ES2790628T3 - Aparatos, kits y métodos para la producción de construcciones biomiméticas - Google Patents

Abstract

Un método para producir una construcción biomimética que comprende: (i) introducir una solución de gel en un pozo que tiene una abertura, (ii) incubar la solución de gel para formar un gel, (iii) introducir un émbolo poroso en el pozo, (iv) comprimir el gel con el émbolo de manera que se expulsa líquido del gel al émbolo poroso, y (v) retirar el émbolo poroso para dejar dicha construcción biomimética en el pozo.

Description

DESCRIPCIÓN

Aparatos, kits y métodos para la producción de construcciones biomiméticas

Esta invención se refiere a aparatos, kits y métodos para producir construcciones biomiméticas.

Convencionalmente, la ingeniería de tejidos tiene como objetivo convertir una construcción inicial de armazón celular en una arquitectura similar a un tejido que tiene una función biomimética. Este proceso de conversión generalmente implica la remodelación en cultivo basada en células. Sin embargo, en la mayoría de los casos, la remodelación basada en células ha demostrado ser lenta (a menudo tarda semanas), difícil de controlar y costosa, con únicamente una capacidad limitada para organizar materiales bioartificiales o 'tejidos' (M. Eastwood et al., Cel. Motil Cytoskel 199840 13; D. Huang et al. Ann. Biomed. Ing. 199321289). Esto es atribuible en parte a las limitaciones de la perfusión/hipoxia que están relacionadas con la densidad de tejido (por ejemplo, en ligamentos, dermis y músculos). Se compone por una comprensión limitada de cómo las células realmente producen microestructuras nativas particulares (es decir, la organización de matriz celular 3D). La composición del material y, más particularmente, la estructura de escala nanomicro (meso) 3D de las construcciones de ingeniería bioartificiales son fundamentales para su éxito (R. A. Brown, en Future Strategies for Tissue and Organ Replacement (Eds: J. M. Polak, L. L. Hench, P. Kemp), World Scientific Publishing, Singapur (2002) 48; R. A. Brown et al. Wound Rep. Reg. (1997) 5212).

Se han utilizado geles de colágeno comprimido para producir implantes equivalentes de tejido. Sin embargo, los métodos de compresión conocidos no son reproducibles ni susceptibles de automatización. Los procesos y aparatos para la producción precisa y reproducible de geles de colágeno comprimido son esenciales para la producción de tejido artificial con fines terapéuticos y de modelado.

Esta invención se refiere al desarrollo de procesos y aparatos para la producción reproducible controlada de construcciones biomiméticas.

Estas construcciones biomiméticas pueden ser útiles como tejido artificial, por ejemplo, en métodos terapéuticos, así como en métodos de modelado y examen in vitro.

Un aspecto de la invención proporciona un método para producir una construcción biomimética que comprende: (i) introducir una solución de gel en un pozo,

(ii) incubar la solución de gel para formar un gel,

(iii) introducir un émbolo poroso en el pozo,

(iv) comprimir el gel con el émbolo poroso de modo que se expulse líquido del gel al émbolo poroso, y

(v) retirar el émbolo poroso para dejar dicha construcción biomimética en el pozo.

Un gel puede comprender uno o más polímeros formadores de gel. Los polímeros formadores de gel adecuados incluyen polímeros formadores de gel naturales, por ejemplo, proteínas tales como colágeno, laminina, seda, fibrina o elastina, glicoproteínas tales como fibronectina y polisacáridos tales como quitina o celulosa, y polímeros formadores de gel sintéticos, por ejemplo, polímeros orgánicos, tales como polilactona, poliglicona, policapriloctona y polipéptidos sintéticos, y polímeros inorgánicos como vidrio de fosfato.

En alguna realización, un gel puede comprender dos, tres o más polímeros formadores de gel. Por ejemplo, un gel puede comprender colágeno y uno o más polímeros formadores de gel sin colágeno como se expuso anteriormente. En realizaciones preferidas, el gel es un gel de colágeno. Un método para producir una construcción biomimética puede comprender:

(i) introducir una solución de colágeno en un pozo,

(ii) incubar la solución de colágeno para formar un gel de colágeno,

(iii) introducir un émbolo en el pozo,

(iv) comprimir el gel con el émbolo de manera que se expulse líquido del gel, y

(v) retirar el émbolo para dejar dicha construcción biomimética en el pozo.

El colágeno es un hidrogel que comprende fibrillas de colágeno en un líquido intersticial. Los geles de colágeno son generalmente isotrópicos y las fibras de colágeno se orientan aleatoriamente. En geles de colágeno se pueden preferir tipos de colágeno formadores de fibrillas nativas, incluidos los tipos de colágeno que son I, II, III, V, VI, IX y XI y combinaciones de estos (por ejemplo, I, III, V o II, IX, XI). Preferiblemente, se emplea colágeno de tipo I nativo. Un gel de colágeno puede comprender colágeno y uno o más polímeros formadores de gel sin colágeno incluyen polímeros naturales y sintéticos formadores de gel, como se ha descrito anteriormente.

El volumen inicial de la solución de gel (por ejemplo, una solución de colágeno o una solución de gel sin colágeno) utilizada para producir una capa de construcción de gel compactada dependerá de los métodos de producción y el diseño y uso previsto de la construcción comprimida. Por ejemplo, una solución de gel puede tener un volumen de 0,1 a 10 ml, por ejemplo 1, 2, 3, 4 o 5 ml. En algunas realizaciones preferidas, se pueden usar de 2 a 3,5 ml de solución de gel para producir una construcción comprimida de aproximadamente 100-150 um de espesor. La cantidad de solución de gel empleada depende de la altura y el área de la sección transversal del gel a producir. Por ejemplo, para producir un gel con una altura de 3 mm a 10 mm en un pozo de 6 mm de diámetro (28 mm2) se pueden emplear de 0,08 ml a 0,28 ml de solución de gel. Para producir un gel con una altura de 3 mm a 16 mm en un pozo de 110 mm x 75 mm, se pueden emplear de 24 ml a 132 ml de solución de gel.

En algunas realizaciones, la solución de colágeno o la solución de gel sin colágeno se pueden sembrar con células antes de permitir que se solidifique en un gel. La siembra puede ocurrir antes o después de la introducción al pozo. La siembra de la solución de gel se realiza preferiblemente en condiciones adecuadas de temperatura, pH, fuerza iónica y pura para mantener la viabilidad, antes de la formación de gel.

Las células adecuadas incluyen células eucariotas en particular células eucariotas superiores, tales como células vegetales y células animales.

En algunas realizaciones, las células pueden ser células de mamífero, por ejemplo, células que confieren funcionalidad de tejido y proporcionan estructuras que reemplazan o facilitan la reparación de tejido endógeno. Por ejemplo, el gel puede comprender una o más células musculares para proporcionar estructuras contráctiles, células vasculares y/o neuronales para proporcionar elementos conductores, células secretoras metabólicamente activas, tales como células hepáticas, células sintetizadoras de hormonas, células sebáceas, células de islotes pancreáticos o células de corteza suprarrenal para proporcionar estructuras secretoras, células madre, como células madre embrionarias o derivadas de médula ósea, fibroblastos dérmicos, queratinocitos de la piel (y capas combinadas de los dos), células de Schwann para implantes nerviosos, células de músculo liso y células endoteliales para estructuras de vasos, células uroteliales y de músculo liso para estructuras de vejiga/uretra y osteocitos, condrocitos y células de tendones para estructuras de huesos y tendones. En algunas realizaciones, las células sembradas en el gel pueden incluir fibroblastos tales como fibroblastos dérmicos de ratón o humanos, incluidos fibroblastos dérmicos neonatales y fibroblastos de vasos sanguíneos humanos.

Las células se pueden sembrar en la solución de gel, que puede ser una solución de colágeno o de gel sin colágeno, con una densidad de 1 x 103 o 1 x 104 a 1 x 106 células/ml, preferiblemente aproximadamente 1 x 105 células/ml.

Las células se pueden distribuir dentro del gel en cualquier disposición. Por ejemplo, las células pueden distribuirse homogéneamente en todo el gel o distribuirse en zonas, regiones o capas definidas dentro del gel.

La solución de gel se puede introducir en el pozo mediante técnicas estándar de manejo de líquidos.

La solución de gel, que puede ser una solución de colágeno o una solución de gel sin colágeno y opcionalmente puede contener células, puede entonces solidificarse en un gel. Por ejemplo, la solidificación de soluciones de gel, tales como soluciones de colágeno, en geles es bien conocida en la técnica y típicamente implica calentar, por ejemplo, de 36 °C a 38 °C. Por ejemplo, la solución de colágeno puede inducirse para polimerizarse (agregar) en un gel por incubación a aproximadamente 37° a pH neutro.

La densidad media de un gel sembrado (por ejemplo, la densidad media de colágeno de un gel de colágeno sembrado) antes de la compresión puede ser de 0,5 a 5 mg/ml, preferiblemente de 1,5 a 4 mg/ml.

