CN102339356A - 应用代谢组学技术评价与预测药物毒性和药效的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种通过消除生物样本中外源性代谢物信号以准确获取其内源性代谢物信号，并基于内源性代谢物信号评价与预测代谢组学药物毒性和药效的方法。一种应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性或非特定毒性的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、模型毒物组和毒性试验组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，检测获取样本量测信号矩阵，据此对药物毒性评价与预测。本发明同时公开了一种应用代谢组学技术药效评价与预测的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、疾病模型组、治疗组和阳性药物对照组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，检测获取样本量测信号矩阵，据此样本对药效进行评价与预测。本发明对药物毒性和药效可全面、准确评价。

Description

应用代谢组学技术评价与预测药物毒性和药效的方法

技术领域

本发明涉及一种通过消除生物样本中外源性代谢物信号以准确获取其内源性代谢物信号，并基于内源性代谢物信号评价与预测代谢组学药物毒性和药效的方法。

背景技术

药物毒性和药效评价方法主要是基于实验动物对药物的某些反应，评估药物的毒性和药效。对于这种评估手段，传统的方法只能采用一个或几个指标表征其药效和毒性反应，缺乏整体全面的评价，并且对毒性和药效的反应灵敏度较低。对于低毒性药物、甚至亚毒性药物(特别是对于传统中药)也就不可能评价其毒性，最终导致某些药物进入临床试验或进入临床使用时出现一些预料之外的毒副反应，最为明显的即是中药注射剂在临床使用时频频出现问题。

代谢组学(metabonomics)因其能够灵敏而全面地测定不同生理、病理状态下内源性代谢产物的改变，给出生物体对药物毒性和药效的整体信息，从而有利于全面认识和评价药物，现已广泛地应用到了药物研发领域。众所周知，由英国帝国理工学院与Pfizer等六大国际知名制药公司启动的COMET1(theConsortium on Metabonomic Toxicology)计划建立了约150种肝肾毒性模型的专家系统，应用于毒性化合物的发现及高通量筛选。2006年启动的COMET2拟在研究标准毒物分子机制的基础上，建立具预测性的构效关系专家系统。核磁共振(NMR)作为COMET计划使用的分析平台具有显著的特点，但因其灵敏度低、检测动态范围窄而导致应用受限，虽已有很多改进技术，但因成本太高，很难得到普遍应用。相对于NMR而言，高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS/MS)技术具有灵敏度高、专属性强、动态范围宽、获得比NMR更多的化合物结构信息、设备购置费用相对较低的特点，因此已越来越多地被应用于代谢组学，特别是药效温和、毒性极低的中药，基于HPLC-MS/MS技术的代谢组学更有显著的优势。

以空白对照组与给药组的内源性代谢物的浓度差异为基础的代谢组学中，常常需要对所获得的样本数据中存在的干扰组分信号进行消除，以保证代谢组学模型的稳健性和良好的预测能力。代谢物中的成分可分为两大类，即内源性代谢物和外源性代谢物。

内源性代谢物表现的特征为：在空白对照组与给药组之间，在药物刺激下其浓度水平发生相应改变(增加或减少)，并在代谢组学模型中能对样本正常、异常的分类产生影响，包括能够反映毒理或病理状态的潜在生物标志物，其浓度改变是药物毒性或药效的直接反映，它是代谢组学模型建立的基础，即是代谢组学对药物毒性和药效评价与预测的信号源。

外源性代谢物表现的特征为：在代谢组学中它包括两类外源性物质的代谢物，即饲料和药物；对于饲料的代谢物，在空白对照组与给药组之间一般来说它们是基本相同的；对于药物的代谢物，仅存在于给药组之中，而空白对照组是不存在的。由于代谢组学是基于空白对照组与给药组之间的内源性代谢物的“差异性”信号对药物的毒性和药效进行评价和预测，在空白对照组与给药组之间的“等同的”饲料代谢物信号则对代谢组学不会构成明显的影响，而“差异性”的药物代谢物信号则会对代谢组学构成显著影响，甚至造成药物毒性和药效评价结果的错误，特别是对未知组分众多、药效组分复杂的中药代谢组学的影响更为显著。因此，从给药组的样本检测信号中消除外源性代谢物(即药物代谢物)(注：以下所述“外源性代谢物”即指“药物代谢物”)信号即为代谢组学对药物毒性和药效评价的重要问题，基于此发展的代谢组学药物毒性和药效的评价方法才能全面、准确地对其进行评价。

但是现有技术中未见从给药组的样本检测信号中消除外源性代谢物信号以准确获取内源性代谢物信号，并评价代谢组学药物毒性和药效的报道。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种应用代谢组学技术评价与预测药物毒性和药效的方法，包括一种应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法，一种应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法，一种应用代谢组学技术评价与预测药效的方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、模型毒物组和毒性试验组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，据此对药物毒性评价与预测，具体包括以下步骤：

a)当需要评价与预测一待评价药物对某一脏器或细胞的毒性时，采用现有技术中公认的、典型的系列模型致毒药物，向模型毒物组的实验对象分别给药使其产生毒性，同时向空白对照组的实验对象分别给予相应的空白溶剂，收集代谢组学所需要的模型毒物组和空白对照组的生物样本、以及致毒效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

b)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和模型毒物样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，得空白样本和模型毒物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

c)对模型毒物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，得模型毒物样本的内源性代谢物信号矩阵；

d)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获取空白样本信号矢量；以模型毒物样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获取模型毒物样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

