중합체인, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  7. 제 6 항에 있어서,
    2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린과 부틸메타크릴레이트의 공중합체의 몰비가 10 ∼ 90 : 90 ∼ 10 인, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물이, 2-메타크릴로일옥시에틸포스포릴콜린, 부틸메타크릴레이트 및 메타크릴산과의 공중합체인, 배양체 형성용 용기의 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 기재된 배양체 형성용 용기의 제조 방법으로 제조된 배양체 형성용 용기.
  10. 간세포를 부유 배양시켜 배양체를 형성하기 위한 배양체 형성용 용기를 사용한 배양체의 형성 방법으로서,
    간세포를 부유 배양하기 위한 영역을 형성하기 위한 용기 내면을, 식 (1) 로 나타내는 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물을 혼합한 알코올계 매질 용액을 사용하여, 포스포릴콜린 유사기를 측사슬에 갖는 화합물의 양이 0.1 ∼ 10 ㎎/㎠ 가 되도록 코팅하여, 건조시키는 공정 (A) 와, 공정 (A) 에 의해 제작된 그 용기 내면 상의 코팅막에, 물/알코올계 매질 용액을 15 ㎎ ∼ 150 ㎎/㎠ 로 첨가하여 코팅막을 팽윤시키고, 건조시키는 공정 (B) 에 의해 형성한 배양체 형성용 용기를 준비하는 공정 (D) 와,
    배성간세포를, 공정 (D) 의 배양체 형성용 용기 내에 있어서 부유 배양하는 공정 (E) 를 포함하는 배양체의 형성 방법.
    Figure 112020048443739-pct00011

    (식 중, R1, R2 및 R3 은 동일 혹은 상이한 기로서, 수소 원자, 탄소수 1 ∼ 6 의 알킬기 또는 하이드록시알킬기를 나타낸다. n 은 1 ∼ 4 의 정수이다.)
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 공정 (B) 후에, 에틸렌옥사이드 가스를 사용하여 상기 용기의 내면을 멸균하는 공정 (C) 를 추가로 포함하는, 배양체의 형성 방법.
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