El émbolo es poroso. El émbolo poroso absorbe el líquido expulsado del gel durante la compresión. Por ejemplo, el émbolo puede comprender un material sinterizado o no sinterizado, como plástico, celulosa, por ejemplo, acetato de celulosa, yeso, malla de fibra, metales o cerámica. El émbolo se adapta preferiblemente para sellar la abertura del pozo cuando se introduce, de modo que el líquido entre al émbolo y no sea expulsado del pozo por compresión.

En algunas realizaciones, el gel de colágeno o no colágeno puede tener una única FLS, que es la superficie que contacta con el émbolo poroso, es decir, toda la expulsión líquida del gel se dirige a través de la superficie de gel que contacta en el émbolo poroso con la FLS.

Después del endurecimiento, el gel en el pozo se somete a compresión plástica utilizando el émbolo.

La compresión plástica del gel hace que se deforme y reduzca su volumen, de modo que el gel retiene o retiene sustancialmente su nuevo volumen, incluso después de eliminar la compresión. La compresión plástica se describe con más detalle en el documento WO2006/03442, Brown RA et al. (2005) Adv. Funct. Estera. 15: 176-177 y en otros lugares.

La superficie del gel a través de la que se expulsa el líquido cuando se aplica compresión al gel generalmente se denomina superficie de salida de fluido (FLS, del inglés fluid leaving surface). El grado de compresión puede medirse por la cantidad de líquido expulsado a través del FLS por compresión plástica por unidad de área de superficie del FLS, es decir, Vexpulsadomm3/AFLSmm2. Esta es una reducción de altura que puede expresarse en mm. Un volumen adecuado de líquido expulsado a través de la FLS por compresión plástica por unidad de área de superficie FLS puede ser de 2 a 16,5 mm, por ejemplo 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o 16 mm, y preferiblemente de 2 a 14 mm, de 2,5 a 13 mm o de 5 a 10 mm.

La compresión plástica puede reducir el volumen del gel en un 80 % a 99,5 %. Por ejemplo, el gel comprimido puede tener 1,2, 3, 4 o 5 % de su volumen original. En algunas realizaciones preferidas, se puede expulsar al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % p/p del líquido en el gel.

En algunas realizaciones, la superficie de la construcción de gel comprimido (por ejemplo, construcción sin colágeno o de colágeno comprimido) puede sembrarse con células, después de la compresión.

Después de la compresión y la siembra opcional, una construcción de gel que contiene células puede incubarse en medio de cultivo en el pozo. Las condiciones adecuadas son bien conocidas en la técnica. La duración y las condiciones de incubación dependerán de la aplicación prevista. Típicamente, donde se ha sembrado la superficie de una construcción, la construcción se puede incubar hasta que se forme una capa confluente en la superficie, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 o más días.

En algunas realizaciones, los métodos pueden repetirse para producir una construcción multicapa. Por ejemplo, un método puede comprender, además:

(vi) introducir una solución de gel adicional sobre la capa de gel comprimido en el pozo,

(vii) incubar la solución de gel adicional para formar un gel adicional,

(viii) introducir un émbolo poroso en el pozo

(ix) comprimir el gel adicional con el émbolo de manera que se expulsa líquido del gel al émbolo,

(x) retirar el émbolo para dejar una construcción que comprende múltiples capas de gel comprimido en el pozo.

Preferiblemente el gel es colágeno. Un método puede comprender, además:

(vi) introducir una solución adicional de colágeno sobre la capa de colágeno comprimido en el pozo,

(vii) incubar la solución de colágeno adicional para formar un gel de colágeno adicional,

(viii) introducir un émbolo poroso en el pozo

(ix) comprimir el gel de colágeno adicional con el émbolo de manera que se expulsa líquido del gel de colágeno al émbolo,

(x) retirar el émbolo para dejar una construcción de colágeno que comprende múltiples capas de colágeno comprimido en el pozo.

La solución de gel adicional, por ejemplo, la solución de colágeno adicional se puede sembrar con células, que pueden ser las mismas o diferentes células a la solución de gel original.

En algunas realizaciones, el émbolo poroso puede ser el mismo émbolo que se usó en la primera etapa de compresión. En otras realizaciones, se puede usar un émbolo poroso diferente para cada etapa de compresión.

Las etapas (vi) a (x) pueden repetirse una o más veces para producir una construcción biomimética que comprende múltiples capas de gel comprimido, por ejemplo, múltiples capas de colágeno comprimido.

Se puede producir cualquier combinación de capas acelulares y sembradas de células, por ejemplo, capas de colágeno acelulares y sembradas de células, según los requisitos. Se pueden sembrar diferentes tipos de células en diferentes capas. Por ejemplo, dos o más de las múltiples capas de gel comprimido se pueden sembrar con los mismos o diferentes tipos de células.

Ciclos repetidos de introducción y compactación de gel permiten la producción de tejidos biomiméticos de múltiples capas.

En algunas realizaciones, el émbolo puede comprender uno o más salientes que realzan rebajes, bolsillos o criptas en la superficie del gel comprimido. Los salientes adecuados pueden ubicarse en la superficie del émbolo que contacta con el gel, es decir, la superficie inferior. Estas microestructuras gofradas pueden ser útiles como nichos para soportar tipos de células específicos, como las células madre. Los salientes pueden ser integrales al émbolo y pueden producirse del mismo material que el émbolo o un material diferente, que puede ser permeable o impermeable, dependiendo de la aplicación. Alternativamente, se puede insertar un sello separado que comprende uno o más salientes entre el émbolo y el gel para gofrar rebajes o criptas. El sello separado puede ser permeable o impermeable, dependiendo de la aplicación.

En algunas realizaciones, el émbolo o el sello separado pueden comprender uno o más salientes que gofran ranuras en la superficie del gel comprimido.

La una o más ranuras pueden ser de cualquier anchura, profundidad o longitud adecuados para una aplicación deseada. Preferiblemente, las ranuras se extienden desde un borde del gel comprimido y más preferiblemente se extienden entre 2 o más bordes del gel comprimido. En otras realizaciones, las ranuras pueden no extenderse a ningún borde del gel comprimido.

Las ranuras pueden tener al menos 1, al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 pm de anchura y hasta 500, hasta 400, hasta 300, hasta 200 o hasta 100 pm de anchura. Los intervalos de anchuras adecuadas para ranuras como se describe en la presente memoria pueden tener cualquiera de estos valores mínimos en combinación con cualquiera de estos valores máximos. Por ejemplo, las ranuras adecuadas pueden tener de 1 a 500 pm, preferiblemente de 1 a 300 pm de anchura.

Las ranuras pueden tener al menos 1, al menos 5, o al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40 o al menos 50 pm de profundidad y hasta 500, hasta 400, hasta 300, hasta 200 o hasta 100 pm de profundidad. Los intervalos de profundidades adecuadas para ranuras como se describe en la presente memoria pueden tener cualquiera de estos valores mínimos en combinación con cualquiera de estos valores máximos. Por ejemplo, las ranuras adecuadas pueden tener de 1 a 500 pm, preferiblemente de 1 a 300 pm de profundidad.

Las ranuras pueden tener hasta 110 mm, hasta 80 mm, hasta 75 mm, hasta 50 mm, hasta 30 mm, hasta 20 mm, hasta 10 mm o hasta 6 mm de largo, por ejemplo, hasta 22 mm de largo. En algunas realizaciones preferidas, las ranuras pueden extenderse a través del gel comprimido desde un borde a otro, y por lo tanto pueden tener una longitud que corresponde a la anchura, la longitud o el diámetro del gel comprimido. En otras realizaciones, las ranuras pueden no extenderse a un borde del gel comprimido o pueden extenderse a un solo borde del gel comprimido.

Las ranuras pueden tener al menos 10, al menos 20 o al menos 50 pm de longitud. Los intervalos de longitud adecuada para ranuras como se describe en este documento pueden tener cualquiera de estos valores mínimos en combinación con cualquiera de estos valores máximos. Por ejemplo, ranuras adecuadas pueden ser de 10 pm a 110 mm de largo.

Diferentes ranuras en la superficie del gel comprimido pueden tener las mismas o diferentes dimensiones.

La profundidad y/o la anchura de una ranura pueden variar a lo largo de su longitud. Esto puede ser útil para producir conductos cerrados cuya área en sección transversal transversa (es decir, la anchura y/o la altura del conducto) varía, por ejemplo, aumenta o disminuye a lo largo de su longitud. Por ejemplo, el conducto puede ser más estrecho y/o menos profundo en partes de la construcción multicapa y más anchura y/o más profundo en otras partes de la construcción multicapa.

Las dimensiones y la disposición de las ranuras se determinan por las dimensiones y la disposición de los salientes en el émbolo o sello. Por ejemplo, la profundidad de la ranura puede ser del 25 % al 100 % de la profundidad de saliente y la anchura de la ranura puede ser del 75 % al 100 % de la anchura de saliente, preferiblemente el 100 %.

En algunas realizaciones, una ranura en la superficie del gel comprimido puede dividirse o partirse en múltiples ranuras separadas. Múltiples ranuras separadas en la superficie del gel comprimido pueden fusionarse o unirse en una sola ranura.