e)针对系列模型致毒药物中的任一种模型致毒药物，以模型毒物样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立化学模式识别模型(包括验证集样本对模型的验证)，即得代谢组学毒性模型；同时用步骤a)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证和说明代谢组学毒性模型；同样方法获取系列模型致毒药物中每一种模型致毒药物的代谢组学毒性模型，所有的单一模型致毒药物的代谢组学毒性模型组合在一起，即得所述脏器或细胞的一系列代谢组学毒性模型；

f)将选定的系列模型致毒药物对应的样本信号矢量作为一个整体(即一个模型毒物组)，与空白样本信号矢量建立一个化学模式识别模型(包括模型验证)，该模型即为多种模型致毒药物的代谢组学毒性模型；

g)采用步骤e)所获得的系列代谢组学模型，或者采用步骤e)所获得的系列代谢组学模型加上步骤f)所获得的代谢组学毒性模型，构建该脏器或细胞毒性的代谢组学专家系统；

h)将待评价药物给予毒性试验组的实验对象，得被评价药物的生物样本，然后进行消除色谱基线处理以及消除外源性代谢物信号处理，获取毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵，据此得毒性试验样本信号矢量，所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；将上述信号矢量作为代谢组学模型的预测变量代入代谢组学专家系统，以类间距为标准评价与预测所述待评价药物对该脏器或细胞的毒性。

本发明同时提供了一种应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和毒性试验组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，据此样本对药物毒性评价与预测，具体包括以下步骤：

1)向毒性试验组的实验对象分别给予被评价药物使其产生毒性，同时向空白对照组的实验对象分别给予相应的空白溶剂，收集代谢组学所需要的毒性试验组和空白对照组的生物样本、以及致毒效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

2)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和毒性试验样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，得空白样本和毒性试验样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

3)对毒性试验样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，得毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵；

4)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获取空白样本信号矢量；以毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获取毒性试验样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

5)以毒性试验样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立无监督的化学模式识别模型，即得代谢组学毒性模型；同时用步骤1)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证或旁证和说明代谢组学毒性模型；

6)在代谢组学毒性模型中，计算毒性试验组与空白对照组间的类间距，以此为标准评价与预测药物的毒性。

本发明还提供了一种应用代谢组学技术药效评价与预测的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、疾病模型组、治疗组和阳性药物对照组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号(矩阵)，据此样本对药效进行评价与预测，其方法与步骤如下：

A)当需要评价与预测一待测药物对某一病例的药效时，选择典型的、公认的系列疾病模型，收集代谢组学所需要的疾病模型组和空白对照组的生物样本、以及治疗效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

B)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和疾病模型样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，获得空白样本和疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

C)当疾病模型是由药物作用而造模时，对疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，获得疾病模型样本的内源性代谢物信号矩阵；其他情况中，疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵即为此样本的内源性代谢物信号矩阵；所述药物包括化学试剂、生物试剂；

D)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获得空白样本信号矢量；以疾病模型样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获得疾病模型样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

E)对任意单一疾病模型，以疾病模型样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立化学模式识别模型(包括验证集样本对模型的验证)，即得代谢组学疾病模型；同时用步骤A)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证和说明代谢组学疾病模型；采用同样方法建立系列疾病模型中所有单一疾病模型的代谢组学疾病模型，即得同一病例的一系列的单一病理代谢组学模型构成的系列代谢组学模型；

F)将选定的系列疾病模型对应的疾病模型样本信号矢量作为一个整体(即一个疾病模型组)，与空白样本信号矢量建立一个化学模式识别模型(包括模型验证)，该模型即为同一病例的多病理的代谢组学模型；

G)采用步骤E)所获得的系列代谢组学模型，或者采用步骤E)所获得的系列代谢组学模型加上步骤F)所获得的代谢组学毒性模型，构建该病例的代谢组学专家系统；

H)将待评价药物和阳性药物分别给予治疗组和阳性药物对照组的实验对象，得治疗组和阳性药物组的生物样本，进行消除色谱基线处理以及消除外源性代谢物信号处理，获取治疗样本和阳性药物样本的内源性代谢物信号矩阵，据此得样本信号矢量，所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；将上述信号矢量作为代谢组学模型的预测变量于代谢组学专家系统，以类间距为标准评价药物对该病例的治疗效果，从而评价与预测药效。

在上述方法中的治疗组和阳性药物对照组，包括：对于治疗性药物，疾病模型实验对象给予待评价药物即为治疗组，给予阳性药物即为阳性药物对照组；对于预防性药物，实验对象给予待评价药物，并给予疾病模型实验对象造模所使用的药物(包括化学、生物试剂)，即为治疗组；对于预防性药物，实验对象给予阳性药物，并给予疾病模型实验对象造模所使用的药物(包括化学、生物试剂)，即为阳性药物对照组。

上述技术方案中，所述消除色谱基线处理是指在量测信号矩阵中消除色谱基线漂移，具体包括以下步骤：

I)在以保留时间Rt和质荷比m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，以信噪比小于阈值即为噪声的原则，判定量测信号矩阵中每一个m/z指标对应的色谱矢量，确定无被检组分信号的色谱矢量，此即为噪声矢量，该色谱矢量即为色谱基线矢量；所述阈值为3～10；

II)将信号矩阵中所有的色谱基线矢量取平均，即得该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量；

III)将量测信号矩阵中每个m/z指标对应的色谱矢量减去该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量，即得消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

该方法的特点为：确定的色谱基线(矢量)包括了样本检测的整个保留时间范围，既有无色谱峰的区间，又包括存在检测信号的色谱峰区间，它是一个真实的色谱漂移基线，是不可能用通常的拟合方法获取的。现有技术中，通常的基线扣除方法仅仅能够完全扣除无色谱峰区间的基线漂移，色谱峰区间的基线漂移仅能部分扣除或不能扣除，这样的基线漂移扣除对于代谢组学是没有意义的。用上述方法能够有效扣除色谱基线漂移，获得真实的、无基线漂移的色谱。

上述技术方案中，所述消除外源性代谢物信号处理的方法选自以下两种方法中的任意一种：

方法一、基于质谱信号正交投影获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.5～0.9999之间的一个数值，优选的阈值即为0.90～0.99之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

上述方法的特点为：它是基于质谱信号矢量的正交性提出的从给药样本量测信号中消除外源性代谢物信号、获得内源性代谢物信号的一种方法，能够有效地从给药样本的量测信号中发现并提取出不同于空白对照样本的外源性代谢物信号，这类信号严重干扰代谢组学对药效和毒性评价的准确性。该方法与色谱峰的重叠与否无关，与样本的复杂程度无关，因此该特点对于中药代谢组学特别有益。因为一般的方法不能有效地消除复杂中药的外源性代谢物信号。

方法二、基于总浓度质谱获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将所有空白样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了空白对照组的总浓度质谱矢量；

III)将同一给药组的所有给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得给药组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了给药组的总浓度质谱矢量；

IV)以空白对照组的总浓度质谱矢量为标准，比较给药组的总浓度质谱矢量，多出现的碎片离子信号则来源于外源性代谢物，从而确定外源性代谢物碎片离子，即外源性代谢物的m/z指标；

V)在给药组的每个给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，消除步骤IV)所确定的m/z指标对应的外源性代谢物信号，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵。

此方法的特点为：它是基于总浓度质谱矢量提出的从给药样本量测信号中消除外源性代谢物信号、获得内源性代谢物信号的一种方法，能够有效地从给药样本的量测信号中发现并提取出不同于空白对照样本的外源性代谢物信号，这类信号严重干扰代谢组学对药效和毒性评价的准确性。该方法与色谱峰的重叠与否无关，与样本的复杂程度无关，同时由于总浓度质谱的灵敏度极高，因此该特点对于中药代谢组学特别有益。

上述技术方案中所述的总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量和色谱组分总质谱矢量等四种信号矢量是由信号矩阵变换而获得，其变换方法分别为：

总离子流色谱矢量：以Rt和m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，沿m/z指标方向进行加和，即相同Rt不同m/z的矩阵元素加和，即得；

碎片离子总色谱矢量：以Rt和m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，不同m/z指标对应的色谱矢量(即碎片离子色谱)进行首尾并置(无碎片离子信号的色谱矢量不包含在其中)即得；或者在m/z指标对应的碎片离子色谱矢量中，将色谱峰对应的矢量元素重新构建色谱峰矢量，再将不同m/z指标对应的色谱峰矢量进行首尾并置即得；

总浓度质谱矢量：以Rt和m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，沿Rt指标方向进行加和(即相同m/z不同Rt的矩阵元素加和)即得；

色谱组分总质谱矢量：以Rt和m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，不同Rt指标对应的质谱矢量(即色谱组分质谱)进行首尾并置(无碎片离子信号的质谱矢量不包含在其中)即得；或者在Rt指标对应的质谱矢量中，将碎片离子对应的矢量元素重新构建质谱峰矢量，再将不同Rt指标对应的质谱峰矢量进行首尾并置即得。

上述技术方案中，所述样本包括：全血、血浆、血清、尿液、粪便、脑脊液、胆汁、泪液、汗液、唾液、精液、阴道分泌物、羊水、脐液、组织匀浆、细胞或细胞培养液(基)、细菌培养液(基)；所述样本可来源于人、动物、细胞和细菌，该四类即为上述技术方案中所述的实验对象。

上述技术方案中，所述的给药样本包括：模型毒物样本、毒性试验样本、治疗样本、阳性药物对照样本、以及当疾病模型是由药物(包括化学试剂、生物试剂)作用而造模时的疾病模型样本。

上述技术方案中，检测样本的方法包括：液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱，其中的质谱包括单质谱、多重质谱。

上述技术方案中，样本检测所获得的信号矩阵，保留时间Rt和质荷比m/z分别是该矩阵的行指标和列指标，也可以分别是列指标和行指标，其中的每个矩阵元素表示在该矩阵元素对应的Rt处质荷比为m/z的碎片离子的含量(浓度)或信号强度。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明所述应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法所用的内源性代谢物信号具有两个特点，即完全消除色谱基线漂移(特别是色谱峰中所包含的基线漂移)和有效消除了外源性代谢物信号，这些变化量均会对代谢组学所依赖的内源性代谢物的变化量产生影响，特别是对于低毒性甚至亚毒性的药物(主要是一些中药)不能准确评价，甚至得出错误的评价结论，因此，该方法对药物毒性能够全面地、准确地评价和预测，特别适用于低毒性甚至亚毒性的中药，不管中药成分有多么的复杂，均能很好地适用。同时该方法是一种药物特定毒性评价与预测的方法，该毒性所指的“特定”即为代谢组学毒性模型所选择的“特定”模型致毒药物所产生的毒性(如肝脏毒性、肾脏毒性等等)，常常表现为靶器官毒性。