Las una o más ranuras gofradas pueden cubrirse con una capa adicional de gel comprimido, por ejemplo, una capa adicional de colágeno comprimido, para producir uno o más conductos cerrados (es decir, canales cubiertos o microcanales). Por ejemplo, se puede introducir una solución de gel adicional, por ejemplo, una solución de colágeno adicional, en la superficie de la capa de gel comprimido con una o más ranuras gofradas. La solución de gel adicional en la superficie puede incubarse para formar un gel adicional y luego comprimirse, por ejemplo, usando un émbolo poroso como se ha descrito anteriormente, para expulsar el líquido del gel adicional al émbolo. El gel comprimido adicional cubre la una o más ranuras gofradas para producir una construcción de múltiples capas que contiene uno o más conductos o microcanales cerrados (o cubiertos). Los conductos o microcanales cerrados (o cubiertos) pueden comprender al menos una abertura en una superficie de la construcción de múltiples capas.

Se pueden añadir capas adicionales de colágeno comprimido o capas adicionales de gel comprimido sin colágeno al gel adicional comprimido como se describe anteriormente para producir una construcción de gel comprimido de múltiples capas. Una, dos, tres, cuatro o más de las capas de gel comprimido en la construcción pueden contener ranuras gofradas.

Por ejemplo, una construcción biomimética producida como se describe en el presente documento puede comprender canales cubiertos en el 10 % o más, 25 % o más, 50 % o más, 75 % o más o 100 % de las capas de gel sin colágeno o de colágeno comprimido en la construcción.

En algunas realizaciones, la construcción biomimética de múltiples capas puede comprender una, dos, tres o cuatro o más capas que carecen de canales cubiertos.

Las dimensiones, el número, la geometría y la disposición de los canales cubiertos pueden controlarse al alterar las dimensiones, el número, la geometría y la disposición de los salientes en el émbolo o sello según las propiedades deseadas de la construcción biomimética.

En algunas realizaciones, el émbolo o sello separado puede comprender uno o más salientes alargados que gofran canales que unen canales cubiertos en diferentes capas de una construcción biomimética de múltiples capas.

La provisión de canales cubiertos puede ser útil para proporcionar construcciones biomiméticas que contienen microcanales de dimensiones controlables, geometría y dirección. Los microcanales pueden mejorar las propiedades de la construcción biomimética, por ejemplo, al aumentar la oxigenación dentro de la construcción biomimética y/o promover el crecimiento entrante de vasos sanguíneos y elementos nerviosos después de la implantación.

Los métodos de la presente invención son particularmente adecuados para la producción de construcciones biomiméticas en una distribución de pozos simultáneamente. Esto puede ser útil, por ejemplo, en examen.

A continuación, se describen kits y aparatos adecuados para producir distribuciones de pozos que contienen construcciones biomiméticas.

En algunas realizaciones, el fondo del pozo puede ser permeable. Por ejemplo, líquidos como el medio de cultivo pueden pasar al pozo a través del fondo permeable. Convenientemente, el fondo del pozo puede estar definido por una membrana. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando las células en la superficie de la construcción necesitan exponerse al aire para inducir un fenotipo biomimético.

El pozo se puede montar sobre un soporte impermeable, de modo que dicho fondo de pozo permeable no entre en contacto con el soporte. El pozo puede acomodarse en un bolsillo o en el rebaje del soporte. Esto permite que el medio de cultivo en el bolsillo o el rebaje del soporte contacte con la construcción, mientras deja la superficie superior de la construcción expuesta al aire.

Preferiblemente, el pozo se monta de manera resiliente sobre la montura, de modo que el fondo permeable del pozo se puede impulsar contra el soporte impermeable antes de la compresión para evitar la expulsión del líquido desde el gel a través del fondo de pozo permeable.

Por ejemplo, el pozo puede sostenerse en una placa de montaje que se monta de manera resiliente en el soporte. La placa de montaje puede sostener una distribución de pozos, que pueden ser múltiples pozos separados o múltiples pozos unidos, por ejemplo, en una placa de múltiples pozos. La distribución de pozos sostenidos en la placa de montaje puede acomodarse mediante una distribución correspondiente de bolsillos o rebajes en el soporte.

Después de la compresión de un gel, se puede quitar el émbolo para dejar el gel comprimido en el pozo. En algunas realizaciones, el émbolo puede rotarse y/o inclinarse para ayudar a la separación de la superficie del gel comprimido. En algunas realizaciones, en el gel comprimido se pueden introducir gradientes de densidad. Por ejemplo, un método para producir una construcción biomimética como se describe en el presente documento puede comprender:

(i) introducir una solución de colágeno o una solución de gel sin colágeno en un pozo,

(ii) incubar la solución de colágeno o de gel sin colágeno para formar un gel, en donde el gel tiene una altura o una profundidad que es mayor en una primera región que en una segunda región,

(iii) introducir un émbolo en el pozo,

(iv) comprimir el gel con el émbolo de manera que se expulsa líquido del gel y se reduce o elimina la diferencia de altura o profundidad del gel en las regiones primera y segunda, y

(v) retirar el émbolo para dejar dicha construcción biomimética en el pozo,

en donde la construcción biomimética tiene mayor rigidez o densidad en la primera región con respecto a la segunda región.

Métodos adecuados para la introducción de gradientes de densidad se describen en el documento WO2009/004351. Otro aspecto de la invención proporciona un kit para producir una construcción biomimética que comprende: un émbolo y un pozo que tiene una abertura,

en donde el émbolo comprende un material poroso y es acomodable en el pozo.

El émbolo y el pozo se adaptan de modo que la abertura del pozo se sella o se sella parcialmente cuando se introduce el émbolo. En algunas realizaciones, el émbolo no expulsa líquido del pozo a través de la compresión de un gel sin colágeno o de colágeno en el pozo. El cuerpo poroso del émbolo permite que el líquido expulsado del gel de colágeno o sin colágeno entre al émbolo. El cuerpo poroso puede ser rígido o no rígido, por ejemplo, puede mostrar cierta flexibilidad o resiliencia. El cuerpo poroso se hace de un material sinterizado o no sinterizado, como un material plástico, celulosa, yeso, metal, fibra densa o cerámica.

El émbolo puede comprender además un soporte impermeable que sostiene el material poroso.

El émbolo puede comprender un conector, tal como una etiqueta o clavija, que se une al cuerpo poroso y que permite una conexión liberable a una cabeza de émbolo. El conector se produce preferiblemente de un material impermeable tal como material plástico, tal como poliestireno, policarbonato o polipropileno, o metal para evitar que líquido en la parte porosa del émbolo entre en el portador de émbolo.

El émbolo se puede adaptar para comprimir un gel contenido en el pozo y para absorber el líquido expulsado del gel por la compresión.

La superficie del émbolo que contacta con el gel en el pozo durante la compresión puede comprender uno o más salientes que gofran uno o más rebajes, bolsillos o ranuras en la superficie de un gel de colágeno o sin colágeno en el pozo. Alternativamente, un kit puede comprender además un sello separado que comprende uno o más salientes u otra microestructura en su superficie. El sello puede insertarse entre el émbolo y el gel, de modo que la superficie de gel es gofrada por el sello con uno o más de uno o más rebajes, criptas, bolsillos o ranuras durante la compresión por el émbolo.

Los salientes pueden ubicarse en la superficie inferior del émbolo o sello, es decir, la superficie que mira hacia el fondo del pozo cuando el émbolo se introduce en el pozo, y puede ser absorbente o no absorbente.

En algunas realizaciones, el émbolo puede comprender uno o más pasajes que se extienden desde un agujero en la superficie superior del émbolo hacia la superficie inferior del émbolo. Los pasajes pueden extenderse total o parcialmente hacia la superficie inferior. Por ejemplo, los pasajes pueden extenderse el 70 %, 80 %, 90 % o 100 % de la distancia a la superficie inferior del émbolo. En algunas realizaciones, los pasajes pueden extenderse a un agujero en la superficie inferior del émbolo. Aire u otros gases o líquidos pueden acceder a la interfaz entre el émbolo y la superficie del gel comprimido (es decir, la superficie de salida de fluido) a través de uno o más pasajes cuando el líquido ha sido expulsado del gel. Al final de uno o más pasajes, el fluido puede salir directamente sobre el gel a través de un agujero en la superficie inferior del émbolo o el fluido puede entrar en la parte inferior del émbolo adyacente al extremo de los pasajes y moverse a través del émbolo para salir por su superficie inferior.

Aire u otros fluidos pueden ser forzados a través de uno o más pasajes para facilitar la separación del émbolo y el gel comprimido. Un kit puede comprender un impulsor, como un pistón, que impulsa o fuerza los fluidos a través de uno o más pasajes. El motor puede estar separado o ser integral con el émbolo. En algunas realizaciones, aire y/o líquido que se absorbe del gel se puede impulsar a través de los pasajes y suministrarse a la superficie del gel comprimido. Por ejemplo, después de la absorción de líquido por el émbolo, puede forzarse aire a través de uno o más pasajes. Este aire puede suministrarse directamente a la superficie del gel comprimido a través de un agujero en la superficie inferior del émbolo; o el aire puede impulsar líquido absorbido en el fondo del émbolo de regreso sobre la superficie del gel comprimido; o puede suministrarse una combinación de líquido absorbido seguido de aire a la superficie del gel comprimido.

El émbolo puede comprender una o más características que facilitan la separación del gel comprimido.