2.本发明所述应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法所用的内源性代谢物信号具有两个特点，即完全消除色谱基线漂移(特别是色谱峰中所包含的基线漂移)和有效消除了外源性代谢物信号，这些变化量均会对代谢组学所依赖的内源性代谢物的变化量产生影响，特别是对于低毒性甚至亚毒性的药物(主要是一些中药)不能准确评价，甚至得出错误的评价结论，因此，该方法对药物毒性能够全面地、准确地评价和预测，特别适用于低毒性甚至亚毒性的中药，不管中药成分有多么的复杂，均能很好地适用。同时该方法是一种药物非特定毒性评价与预测的方法，该毒性的“非特定”性是指药物所表现出的任何毒性，是没有特定作用靶标或靶器官，可能是广泛毒性，也可能是特定毒性，这对于多靶点、复方药物(如中药)的毒性评价特别有利，能够说明药物对机体的全面毒性，即机体毒性。

3.本发明所述应用代谢组学技术药效评价与预测的方法所用的内源性代谢物信号具有两个特点，即完全消除色谱基线漂移(特别是色谱峰中所包含的基线漂移)和有效消除了外源性代谢物信号，这些变化量均会对代谢组学所依赖的内源性代谢物的变化量产生影响，特别是对于药效作用温和、多组分协同作用的中药药效评价的影响更为严重。若不消除包含于检测信号中的上述两类信号，代谢组学对药效的评价极有可能出现错误的结论，更不可能有稳定重现的结果。因此，该方法对药效能够全面地、准确地评价和预测，特别适用于药效作用温和、多组分协同作用的中药，不管中药成分有多么的复杂，均能很好地适用。

附图说明

附图1为实施例一中标准样品体系的总离子流色谱；其中，实线：空白对照组(2个内源性物质)；虚线：给药组(内源性和外源性物质各2个)；圆圈：外源性物质；

附图2为实施例一中所确定的标准样品体系的色谱基线；

附图3为实施例一中经本发明方法消除色谱基线漂移后的总离子流色谱(经平滑处理)；其中，实线：空白对照组(2个内源性物质)；虚线：给药组(内源性和外源性物质各2个)；圆圈：给药组中的实际外源性物质；圆点：质谱信号正交投影法获得的给药组中的外源性物质；

附图4为实施例一中CCl4致肝毒性SD大鼠尿液样本的量测信号矩阵总离子流色谱，其中，实线：未消除色谱基线漂移；虚线：本发明方法消除色谱基线漂移；

附图5为实施例一中量测信号矩阵总离子流色谱基线(CCl4致肝毒性SD大鼠尿液样本)；

附图6为实施例二中空白组(实线：内源性代谢物组分1、2和3)、给药组(虚线：“内源性代谢物组分1、2和3”+“外源性代谢物组分4、5和6”)的总离子流色谱

附图7为实施例二中基于附图6所描述的内源性和外源性代谢物，利用本发明的质谱信号正交投影法获得的(圆圈)给药组中的内源性代谢物组分总离子流色谱(实线：实际色谱)；

附图8为实施例二中基于附图6所描述的代谢物信号，利用本发明的总浓度质谱矢量法获得的(圆圈)给药组内源性代谢物的总离子流色谱(实线：实际色谱)；

附图9为实施例三中质谱信号正交投影法消除外源性代谢物信号干扰的条件下，利用PCA方法建立中药黄药子致肝毒性代谢组学模型(“□”空白对照组；“Δ”第1天给药；

第2天给药；“*”第3天给药)；

附图10为实施例三中空白对照组大鼠肝组织切片(400×光学显微镜下观察)；

附图11为实施例三中中药黄药子组大鼠肝组织切片(400×光学显微镜下观察)。

附图12为实施例三中在未消除外源性代谢物信号干扰的条件下，利用PCA方法建立中药黄药子致肝毒性代谢组学模型(“□”空白对照组；“Δ”第1天给药；

第2天给药；“*”第3天给药)；

附图13为实施例三中SD大鼠给药组(中药黄药子)尿液样本的量测信号矩阵总离子流色谱(归一化图)；

附图14为实施例三中基于附图13描述的样本信号，利用本发明的质谱信号正交投影法获取SD大鼠给药样本(中药黄药子)的内源性代谢物信号的总离子流色谱(归一化图)；

附图15为实施例三中基于附图13描述的样本信号，利用本发明的质谱信号正交投影法获取SD大鼠给药样本(中药黄药子)的外源性代谢物信号的总离子流色谱(归一化图)。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：

以下实施方式以SD大鼠尿液的HPLC-MS/MS检测所获得的信号矩阵(保留时间Rt为行指标、质荷比m/z为列指标)为例进行说明，但并不意味着本发明仅限于此，本发明以权利要求书为准。

实施例一：

为了实现本发明的药效和毒性评价，必须对HPLC-MS/MS检测生物样本所获得的信号矩阵中所包括的两类干扰信号之一色谱基线漂移进行消除，本发明提出了消除方法。为了证明方法的可行性，本实施例设计了一个标准样品体系，同时用一个CCl4致肝毒性SD大鼠尿液样本信号进行验证，现说明如下：

标准样品体系：对于空白对照组、给药组和外源性物质等三个混合标准样本的色谱(附图1)，按照以下步骤消除色谱基线漂移：

I)在以保留时间Rt和质荷比m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，以信噪比小于阈值即为噪声的原则，判定量测信号矩阵中每一个m/z指标对应的色谱矢量，确定无被检组分信号的色谱矢量，此即为噪声矢量，该色谱矢量即为色谱基线矢量；所述阈值为3～10；

II)将信号矩阵中所有的色谱基线矢量取平均，即得该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量；

III)将量测信号矩阵中每个m/z指标对应的色谱矢量减去该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量，即得消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

得真实的色谱基线(附图2)和消除色谱基线漂移的量测信号矩阵，据此得总离子流色谱(附图3)。附图2反映了样本的真实色谱基线，其漂移是严重的，用通常的直线或曲线模拟基线进行消除的方法是不可能有效消除的，但比较附图1和3可见：本发明的方法对于三个样本的色谱基线漂移均得到了有效消除。

实际样本体系：CCl4致肝毒性SD大鼠的尿液样本的色谱(附图4)，同样消除色谱基线漂移方法之步骤I-VI)得真实的色谱基线(附图5)和消除色谱基线漂移的量测信号矩阵，据此得总离子流色谱(附图4)。本实验所反映的色谱基线漂移与上述实验类似，同样也获得了有效消除。

实施例二：

为了实现本发明的药效和毒性评价，必须对HPLC-MS/MS检测生物样本所获得的信号矩阵中所包括的两类干扰信号之一外源性代谢物信号进行消除，本发明提出了两种消除方法。为了证明方法的可行性，本实施例使用了实施例一中所述体系的标准样品体系，同时，另设计了一个模拟体系进行验证，现说明如下：

模拟体系：见附图6，从图表明内源性与外源性代谢物发生了明显的信号重叠，难以用通常的方法进行消除。利用发明内容所述的消除外源性代谢物信号之方法一“质谱信号正交投影法”按步骤I-VI)得内源性代谢物信号矩阵，具体步骤为：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.5～0.9999之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

据此得内源性代谢物的总离子流色谱(附图7)，从图可知，本发明的方法能够从复杂的代谢物信号中准确获取代谢组学药效和毒性评价所依赖的信号(内源性代谢物信号)，可以准确地消除外源性代谢物干扰信号。

对于上述模拟体系，利用发明内容所述的消除外源性代谢物信号之方法二“总浓度质谱矢量法”，也能够从复杂的代谢物信号中准确获取代谢组学药效和毒性评价所依赖的内源性代谢物信号(附图8)，可以准确地消除外源性代谢物干扰信号。

标准样品体系：基于附图3所表征的空白对照组(实线)的2个模拟内源性代谢物，同样采用上述“质谱信号正交投影法”消除外源性代谢物信号，得给药样本的外源性代谢物信号矩阵，据此得给药样本的外源性代谢物的总离子流色谱(圆点)，与给药样本中实际含有的2个外源性代谢物的总离子流色谱(圆圈)一致，说明本方法是能够有效地消除给药样本中的外源性代谢物信号。从附图3中给药样本的实际外源性代谢物的总离子流色谱(圆圈)可以意外发现，在保留时间5.1min左右有一个低含量组分在本方法所获得的色谱(圆点)中不存在，但这个组分共同存在于空白对照组(实线)和给药组(虚线)之中，应该是它们的共有杂质。由于它是给药组与空白对照组的共有组分，因此被认为是内源性代谢物而被保留了下来，这进一步说明了本方法能够有效地保留内源性代谢物信号，而消除外源性代谢物信号，进一步证实了本方法的可行性。

实施例三

将实验用SD大鼠随机分为空白对照组和黄药子组，中药黄药子水提物以多次重复给药方式灌胃大鼠(60g/kg)，连续3天，一天2次，收集0～24h，24h～48h，48h～72h尿液；正常组给予相应剂量的蒸馏水，连续3天，收集0～24h，24h～48h，48h～72h尿液；尿液样本经甲醇沉淀去蛋白，12000rpm高速离心5min，上清液于0.45μm微孔滤膜过滤，HPLC-MS/MS检测得样本量测信号矩阵(保留时间Rt为行指标、质荷比m/z为列指标)。黄药子组与正常对照组在给药3天后，腹腔注射4％水合氯醛(1ml/100g体重)麻醉后，腹主动脉采集血液样本，并解剖采集肝组织样本。

按实施例一所述方法消除量测信号矩阵中色谱基线漂移，得各样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。以此信号矩阵为基础，利用“质谱信号正交投影法”消除外源性代谢物信号，得给药组每个样本的内源性代谢物信号矩阵。

将信号矩阵沿列指标m/z方向加和，得列矢量即为总离子流色谱矢量。基于此方法，由给药组每个样本的内源性代谢物信号矩阵即得给药样本总离子流色谱矢量，由空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵，得空白样本总离子流色谱矢量。以此两类总离子流色谱矢量为化学模式识别变量，建立无监督的PCA模型，即得中药黄药子的代谢组学毒性模型(附图9)，此模型即为本发明所述的非特定毒性模型，表征了机体毒性。从图可见，黄药子的机体毒性存在一个渐近的过程，主要表现在肝毒性，这从实验动物第三天的血液生物检测(表1)和肝组织切片(附图10和11)也可以证明黄药子产生了肝毒性。

表1大鼠血液生化指标及体重结果(

n＝6)

注：与正常对照组比较，^aP＜0.05，^bP＜0.01

为了说明给药样本中外源性代谢物信号对代谢组学毒性模型的严重干扰，做一对比试验：按实施例三的方法处理，区别仅仅在于给药样本的信号矩阵不按实施例三中“质谱信号正交投影法”消除外源性代谢物信号，其代谢组学毒性模型参见附图12。