Por ejemplo, el émbolo puede comprender una o más ranuras a lo largo de su exterior que se extienden desde la superficie superior a la inferior del émbolo, de modo que, al introducirse en el pozo, las ranuras y el pozo definen pasajes que se extienden desde la parte superior del émbolo a la superficie del gel comprimido. Estos pasajes permiten que acceda aire a la interfaz émbolo/gel y facilitan la separación.

El émbolo puede comprender una capa externa permeable de papel o malla sintética en su superficie inferior. Esta capa se puede unir de manera suelta o parcial al émbolo y puede facilitar la entrada de aire a la interfaz émbolo/gel.

El émbolo puede retirarse del pozo retirando o retirando parcialmente el émbolo de la capa externa y luego retirando la capa externa de la superficie del gel comprimido. La capa externa se puede retirar convenientemente separando inicialmente la capa externa del gel en un borde o esquina del gel comprimido, seguido de la retirada del resto del gel (por ejemplo, despegándolo del borde o esquina).

Un kit puede comprender múltiples émbolos. Por ejemplo, se puede proporcionar una distribución de émbolos en una bandeja. La bandeja puede ser desechable y puede presentar los émbolos con conectores en la parte superior para facilitar la carga. La distribución de émbolos puede cargarse rápida y convenientemente desde la bandeja a una distribución correspondiente de portadores de émbolo en un aparato de compresión de gel de colágeno o sin colágeno para producir construcciones biomiméticas. Un aparato adecuado se describe a continuación.

Un pozo puede ser cualquier recipiente, bolsillo o rebaje que pueda acomodar un émbolo. El pozo se puede hacer de cualquier material adecuado, por ejemplo, poliestireno, policarbonato, vidrio, polipropileno, metales o cerámica.

En algunas realizaciones, el pozo o los pozos pueden ser impermeables. En otras realizaciones, el pozo o los pozos pueden ser permeables. Por ejemplo, el pozo o los pozos pueden tener un fondo permeable, como una membrana. Los pozos permeables pueden tener aplicaciones particulares, por ejemplo, en células de transporte aéreo que se cultivan en los pozos.

En algunas realizaciones, múltiples pozos pueden estar vinculados entre sí. Por ejemplo, un kit puede comprender una distribución de pozos vinculados. En algunas realizaciones, el kit puede incluir una placa de múltiples pozos. El kit puede comprender un émbolo para cada pozo en la distribución. Como se ha descrito anteriormente, en una bandeja se puede proporcionar una distribución de émbolos de manera que cada émbolo en la distribución corresponda a un pozo en la distribución de pozos.

Un kit puede comprender además una placa de guía. Esto puede ser útil en realizaciones en las que los pozos son integrales con el soporte (por ejemplo, en una placa de múltiples pozos). La placa de guía se coloca sobre el soporte durante la compresión y contiene agujeros que corresponden a los pozos en el soporte. Por ejemplo, la placa de guía puede contener una distribución de agujeros que corresponden a una distribución de pozos en el soporte. Los agujeros en la placa de guía se estrechan hacia dentro de arriba abajo, es decir, el diámetro interno de los agujeros en la superficie superior es mayor que el diámetro interno en la superficie inferior, y el diámetro disminuye progresivamente desde la superficie superior a la inferior. En la superficie inferior de la placa de guía, los agujeros tienen preferiblemente el mismo diámetro interno o reducido en relación con los pozos en el soporte. Durante la compresión, los émbolos entran en los agujeros de la placa de guía en la superficie superior, donde el diámetro del agujero es mayor. A medida que los émbolos se mueven a través de los agujeros, el diámetro progresivamente decreciente del agujero guía los émbolos hacia los pozos que están debajo de cada agujero.

En otras realizaciones, el kit puede comprender múltiples pozos individuales. Preferiblemente, los pozos individuales se estrechan de modo que el diámetro interno en la abertura del pozo sea mayor que el diámetro interno en el fondo del pozo. Esto puede guiar los émbolos al fondo del pozo y evitar la necesidad de una placa de guía separada. Un pozo puede comprender un reborde en su abertura que permite que el pozo descanse sobre una placa de montaje y evite que caiga a través de la placa de montaje.

El kit puede comprender además un cartucho o placa de montaje que se adapta para sostener múltiples pozos, por ejemplo, una distribución de pozos, que pueden estar vinculados o separados. La placa de montaje puede comprender agujeros, cada uno de los cuales puede acomodar un pozo.

Preferiblemente, la placa de montaje se adapta para montarse de manera resiliente sobre un soporte impermeable, por ejemplo, usando miembros deformables de manera resiliente. La placa de montaje se puede adaptar de modo que, cuando se coloca sobre un soporte, se puede presionar contra el soporte para impulsar el fondo de un pozo sostenido en la placa de montaje contra el soporte.

Un kit puede comprender además un soporte impermeable que se adapta para soportar la placa de montaje, de modo que pozos, en particular los pozos permeables, sostenidos en la placa de montaje no entren en contacto con el soporte. El soporte impermeable puede comprender bolsillos o rebajes que acomodan pozos sostenidos en la placa de montaje. Por ejemplo, el soporte puede ser convenientemente una placa de múltiples pozos.

Un kit puede comprender además una tapa para cubrir pozos que son acomodados en la placa de montaje o integrales al soporte.

Un kit puede comprender además reactivos útiles en la producción de construcciones biomiméticas como se describe en el presente documento. Los reactivos pueden incluir colágeno, polímeros formadores de gel sin colágeno, tampones, mezclas de nutrientes y medios de cultivo.

Émbolos, pozos y otros componentes de un kit pueden suministrarse en condiciones estériles en un embalaje adecuado según la práctica estándar de laboratorio.

La descripción proporciona kits para producir una construcción biomimética como se describe en este documento que comprende 2, 3, 4, 5 o más componentes seleccionados del grupo que consiste en: émbolos, opcionalmente presentados en una bandeja desechable, pozos, placas de montaje, opcionalmente con tapas, placas de guía, soportes impermeables, opcionalmente con tapas y reactivos. Componentes adecuados se describen anteriormente. Se puede adaptar un kit para su uso en métodos de producción de construcciones biomiméticas como se describe anteriormente y se puede usar en el aparato de compresión en gel descrito a continuación.

Otro aspecto de la invención proporciona un aparato de compresión en gel para producir una construcción biomimética que comprende:

una montura para un pozo para contener un gel,

un pocilio posicionado en la montura,

un portador de émbolo para enganchar un émbolo, y

un émbolo conectado con el portador de émbolo

el portador de émbolo y la montura son movibles uno con respecto al otro, de modo que un émbolo enganchado por el portador es impulsado adentro del pozo en la montura, en donde el émbolo comprende un material poroso.

El aparato puede ser útil para comprimir geles de colágeno o sin colágeno.

Un émbolo que puede engancharse con el portador de émbolo puede comprender un cuerpo poroso y un soporte impermeable. El cuerpo poroso puede ser rígido o no rígido y puede ser capaz de absorber líquido expulsado durante la compresión de un gel, como se ha descrito anteriormente. El soporte impermeable puede comprender un conector, tal como una etiqueta o una clavija, que se une al cuerpo poroso y que se puede unir de forma liberable al portador de émbolo. El conector se produce preferiblemente de un material impermeable tal como material plástico, tal como poliestireno, policarbonato o polipropileno, o metal para evitar que el líquido en la parte porosa del émbolo entre al portador de émbolo.

Un pozo adecuado puede ser cualquier recipiente abierto que acomode un émbolo de manera que la abertura del pozo se sella cuando se introduce el émbolo.

Émbolos y pozos se describen con más detalle anteriormente.

El portador de émbolo se puede adaptar para sostener de forma liberable un émbolo. Por ejemplo, el portador de émbolo puede comprender un agujero que acomode el conector de un émbolo y de tal manera que el émbolo sea sostenido por fricción en el portador.

El portador de émbolo puede comprender además una liberación para separar el émbolo. Por ejemplo, el portador de émbolo puede comprender además una sonda que es movible a través del agujero y desaloja el conector del agujero y libera el émbolo del portador.

El portador de émbolo puede ser movible hacia y lejos de la montura, de modo que un émbolo enganchado por el portador es movible adentro y afuera de un pozo colocado en la montura. En otras palabras, el portador de émbolo es movible entre una primera posición en la que un émbolo enganchado por el portador se acomoda en un pozo en la montura y una segunda posición en la que el émbolo no se acomoda en el pozo.

En algunas realizaciones, el portador de émbolo puede ser movible, p. ej. rotatorio o pivotable, entre una posición de compresión para enganchar un émbolo sostenido en el mismo con el pozo en la montura y una posición de carga para cargar y/o descargar émbolos sostenidos de forma liberable por el portador de émbolo.

El portador de émbolo se puede adaptar para enganchar una distribución de émbolos o más preferiblemente, el aparato puede comprender una distribución de portadores de émbolo, cada portador de émbolo enganchando uno de una distribución de émbolos.