与附图9比较可知：利用本发明有效地消除外源性代谢物的干扰后，给药第1天与正常组重叠，说明毒性不明显，给药第2天和第3天与正常组开始逐渐远离，说明黄药子开始引发了明显的毒性。但是，在未消除干扰的情况下(附图12)，由于中药的外源性代谢物较多，对模型存在着较明显的干扰，它使给药三天之间以及与空白对照之间均存在着非常明显的差异，在模型中会将此“差异”误判为由于药物的毒性所引起的“差异”，使“毒性”被扩大，从而导致代谢组学模型对毒性评价的错误。事实上，给药样本在消除前(附图13)与消除干扰之后(附图14)是存在较大差异的，说明中药代谢物这些外源性代谢物信号对代谢组学模型的干扰是较为严重的，利用本发明获得的外源性代谢物信号(附图15)中确实证明包括了大量的中药黄药子的代谢物，预示着外源性代谢物信号将对代谢组学毒性和药效评价产生较大的影响，必须将其消除，否则，毒性和药效评价的准确性将显著降低，其可靠性不足。

实施例四

以总离子流色谱为例，说明药效评价与预测的方法和步骤如下：

a)将实验用SD大鼠作为空白对照组给予空白溶剂，将疾病模型SD大鼠(例如自发性高血压大鼠模型、四氯化碳致肝损伤大鼠模型)作为疾病模型组给予正常饲养。对于实验组(包括治疗组和阳性药物对照组)，具有疾病模型SD大鼠给予治疗性药物或阳性对照药物；或者疾病模型SD组大鼠造模之前给予预防性药物或阳性对照药物。收集尿样，甲醇沉淀去蛋白，12000rpm高速离心5min，上清液于0.45μm微孔滤膜过滤。同时收集致毒效果评价的生化样本和病理组织样本。

b)尿样用HPLC-MS/MS进行检测，得(空白对照组、疾病模型组、实验组)样本量测信号矩阵(保留时间Rt为行指标、质荷比m/z为列指标)。同时对生化样本和病理组织样本进行检测。

c)对于空白样本量测信号矩阵、给药样本量测矩阵(即疾病模型样本量测信号矩阵、治疗样本量测信号矩阵、阳性药物样本量测信号矩阵)，按实施例一所述的方法，得空白样本、疾病模型样本、治疗样本和阳性药物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

d)对于疾病模型是由药物(包括化学试剂、生物试剂)作用而造模时，疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵按发明内容2或3，得此样本的内源性代谢物信号矩阵；否则，疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵即为此样本的内源性代谢物信号矩阵。对于治疗和阳性对照药物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵，按照以下两种方法中的任意一种消除外源性代谢物信号：

方法一

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.90～0.99之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

方法二：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将所有空白样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了空白对照组的总浓度质谱矢量；

III)将同一给药组的所有给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得给药组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了给药组的总浓度质谱矢量；

IV)以空白对照组的总浓度质谱矢量为标准，比较给药组的总浓度质谱矢量，多出现的碎片离子信号则来源于外源性代谢物，从而确定外源性代谢物碎片离子，即外源性代谢物的m/z指标；

V)在给药组的每个给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，消除步骤IV)所确定的m/z指标对应的外源性代谢物信号，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵。

得此样本的内源性代谢物信号矩阵

e)信号矩阵沿列指标m/z方向加和，得列矢量即为总离子流色谱(矢量)。基于此方法，由空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵，得空白样本总离子流色谱矢量；由疾病模型样本的内源性代谢物信号矩阵，得此样本总离子流色谱矢量；由治疗样本和阳性对照药物样本的内源性代谢物信号矩阵，得此样本总离子流色谱矢量。上述四类矢量均为内源性代谢物总离子流色谱矢量。

f)对于同一疾病模型，以疾病模型样本总离子流色谱矢量和空白样本总离子流色谱矢量为化学模式识别变量，分别将疾病模型组、空白对照组的总离子流色谱矢量的2/3用于建立化学模式识别模型(如无监督的PCA模型、有监督的DPLS模型)，另外的1/3用于模型检验，即得代谢组学疾病模型。同时用生化样本和病理组织样本的检验结果验证模型。

g)将该病例的系列疾病模型的尿样量测信号矩阵按c)～f)项进行处理，即得同一病例的一系列的代谢组学模型。

h)将选定的同一病例的系列疾病模型对应的病理样本总离子流色谱矢量作为一个整体(即同一个病理组)，按上述方法与空白样本总离子流色谱矢量建立一个化学模式识别模型(包括模型验证)。

i)以项f)和g)或项f)、g)和h)所获得的系列代谢组学模型，构建该病例的代谢组学专家系统；

j)将治疗样本和阳性对照药物样本总离子流色谱矢量作为预测变量，于代谢组学专家系统，以治疗组与阳性药物对照组的类间距为比较标准评价与预测试验药物的药效。

Claims (9)

1.一种应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、模型毒物组和毒性试验组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，据此对药物毒性评价与预测，其特征在于，具体包括以下步骤：

a)当需要评价与预测一待评价药物对某一脏器或细胞的毒性时，采用现有技术中公认的、典型的系列模型致毒药物，向模型毒物组的实验对象分别给药使其产生毒性，同时向空白对照组的实验对象分别给予相应的空白溶剂，收集代谢组学所需要的模型毒物组和空白对照组的生物样本、以及致毒效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

b)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和模型毒物样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，得空白样本和模型毒物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

c)对模型毒物样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，得模型毒物样本的内源性代谢物信号矩阵；

d)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获取空白样本信号矢量；以模型毒物样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获取模型毒物样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

e)针对系列模型致毒药物中的任一种模型致毒药物，以模型毒物样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立化学模式识别模型，包括验证集样本对模型的验证，即得代谢组学毒性模型；同时用步骤a)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证和说明代谢组学毒性模型；同样方法获取系列模型致毒药物中每一种模型致毒药物的代谢组学毒性模型，所有的单一模型致毒药物的代谢组学毒性模型组合在一起，即得所述脏器或细胞的一系列代谢组学毒性模型；

f)将选定的系列模型致毒药物对应的样本信号矢量作为一个整体，即一个模型毒物组，与空白样本信号矢量建立一个化学模式识别模型，包括模型验证，该模型即为多种模型致毒药物的代谢组学毒性模型；

g)采用步骤e)所获得的系列代谢组学模型，或者采用步骤e)所获得的系列代谢组学模型加上步骤f)所获得的代谢组学毒性模型，构建该脏器或细胞毒性的代谢组学专家系统；

h)将待评价药物给予毒性试验组的实验对象，得被评价药物的生物样本，然后进行消除色谱基线处理以及消除外源性代谢物信号处理，获取毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵，据此得毒性试验样本信号矢量，所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；将上述信号矢量作为代谢组学模型的预测变量代入代谢组学专家系统，以类间距为标准评价与预测所述待评价药物对该脏器或细胞的毒性。

2.根据权利要求1所述的应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法，其特征在于，所述消除色谱基线处理是指在量测信号矩阵中消除色谱基线漂移，具体包括以下步骤：

I)在以保留时间Rt和质荷比m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，以信噪比小于阈值即为噪声的原则，判定量测信号矩阵中每一个m/z指标对应的色谱矢量，确定无被检组分信号的色谱矢量，此即为噪声矢量，该色谱矢量即为色谱基线矢量；所述阈值为3～10；

II)将信号矩阵中所有的色谱基线矢量取平均，即得该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量；

III)将量测信号矩阵中每个m/z指标对应的色谱矢量减去该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量，即得消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

3.根据权利要求1所述的应用代谢组学技术评价与预测药物特定毒性的方法，其特征在于，所述消除外源性代谢物信号处理的方法选自以下两种方法中的任意一种：

方法一、基于质谱信号正交投影获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.5～0.9999之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

方法二、基于总浓度质谱获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将所有空白样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了空白对照组的总浓度质谱矢量；

III)将同一给药组的所有给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得给药组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了给药组的总浓度质谱矢量；

IV)以空白对照组的总浓度质谱矢量为标准，比较给药组的总浓度质谱矢量，多出现的碎片离子信号则来源于外源性代谢物，从而确定外源性代谢物碎片离子，即外源性代谢物的m/z指标；

V)在给药组的每个给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，消除步骤IV)所确定的m/z指标对应的外源性代谢物信号，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵。

4.一种应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和毒性试验组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，据此样本对药物毒性评价与预测，其特征在于，具体包括以下步骤：

1)向毒性试验组的实验对象分别给予被评价药物使其产生毒性，同时向空白对照组的实验对象分别给予相应的空白溶剂，收集代谢组学所需要的毒性试验组和空白对照组的生物样本、以及致毒效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

2)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和毒性试验样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，得空白样本和毒性试验样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

3)对毒性试验样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，得毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵；

4)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获取空白样本信号矢量；以毒性试验样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获取毒性试验样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

5)以毒性试验样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立无监督的化学模式识别模型，即得代谢组学毒性模型；同时用步骤1)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证或旁证和说明代谢组学毒性模型；

6)在代谢组学毒性模型中，计算毒性试验组与空白对照组间的类间距，以此为标准评价与预测药物的毒性。

5.根据权利要求4所述的应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法，其特征在于，所述消除色谱基线处理是指在量测信号矩阵中消除色谱基线漂移，具体包括以下步骤：

I)在以保留时间Rt和质荷比m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，以信噪比小于阈值即为噪声的原则，判定量测信号矩阵中每一个m/z指标对应的色谱矢量，确定无被检组分信号的色谱矢量，此即为噪声矢量，该色谱矢量即为色谱基线矢量；所述阈值为3～10；

II)将信号矩阵中所有的色谱基线矢量取平均，即得该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量；

III)将量测信号矩阵中每个m/z指标对应的色谱矢量减去该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量，即得消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

6.根据权利要求4所述的应用代谢组学技术评价与预测药物非特定毒性的方法，其特征在于，所述消除外源性代谢物信号处理的方法选自以下两种方法中的任意一种：

方法一、基于质谱信号正交投影获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.5～0.9999之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

方法二、基于总浓度质谱获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将所有空白样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了空白对照组的总浓度质谱矢量；

III)将同一给药组的所有给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得给药组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了给药组的总浓度质谱矢量；

IV)以空白对照组的总浓度质谱矢量为标准，比较给药组的总浓度质谱矢量，多出现的碎片离子信号则来源于外源性代谢物，从而确定外源性代谢物碎片离子，即外源性代谢物的m/z指标；

V)在给药组的每个给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，消除步骤IV)所确定的m/z指标对应的外源性代谢物信号，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵。

7.一种应用代谢组学技术药效评价与预测的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组、疾病模型组、治疗组和阳性药物对照组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，据此样本对药效进行评价与预测，其特征在于，具体包括以下步骤：

A)当需要评价与预测一待测药物对某一病例的药效时，选择典型的、公认的系列疾病模型，收集代谢组学所需要的疾病模型组和空白对照组的生物样本、以及治疗效果评价相应的生化样本和病理组织样本；

B)对生物样本检测获得的空白样本量测信号矩阵和疾病模型样本量测信号矩阵进行消除色谱基线处理，获得空白样本和疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