El portador de émbolo puede aplicar suficiente fuerza al émbolo para comprimir un gel de colágeno o sin colágeno en un pozo en la montura. Por ejemplo, el portador de émbolo puede tener masa suficiente para aplicar una fuerza gravitacional que comprime el gel. Por ejemplo, para comprimir un gel sin colágeno o de colágeno en un pozo de 10 mm a 22 mm de diámetro, el portador de émbolo puede tener una masa de 5 a 100 g.

En algunas realizaciones, el aparato puede comprender un impulsor que aplica fuerza al portador de émbolo para impulsar el émbolo adentro de un pozo en la montura. Se puede emplear una variedad de impulsores diferentes. Por ejemplo, el impulsor puede comprender uno o más de: uno o más pesos que se pueden conectar al portador de émbolo; un miembro resiliente, tal como un resorte o una banda elástica que se engancha o se puede enganchar con el portador de émbolo; un motor, por ejemplo, un motor eléctrico; un sistema hidráulico para aplicar presión fluídica al émbolo.

La fuerza que aplica el impulsor al portador de émbolo puede ser ajustable. Por ejemplo, la fuerza aplicada al portador de émbolo por la prensa puede ajustarse alterando el número de pesos enganchados con el portador de émbolo o ajustando la tensión del miembro resiliente.

El portador de émbolo se puede asociar con una guía que facilita el enganche de un émbolo sostenido en el portador con un pozo acomodado en la montura o integral al soporte.

El portador de émbolo puede estar contenido en una cabeza de émbolo que se adapta para sostener de manera liberable una distribución de émbolos.

Los portadores de émbolo se pueden disponer en la cabeza de émbolo de manera que cada émbolo enganchado en un portador en la cabeza de émbolo pueda acomodarse en un pozo que está colocado en la montura. Por ejemplo, la montura se puede adaptar para acomodar una distribución de pozos que corresponde a la distribución de émbolos sostenidos de manera liberable por los portadores de émbolo en la cabeza de émbolo.

Se puede sostener una distribución de émbolos en una bandeja o placa antes de la unión liberable a las cabezas de émbolo. El aparato puede comprender una estación de carga adecuada para acomodar una bandeja o placa de émbolos. La estación de carga también puede ser adecuada para acomodar una bandeja de desechos para la recogida de émbolos húmedos después del uso.

La cabeza de émbolo puede ser movible, p. ej. rotatoria o pivotable, entre una posición de compresión para impulsar un émbolo enganchado dentro de un pozo en la montura, una posición de descarga para descargar émbolos usados desde los portadores de émbolo en la cabeza de émbolo y, opcionalmente, una posición de carga para cargar émbolos en los portadores de émbolo en la cabeza de émbolo Por ejemplo, la cabeza de émbolo puede ser movible a una posición de carga para unir de manera liberable una distribución de émbolos en la estación de carga a los portadores de émbolo en la cabeza. La cabeza de émbolo puede entonces ser movible a una posición de compresión en la que los émbolos unidos pueden engancharse con los pozos colocados en la montura. La cabeza de émbolo puede entonces ser movible de regreso a una posición de descarga para liberar los émbolos usados, que ahora contienen líquido expulsado del gel y pueden descartarse. Opcionalmente, se puede cargar un nuevo conjunto de émbolos.

En algunas realizaciones, la cabeza de émbolo se puede montar en un poste y puede pivotar alrededor del poste entre las posiciones de carga y compresión.

La cabeza de émbolo puede comprender guías externas, por ejemplo, patas resilientes, que se adaptan para impulsar la placa de montaje contra el soporte, cuando se están utilizando estos componentes. Las guías externas también pueden ser útiles en la actualidad para permitir que la cabeza de émbolo sea colocada con precisión sobre la montura antes de la compresión.

La montura se puede adaptar para acomodar una distribución de pozos, cada uno acomodando una de las distribuciones de émbolos.

La montura puede comprender un bloque que contiene uno o más rebajes en los que se pueden insertar pozos o soportes como se describe anteriormente. El bloque puede ser plano o puede comprender una distribución de rebajes adecuados para acomodar una distribución de pozos. Convenientemente, el bloque puede acomodar una placa de múltiples pozos, por ejemplo, una placa de 12 o 24 pozos. Una placa de múltiples pozos montada en el bloque puede usarse por sí misma como soporte para acomodar pozos, por ejemplo, pozos individuales en una placa de montaje como se ha descrito anteriormente. Esto puede ser útil, por ejemplo, cuando los pozos son permeables. Alternativamente, los pozos de una placa de múltiples pozos montados en el bloque pueden usarse directamente para contener construcciones de colágeno o sin colágeno como se describe en el presente documento.

La montura puede comprender además uno o más elementos de calentamiento. Esto permite la incubación de los pozos en la montura a una temperatura definida por el usuario, típicamente alrededor de 37 °C. Esto puede ser útil para establecer el gel de colágeno o sin colágeno antes de la compresión y para realizar las siguientes etapas de cultivo celular en los pozos, si es necesario. Esto permite que las construcciones permanezcan in situ en los pozos en la montura hasta que se completen todas las etapas requeridas en la producción.

La estación de compresión del aparato puede comprender además una tapa para cubrir la montura y los pozos acomodados en ella. La tapa puede ser de cualquier material rígido e impermeable, y preferiblemente es transparente. La tapa puede ser útil para mantener condiciones de incubación adecuadas en la montura.

El aparato también puede comprender un temporizador. Esto puede ser útil para temporizar la duración de la compresión aplicada al gel de colágeno o sin colágeno en el pozo, o la duración de las etapas de incubación y cultivo.

El aparato puede comprender una o más pantallas para indicar la duración y la cantidad de fuerza aplicada al portador de émbolo, la temperatura de la montura y la duración de la incubación y/o el cultivo.

El aparato puede comprender una o más alarmas, por ejemplo, alarmas visuales o audibles, que indican cuándo ha transcurrido el período de incubación para endurecer el gel de colágeno o sin colágeno o el período de compresión para comprimir el gel.

Un aparato como el descrito anteriormente puede comprender un émbolo que se engancha con el portador de émbolo y un pozo posicionado en la montura. En algunas realizaciones, el aparato puede comprender una distribución de émbolos y una distribución de pozos. El aparato también puede comprender un soporte, una placa de montaje y otros consumibles descritos anteriormente.

Los émbolos y pozos adecuados se describen anteriormente y el aparato puede comprender un kit como se describe anteriormente.

En algunas realizaciones preferidas, un aparato puede comprender una única estación en la que la montura permanece estacionaria mientras se produce una construcción biomimética en un pozo colocado en la montura.

Alternativamente, el aparato puede comprender múltiples estaciones y la montura que contiene el pozo en el que se produce la construcción biomimética puede ser movible entre las estaciones. Cada estación puede realizar una operación diferente en el gel de colágeno o sin colágeno en el pozo. Estos procesos de línea de producción pueden preferirse para aplicaciones altamente automatizadas o de producción en masa. Los dispositivos automatizados para la manipulación de reactivos en placas de múltiples pozos son bien conocidos en la técnica.

La montura puede ser movible entre una primera estación en el aparato, una segunda estación y opcionalmente una tercera, cuarta, quinta o más estaciones. Por ejemplo, la montura puede moverse entre una estación dispensadora para agregar reactivos, tales como solución de colágeno, solución de polímero formador de gel sin colágeno, suspensiones celulares y medios de cultivo a un pozo contenido en la montura; una estación de incubación para incubar el gel de colágeno o sin colágeno en el pozo a una temperatura fija, por ejemplo, para endurecer la solución de polímero formador de gel de colágeno o sin colágeno y/o cultivar células; y/o una estación de compresión para comprimir el gel de colágeno o sin colágeno en el pozo.

La montura puede ser movible de forma lineal entre estaciones o puede experimentar ciclos repetidos alrededor del mismo conjunto de estaciones, por ejemplo, la montura puede ser movible entre estaciones posicionadas a lo largo de un sistema de alineamiento rotatorio. La montura se puede mover entre diferentes estaciones de forma robótica. El diseño y el control de sistemas de estaciones múltiples son bien conocidos en la técnica.

El aparato puede ser útil en un método para producir una construcción biomimética como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el aparato puede usarse con un kit como se describe anteriormente en los métodos descritos.

Se puede usar un aparato en un método para producir una construcción biomimética como se ha descrito anteriormente.

La divulgación proporciona el uso de un kit y/o un aparato como se describe anteriormente en un método para producir una construcción biomimética. Métodos adecuados también se describen anteriormente.

La divulgación también proporciona métodos para producir construcciones biomiméticas que contienen microcanales cubiertos.

Un método para producir una construcción biomimética que comprende un canal cubierto puede comprender:

(i) proporcionar un gel comprimido con una o más ranuras en la superficie del mismo,

(ii) introducir una solución de polímero formador de gel adicional sobre la superficie del gel comprimido, (iii) endurecer la solución de polímero formador de gel adicional para formar un gel de colágeno adicional, y; (iv) comprimir el gel adicional de manera que se expulsa líquido del gel.

Un método para producir una construcción biomimética que comprende un canal cubierto puede comprender:

(i) proporcionar un gel comprimido con una o más ranuras en la superficie del mismo,

(ii) proporcionar un gel adicional; y también;

(a) comprimir el gel adicional de manera que se expulse líquido; e

(b) introducir el gel comprimido adicional sobre la superficie del gel comprimido, o;

(c) introducir el gel adicional sobre la superficie del gel comprimido, y

(d) comprimir el gel adicional sobre la superficie del gel comprimido.

El gel comprimido adicional forma un techo que encierra una o más ranuras para producir conductos o microcanales. El gel comprimido y/o la solución de polímero formador de gel adicional se pueden sembrar con células.

El gel comprimido puede proporcionarse comprimiendo un gel con una superficie sólida, por ejemplo, la superficie de un émbolo o sello como se ha descrito anteriormente, que comprende uno o más salientes, de modo que se expulsa líquido del gel y los salientes gofran la una o más ranuras en la superficie de gel. La superficie sólida puede ser permeable o impermeable. Salientes y ranuras adecuadas se describen con más detalle anteriormente.

El gel y el gel adicional se pueden comprimir por cualquier método conveniente. Por ejemplo, se puede emplear un método descrito anteriormente o en el documento WO2006/003442 o Brown RA et al (2005) Adv. Funct. Estera. 15: 176-177.

Las etapas (i) a (iv) pueden repetirse una o más veces para producir una construcción biomimética que comprende múltiples capas de gel comprimido que contiene uno o más microcanales.

El gel y el gel adicional pueden ser geles de colágeno y la solución de polímero formador de gel es una solución de colágeno.

Como se ha descrito anteriormente, los métodos de la divulgación pueden ser útiles para producir una construcción biomimética que comprende múltiples capas de colágeno comprimido que contiene uno o más microcanales o conductos de dimensiones, geometría y dirección controlables, por ejemplo, para aplicaciones de medicina regenerativa. El tamaño del gel comprimido y la construcción biomimética dependen de la aplicación particular. En algunas realizaciones, la construcción biomimética se puede moldear, enrollar, plegar o conformar de otro modo después de la compresión.

Los microcanales o conductos pueden, por ejemplo, aumentar la oxigenación y la perfusión del núcleo de la construcción biomimética y promover el crecimiento entrante de vasos sanguíneos y elementos nerviosos después de la implantación.

Los métodos, kits y aparatos descritos anteriormente también pueden usarse para producir construcciones biomiméticas sin colágeno usando geles sin colágeno. Por ejemplo, un método para producir una construcción biomimética puede comprender:

(i) introducir una solución de gel sin colágeno en un pozo,

(ii) incubar la solución de gel sin colágeno para formar un gel,

(iii) introducir un émbolo en el pozo,

(iv) comprimir el gel con el émbolo de manera que se expulse líquido del gel, y

(v) retirar el émbolo para dejar dicha construcción biomimética en el pozo.

Una solución de gel es una solución que comprende un polímero formador de gel. Polímeros formadores de gel sin colágeno adecuados se describen a continuación. Una solución de gel puede inducirse para solidificarse o endurecerse hasta un gel alterando las condiciones, p. ej. la temperatura.

Un gel sin colágeno puede comprender uno o más polímeros biocompatibles formadores de gel sin colágeno. Polímeros formadores de gel sin colágeno adecuados incluyen polímeros formadores de gel naturales, por ejemplo, proteínas tales como laminina, seda, fibrina, fibronectina o elastina, glicoproteínas como la fibronectina y polisacáridos como la quitina o celulosa, o polímeros formadores de gel sintético, por ejemplo, polímeros orgánicos, tales como polilactona, poliglicona, policapriloctona o polipéptidos sintéticos y polímeros inorgánicos como vidrio de fosfato. Los geles sin colágeno se pueden usar de la misma manera que los geles de colágeno para producir construcciones biomiméticas y se aplican todas las características y aspectos de los métodos y construcciones descritos anteriormente para los geles de colágeno mutatis mutandis a geles sin colágeno.

La divulgación también proporciona un método, un kit y un aparato sustancialmente como se describe en la presente memoria y con referencia a los dibujos adjuntos.

"y/o" donde se usa en el presente documento debe tomarse como una divulgación específica de cada una de las dos características o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B y (iii) A y B, como si cada uno se estableciera individualmente en este documento. A menos que el contexto indique lo contrario, las descripciones y las definiciones de las características expuestas anteriormente no se limitan a ningún aspecto particular o realización de la invención y se aplican por igual a todos los aspectos y realizaciones que se describen.

A menos que el contexto indique lo contrario, el término "comprende" significa que incluye una característica específica y opcionalmente otras características. Por lo tanto, el término abarca tanto a) "incluido, pero no limitado a" como b) "que consiste en" o "que incluye y limitado a". Por ejemplo, "Un producto que comprende A" debe tomarse como una divulgación específica de (i) un producto que incluye A y (ii) un producto que consiste en A solamente, tal como si cada uno se estableciera individualmente aquí.

Ciertos aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora a modo de ejemplo y con referencia a las figuras y tablas que se describen a continuación.

La figura 1 muestra un esquema de un ejemplo de un método de la invención.

La figura 2 muestra un esquema de otro ejemplo de un método de la invención.

La figura 3 muestra una distribución de émbolos que pueden usarse en kits de la invención en una bandeja desechable.

La figura 4 muestra un soporte que contiene pozos integrales que se pueden usar en kits de la invención, junto con una tapa para cubrir los pozos del soporte y una placa de guía para guiar los émbolos a los pozos.

La figura 5 muestra pozos individuales insertados en una placa de montaje con una tapa, que puede usarse en kits de la invención.

Las figuras 6a a 6g muestran un esquema de un aparato que realiza un método de la invención.

La figura 7 muestra una sección transversal de la cabeza de émbolo de un aparato según una realización de la invención.

La figura 8 muestra un aparato según una realización de la invención que comprende un conjunto lineal de estaciones de procesamiento. La estación 1 es una estación de apilamiento de placas para presentar nuevas placas de múltiples pozos al sistema. La estación 2 es una estación dispensadora que agrega reactivos líquidos a los pozos en las placas. Por ejemplo, la estación puede dispensar solución de colágeno, tampón, nutrientes y células a los pozos, o una suspensión celular, por ejemplo, para sembrar la superficie de una construcción en el pozo. La estación 3 es una estación de incubación que mantiene los pozos en la placa a una temperatura elevada (por ejemplo, 37 °C) para colocar la solución de colágeno en los pozos o para incubar células en las construcciones. La estación 4 es una estación de carga de émbolo donde se están cargando émbolos nuevos en los portadores de émbolo de un aparato para la compresión. La estación 5 es una estación de compresión donde los émbolos cargados en la estación 4 se usan para comprimir el gel que se ha endurecido en los pozos de las placas en la estación 3. La estación 6 es una estación de retirada de émbolo donde los émbolos usados se descargan.

La figura 9 muestra los resultados de la tinción histológica de hematoxilina y eosina (H&E) de una construcción biomimética (sección transversal) producida como se describe aquí con el aparato que se muestra en las figuras 6 y 7. Se muestran secciones transversales de las construcciones biomiméticas producidas en dos pozos separados simultáneamente por el aparato.

La figura 10 muestra imágenes representativas de microcanales cubiertos en construcciones de colágeno de PC de doble capa gofradas usando salientes de diferentes dimensiones. Barra de escala 20 pm. Unas flechas muestran la apertura de los canales.

En la figura 1 se muestra un método para producir una construcción biomimética según una realización de la invención. Se describe la producción de una construcción en un único pozo, pero las construcciones se pueden producir en una distribución de pozos simultáneamente de la misma manera.

Se proporciona un émbolo poroso 1 con un conector impermeable 2 en la parte superior en una bandeja 3 que puede contener 24 émbolos (figura 1a #1).

La bandeja se coloca sobre el aparato de compresión de colágeno (no se muestra) y el agujero 4 de un portador de émbolo 5 es forzado a entrar en contacto con el conector de émbolo 2 (figura 1 a #2).

La cabeza de émbolo 6, que contiene todo el mecanismo que sostiene el émbolo, es elevada entonces, elevando el émbolo 1 sostenido en el portador de émbolo 5 desde la bandeja 3 (figura 1 a #3). Luego se descarta la bandeja 3.

Un pozo 7 (que también puede denominarse inserto) se coloca en posición en una placa de montaje 8. El fondo del pozo 7 puede ser poroso. El pozo tiene rebordes 10 que descansan encima de la placa de montaje 8. La placa de montaje se coloca sobre un soporte 9. El soporte 9 puede ser una placa de múltiples pozos. El soporte 9 se muestra en la figura 1a #4 con sombreado cruzado; la placa de montaje 8 tiene trama vertical; el pozo 7 tiene un contorno sólido.

El pozo 7 se llena con solución de colágeno 11 figura 1a #5. Opcionalmente, la solución de colágeno 11 puede sembrarse con células antes o después de la introducción en el pozo 7.

La placa de montaje 8 que contiene el pozo 7 se cubre luego con una tapa 12 y la solución de colágeno 11 se incuba para formar un gel (figura 1a #6). La tapa 12 se muestra en la figura la #6 como una línea densamente punteada.

Luego se retira la tapa 12 y la cabeza de émbolo 6 se mueve sobre la placa de montaje 8 (figura 1b #7). La cabeza 6 se baja de modo que la placa de montaje 8 se asegura en su posición con la guía resiliente externa 13. El émbolo 1 se sostiene en el portador de émbolo 5 encima del gel de colágeno 14 en el pozo 7.