C)当疾病模型是由药物作用而造模时，对疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵进行消除外源性代谢物信号处理，获得疾病模型样本的内源性代谢物信号矩阵；其他情况中，疾病模型样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵即为此样本的内源性代谢物信号矩阵；所述药物包括化学试剂、生物试剂；

D)以空白样本消除色谱基线漂移的量测信号矩阵为基础，获得空白样本信号矢量；以疾病模型样本的内源性代谢物信号矩阵为基础，获得疾病模型样本信号矢量；所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；

E)对任意单一疾病模型，以疾病模型样本信号矢量和空白样本信号矢量为化学模式识别变量，建立化学模式识别模型，包括验证集样本对模型的验证，即得代谢组学疾病模型；同时用步骤A)所述的生化样本和病理组织样本的检测结果验证和说明代谢组学疾病模型；采用同样方法建立系列疾病模型中所有单一疾病模型的代谢组学疾病模型，即得同一病例的一系列的单一病理代谢组学模型构成的系列代谢组学模型；

F)将选定的系列疾病模型对应的疾病模型样本信号矢量作为一个整体，即一个疾病模型组，与空白样本信号矢量建立一个化学模式识别模型，包括模型验证，该模型即为同一病例的多病理的代谢组学模型；

G)采用步骤E)所获得的系列代谢组学模型，或者采用步骤E)所获得的系列代谢组学模型加上步骤F)所获得的代谢组学毒性模型，构建该病例的代谢组学专家系统；

H)将待评价药物和阳性药物分别给予治疗组和阳性药物对照组的实验对象，得治疗组和阳性药物组的生物样本，进行消除色谱基线处理以及消除外源性代谢物信号处理，获取治疗样本和阳性药物样本的内源性代谢物信号矩阵，据此得样本信号矢量，所述信号矢量包括：总离子流色谱矢量、碎片离子总色谱矢量、总浓度质谱矢量、色谱组分总质谱矢量；将上述信号矢量作为代谢组学模型的预测变量于代谢组学专家系统，以类间距为标准评价药物对该病例的治疗效果，从而评价与预测药效。

8.根据权利要求7所述的应用代谢组学技术药效评价与预测的方法，其特征在于，所述消除色谱基线处理是指在量测信号矩阵中消除色谱基线漂移，具体包括以下步骤：

I)在以保留时间Rt和质荷比m/z为行列指标或列行指标的信号矩阵中，以信噪比小于阈值即为噪声的原则，判定量测信号矩阵中每一个m/z指标对应的色谱矢量，确定无被检组分信号的色谱矢量，此即为噪声矢量，该色谱矢量即为色谱基线矢量；所述阈值为3～10；

II)将信号矩阵中所有的色谱基线矢量取平均，即得该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量；

III)将量测信号矩阵中每个m/z指标对应的色谱矢量减去该样本量测信号矩阵的色谱基线矢量，即得消除色谱基线漂移的量测信号矩阵。

9.根据权利要求7所述的应用代谢组学技术药效评价与预测的方法，其特征在于，所述消除外源性代谢物信号处理的方法选自以下两种方法中的任意一种：

方法一、基于质谱信号正交投影获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将空白对照组的所有空白样本量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵；

III)按Rt由小到大的顺序，在空白对照组平均量测信号矩阵和给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，计算相同Rt处的两个归一化质谱矢量的相关系数；当相关系数低于阈值时，计算下一个Rt对应的归一化质谱矢量的相关系数；当该相关系数高于阈值时，以空白对照组平均量测信号矩阵中该Rt处的归一化质谱矢量构建正交投影矩阵，以此分别向空白对照组平均量测信号矩阵和该给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵投影，分别得它们相应的残差矩阵；所述阈值取0.5～0.9999之间的一个数值，其值的大小对结果没有明显影响；

IV)以残差矩阵分别代替相应的量测信号矩阵，在下一个保留时间Rt处按上述步骤III)计算相应的新的残差矩阵；

V)在上述步骤III)和IV)项间循环，直至量测信号矩阵中的所有Rt，最终得该给药样本量测信号矩阵的残差矩阵，它为该给药样本量测信号矩阵中所包含的外源性代谢物信号，即给药样本的外源性代谢物信号矩阵；

VI)给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵减去给药样本的外源性代谢物信号矩阵，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵；

方法二、基于总浓度质谱获取给药样本中内源性代谢物信号的方法，在代谢组学中所设定的空白对照组和给药组，将获得代谢组学所依赖的生物样本，通过液相色谱-质谱、气相色谱-质谱、毛细管电泳-质谱中的一种方法检测获取样本量测信号矩阵，对于该类信号矩阵按如下方法和步骤获取给药样本中内源性代谢物信号矩阵：

I)对于空白样本和给药样本的量测信号矩阵，按上述方法消除色谱基线漂移，获得每个样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵；

II)将所有空白样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得空白对照组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了空白对照组的总浓度质谱矢量；

III)将同一给药组的所有给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵取平均，得给药组平均量测信号矩阵，将相同m/z处的不同浓度的质谱信号进行加和，即构建了给药组的总浓度质谱矢量；

IV)以空白对照组的总浓度质谱矢量为标准，比较给药组的总浓度质谱矢量，多出现的碎片离子信号则来源于外源性代谢物，从而确定外源性代谢物碎片离子，即外源性代谢物的m/z指标；

V)在给药组的每个给药样本的消除色谱基线漂移的量测信号矩阵中，消除步骤IV)所确定的m/z指标对应的外源性代谢物信号，即得给药样本的内源性代谢物信号矩阵。

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