Luego, el pozo 7 se asegura en posición con guías resilientes internas 15 que fuerzan el pozo al fondo del soporte 9, evitando así la expulsión de líquido desde el fondo del pozo 7, cuando se emplea un pozo 7 con un fondo permeable. El émbolo 1 se hace para moverse hacia el fondo del pozo 7 a través de la liberación del portador de émbolo 5, que agarra el émbolo 1 en su agujero 4. El portador de émbolo 5 es sostenido de manera movible dentro de la cabeza de émbolo 6 por el tope 18, que limita el movimiento del portador de émbolo 5 (figura 1 b #7) hasta que se libera (figura 1b #8).

El movimiento hacia abajo del portador de émbolo 5 mueve el émbolo 1 hacia el fondo de su pozo 7, comprimiendo el gel de colágeno 14 en el pozo 7 y absorbiendo el líquido expulsado de él, figura 1b #9.

Después de la compresión, se sube la cabeza de émbolo 6, elevando el émbolo 1 sostenido en el portador de émbolo 5 fuera del pozo 7. La placa de montaje 8 se libera, y la cabeza 6 se aleja del pozo 7 que contiene colágeno comprimido 16 (figura 1b #10).

La tapa 12 se vuelve a colocar sobre el pozo 7 para mantener limpio el colágeno comprimido 16 y facilitar la incubación.

El émbolo 1 es liberado luego de la cabeza de émbolo 6 por la sonda 17 que a través del agujero 4 del portador de émbolo 5 y desaloja el conector 2 del émbolo 1.

El émbolo 1, que contiene el líquido expulsado del gel 14 durante la compresión, luego se descarta.

Otra realización de un método para producir una construcción biomimética se muestra en las figuras 2a y 2b. El método es similar al que se muestra en las figuras 1a y 1b, excepto que los pozos 7 son integrales al soporte 9 (figura 2a #4). A diferencia de las figuras 1a y 1b, no se requieren pozos y placas de montaje separadas. Opcionalmente, se puede usar una placa de guía para facilitar el posicionamiento adecuado de los émbolos en sus respectivos pozos. En esta realización, el émbolo 1 se mueve directamente hacia abajo adentro del pozo 7 en el soporte 9 y, por lo tanto, puede mostrar un diámetro ligeramente mayor que el utilizado con un pozo de inserto separado.

La solución de colágeno 11 se dispensa directamente al pozo 7 en el soporte 9 (figura 2a #5).

Sobre el soporte 9 se coloca directamente una tapa 12 para incubar la solución de colágeno 11 en el pozo 7 y hacer que se forme para producir un gel de colágeno (figura 2a #6).

Luego se retira la tapa 12 y la cabeza de émbolo 6 se mueve sobre el soporte 9 (figura 2b #7). El émbolo 1 se sostiene en la cabeza de émbolo 5 por encima del gel de colágeno 14 en el pozo 7.

El pozo 7 se asegura entonces en posición con las guías resilientes internas 15 que se conectan al tope de émbolo 18. El contacto entre las guías resilientes internas 15 y el soporte 9 desengancha el portador de émbolo 5 del tope de émbolo 18 y provoca que el émbolo 1 se mueva hacia el fondo del pozo 7. El portador de émbolo 5 se sujeta de manera movible dentro de la cabeza de émbolo 6 por el tope 18, que define la extensión del movimiento hacia arriba y hacia abajo del portador de émbolo 5 (figura 2b #8).

El movimiento hacia abajo del portador de émbolo 5 mueve el émbolo 1 hacia el fondo del pozo 7, comprimiendo el gel de colágeno 14 en el pozo 7 y absorbiendo el líquido expulsado de él, figura 2b #9.

Después de la compresión, se sube la cabeza de émbolo 6, elevando el émbolo 1 sostenido en el portador de émbolo 5 fuera del pozo 7. El soporte 9 se libera, y la cabeza 6 se aleja del pozo 7 que contiene colágeno comprimido 16 (figura 2b #10).

El pozo 7 se cubre entonces con la tapa 12 para mantener limpio el colágeno comprimido 16 y facilitar la incubación (figura 2b #11).

El émbolo 1 es liberado luego de la cabeza de émbolo 6 por la sonda 17 que a través del agujero 4 del portador de émbolo 5 y desaloja el conector 2 del émbolo 1 (figura 2b #12).

El émbolo 1, que contiene el líquido previamente expulsado del gel durante la compresión, luego se descarta (figura 2b #13).

En la figura 3 se muestra una distribución de émbolos 1 para comprimir geles en una distribución de pozos. Los émbolos 1 se montan con sus conectores 2 en la parte superior en una bandeja de presentación desechable 3 que coloca los émbolos 1 para cargarlos sobre los portadores de émbolo de un aparato de compresión de colágeno.

En la figura 2 se muestra un soporte impermeable 9. Una distribución de pozos 7 es integral al soporte 9. Se usa una tapa 12 para cubrir los pozos 7 durante las incubaciones y el almacenamiento. Durante la compresión se puede usar una placa de guía 28 para cubrir los pozos 7. La placa de guía 28 contiene una distribución de agujeros 29 que corresponden a los pozos 7 en el soporte 9. Los agujeros 29 se estrechan, es decir, el diámetro interno de los agujeros en la superficie superior 30 de la placa de guía es mayor que el diámetro interno en la superficie inferior de la placa de guía. En la superficie inferior de la placa de guía, los agujeros 29 tienen el mismo diámetro interno que los pozos 7 en el soporte 9. La placa de guía 28 guía los émbolos a medida que se mueven hacia abajo en los pozos 7 del soporte 9.

En la figura 5 se muestra una distribución de pozos individuales 7. Los pozos 7 se estrechan de manera que el diámetro interno en la abertura 32 es mayor que el diámetro interno en el fondo del pozo 33. Los pozos 7 se montan en agujeros 31 en el placa de montaje 8. Los rebordes 10 de los pozos 7 descansan sobre la placa de montaje 8 y evitan que los pozos 7 caigan a través de los agujeros 31. Durante la incubación y el almacenamiento se usa una tapa 12 para cubrir los pozos 7 en la placa de montaje.

El funcionamiento de un aparato para producir simultáneamente construcciones biomiméticas en una distribución de pozos se muestra en la figura 6.

Inicialmente, el aparato 19 está en un estado de descanso con la cabeza de émbolo subida y sin consumibles, como émbolos o pozos, cargados (figura 6a). El aparato 19 comprende una cabeza de émbolo 6 montada de manera pivotante en un poste 25 y movible entre una estación de compresión 26 y una estación de descarga 21. La cabeza 6 contiene una distribución de portadores de émbolo no visibles y guías resilientes internas y externas 15 y 13. La estación de compresión 26 comprende un soporte 20 para acomodar pozos que puede cubrirse con una tapa 12. La montura 20 descansa sobre una placa calentada que no se muestra para incubar pozos acomodados en la montura 20. El aparato contiene una pantalla 22 que indica la temperatura y la duración de incubación de pozos colocados en la montura y controles 23 para permitir que estos parámetros sean ajustados. Una bandeja de desechos retirable 21 se coloca en una estación de descarga 21.

En una primera fase, los portadores de émbolo 5 dentro de la cabeza de émbolo 6 se cargan con émbolos 1. Una bandeja 3 que contiene una distribución de émbolos 1 se coloca en la montura 20 y los conectores 2 de los émbolos 1 se introducen en los agujeros de la distribución de portadores de émbolo no visibles montados en la cabeza de émbolo 6. El enganche del conector 2 con el agujero sostiene cada émbolo 1 en su correspondiente portador de émbolo 5, de modo que la distribución de émbolos 1 puede ser elevada desde la bandeja 3 por la cabeza de émbolo 6 (figura 6b). Esta fase también se muestra esquemáticamente en las etapas 1 y 2 de las figuras 1 y 2.

La cabeza de émbolo 6 cargada con la distribución de émbolos 1 es movida entonces a un lado al pivotarla alrededor del poste 25 para colocarla sobre la bandeja de desechos 21. Los pozos 7 se posicionan en una placa de montaje 8 sobre el soporte 9 en una distribución de 24 pozos. y luego se introduce en la montura 20. Con la cabeza de émbolo 6 colocada sobre la bandeja de desechos 21, los pozos 7 son accesibles para la introducción de solución de colágeno; suspensiones de células; y/u otros reactivos (figura 6c). Esta fase también se muestra esquemáticamente en las etapas 3, 4 y 5 de las figuras 1 y 2.

Mientras la cabeza de émbolo cargado 6 se coloca sobre la bandeja de desechos 21, los pozos 7 en la bandeja de montaje 8 se llenan con solución de colágeno (no visible), se siembran opcionalmente con células y se cubren con una tapa 12. Los pozos se calientan luego en la montura cubierta 20 por el calentador (no se muestra) y se incuba a 37 °C para hacer que la solución de colágeno se convierta en un gel (figura 6d). Esta fase también se muestra esquemáticamente en la etapa 6 de las figuras 1 y 2.

La tapa (no mostrada) se retira entonces de la montura 20 y la cabeza de émbolo 6 se pivota alrededor del poste 25 a una posición sobre los pozos 7, de modo que los émbolos 1 unidos a los portadores de émbolo (no visibles) están listos para insertar en los pozos 7 de la placa (figura 6e). Esta fase también se muestra esquemáticamente en la etapa 7 de las figuras 1 y 2.

La cabeza de émbolo 6 se engancha entonces para que los émbolos 1, que son pesados por las cabezas de émbolo (no visibles), descansen sobre el gel (no visible) en cada pozo 7. Los émbolos 1 comprimen el gel de colágeno no visible y absorben el líquido expulsado del gel por la compresión (figura 6f). Esta fase también se muestra esquemáticamente en las etapas 8 y 9 de las figuras 1 y 2.

Luego se eleva la cabeza de émbolo 6, de modo que los émbolos 1, que ahora contienen líquido expulsado del gel comprimido en los pozos 7, se retiran de los pozos 7 en la montura 20. Esta fase también se muestra esquemáticamente en la etapa 10 de las figuras 1 y 2.

La cabeza de émbolo 6 que contiene los émbolos húmedos 1 se hace pivotar entonces alrededor del poste 25 y se coloca sobre la bandeja de residuos 21 en la estación de descarga 24. Los émbolos húmedos 1 se expulsan a la bandeja de residuos 21. Los pozos 7 de colágeno comprimido permanecen en posición en la placa de montaje 8 en la montura 20, sin estar cubierto por la tapa (figura 6g). Esto corresponde a las etapas 11 a 13 de las figuras 1 y 2.

En algunas realizaciones, la bandeja de desechos 21 puede retirarse y los portadores de émbolo 1 en la cabeza de émbolo 6 pueden cargarse con émbolos nuevos 1. Puede agregarse solución adicional de colágeno, opcionalmente sembrada con células, al colágeno comprimido en los pozos 7. Las etapas mostradas en las figuras 6c a 6g se pueden repetir para producir una construcción de colágeno multicapa en los pozos 7.

El método puede repetirse hasta que las construcciones en los pozos posean el número deseado de capas de colágeno comprimido.

Una sección transversal de la cabeza de émbolo 6 del aparato 19 para producir construcciones biomiméticas de la figura 6 se muestra en la figura 7. Una distribución de émbolos 1 se sostiene en una distribución de portadores de émbolo 5 mediante el enganche por fricción de los conectores 2 con los agujeros 4 dentro los portadores de émbolo 5. Los émbolos 1 se muestran tocando los fondos de una distribución de pozos 7 que se acomodan en una placa de montaje 8 sobre un soporte 9 posicionado en una placa base de calentamiento 27. Los pozos 7 no contienen colágeno.

La cabeza de émbolo se alinea en la montura y la placa de montaje 8 se asegura por las guías externas 13. Un enganche 34 asegura la cabeza en su posición. Los pozos 7 tienen rebordes 10 en sus aberturas que descansan en la placa de montaje 8. Durante la compresión, las guías internas 15 aseguran los pozos 7 sobre la placa de montaje 8 e impulsan el fondo de los pozos 7 contra el soporte 9. Los portadores de émbolo individuales 5 se liberan de la cabeza 6 y ejercen una fuerza gravitacional sobre los émbolos 1 en los pozos 7.

Una sonda 17 se engancha en el agujero 4 de cada portador de émbolo 5 y puede moverse hacia abajo para desalojar el conector 2 y expulsar el émbolo 1 del portador de émbolo 5 después de su uso.

La figura 8 muestra un aparato multiestación de la invención. Las placas que contienen pozos pueden moverse a través de una o más estaciones varias veces. Por ejemplo, después de una pasada a través de cada estación, una placa puede pasar por segunda vez a través de la estación dispensadora para una capa intermedia de células, seguida de la estación dispensadora nuevamente para una nueva capa de colágeno, seguida de incubación, adición de émbolo, compresión y retirada de émbolo.

Secciones transversales de construcciones biomiméticas producidas con el aparato que se muestra en las figuras 6 y 7 se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E). Los resultados se muestran en la figura 9. Se observó una estructura colágena densa con células de fibroblastos dérmicos humanos (densidad inicial 100.000 células/ml) dispersas por toda la estructura, similar a la anatomía de la capa de dermis de la piel. Esto demuestra que las construcciones producidas por el aparato descrito aquí son altamente biomiméticas.

Los microcanales de dos partes se crearon mediante micromoldeo de plantilla utilizando flujo de fluido unidireccional en un formato de múltiples pozos. En la primera fase, se gofraron ranuras en la superficie de una capa. En la siguiente fase, se puso una capa de solución de colágeno nuevo sobre la parte superior de estas ranuras y se comprimió sobre la primera para actuar como 'techo' de microcanal. Esta técnica (que produce 'microcanales cubiertos') permitió una fabricación simple y rápida de construcciones de espesor controlado con canales preformados. Se encontró que las dimensiones de los canales eran una proporción predecible del sello o plantilla utilizados para el moldeo. En las condiciones utilizadas, la proporción estaba entre el 20 % y el 50 % y para sellos de 75 um y 125 um de profundidad, se formaron canales típicamente con 25 pm y 50 a 100 pm de anchura y hasta 30 pm de profundidad (figura 10). La matriz de colágeno comprimido se hizo con células viables en su lugar que crecieron y remodelaron la matriz durante algunas semanas, aunque los canales permanecieron. Se hicieron paredes de canal de fibrillas de colágeno compactas y orientadas que se acumularon alrededor del molde durante la compresión, proporcionando durabilidad en el cultivo. El estudio detallado de la relación entre las dimensiones de plantilla y los canales finalmente producidos ha demostrado que la fidelidad de moldeo es sensible a la forma de sello y la densidad de colágeno. Estos resultados demuestran que la compresión plástica con moldeo y múltiples capas se puede utilizar para hacer construcciones 3D vivas, altamente microcanalizadas y con una buena perfusión.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir una construcción biomimética que comprende:

(i) introducir una solución de gel en un pozo que tiene una abertura,

(ii) incubar la solución de gel para formar un gel,

(iii) introducir un émbolo poroso en el pozo,

(iv) comprimir el gel con el émbolo de manera que se expulsa líquido del gel al émbolo poroso, y

(v) retirar el émbolo poroso para dejar dicha construcción biomimética en el pozo.

2. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de gel se siembra con células.

3. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores que comprende, además:

(vi) introducir una solución de gel adicional en la construcción biomimética en el pozo,

(vii) incubar la solución de gel adicional para formar un gel adicional,

(viii) introducir un émbolo poroso en el pozo

(ix) comprimir el gel adicional con el émbolo de manera que se expulse líquido del gel,

(x) retirar el émbolo para dejar una construcción biomimética que comprende múltiples capas de gel comprimido en el pozo, repitiendo opcionalmente las etapas (vi) a (x) una o más veces para producir una construcción biomimética que comprende múltiples capas de gel comprimido.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el émbolo comprende uno o más salientes que gofran rebajes, opcionalmente ranuras, en la superficie del gel comprimido.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende además sembrar la superficie del gel comprimido con células.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las construcciones biomiméticas se producen en una distribución de pozos simultáneamente.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la solución de gel es una solución de colágeno y el gel es un gel de colágeno.

8. Un émbolo para usar en un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el émbolo comprende un material poroso y se adapta para comprimir un gel en un pozo, de modo que líquido expulsado del gel es absorbido por el émbolo.

9. Un kit para producir una construcción biomimética que comprende:

un émbolo y

un pozo que tiene una abertura,

en donde el émbolo comprende un material poroso y es acomodable en el pozo.

10. Un kit según la reivindicación 9 en donde el material poroso es rígido.

11. Un kit según la reivindicación 9 o la reivindicación 10 en donde el émbolo comprende además un soporte impermeable que contiene el material poroso y opcionalmente comprende uno o más salientes adaptados para gofrar uno o más rebajes, opcionalmente ranuras, en la superficie de un gel en el pozo.

12. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11 que comprende una placa de múltiples pozos.

13. Un aparato de compresión en gel para producir una construcción biomimética que comprende:

una montura para un pozo que contiene un gel,

un pocillo posicionado en la montura,

un portador de émbolo para enganchar un émbolo, y

un émbolo conectado con el portador de émbolo

el portador de émbolo y la montura son movibles uno con respecto al otro, de modo que el émbolo enganchado por el portador es impulsado adentro del pozo en la montura,

en donde el émbolo comprende un material poroso.

14. Un aparato según la reivindicación 13 que comprende una distribución de émbolos.

15. Un aparato según la reivindicación 14, en donde la distribución de émbolos se engancha en el portador de émbolo.

16. Un aparato según la reivindicación 14 que comprende una distribución de portadores de émbolo, enganchándose cada portador de émbolo con una de las distribuciones de émbolos.

17. Un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde la distribución de émbolos es contenida en un cabeza de émbolo movible.

18. Un aparato según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en donde el material poroso es rígido y, opcionalmente, el émbolo comprende uno o más salientes adaptados para gofrar uno o más rebajes, opcionalmente ranuras, en la superficie de un gel.

19. Uso de un émbolo según la reivindicación 8, un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o un aparato según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18 en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.