CN110646601A - 一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，首先通过由重金属对PC12细胞暴露，提取细胞内脂质代谢产物，利用色谱质谱联用技术对脂质代谢产物进行检测分析，通过与对照组细胞的代谢物进行比较，根据代谢物变化显著性差异评价重金属对细胞产生的毒性作用机制，构建一种评估细胞受重金属暴露后脂代谢通路变化的方法；其中所述重金属为镉离子或砷离子。本发明能有效的分析重金属对细胞脂质代谢途径的影响，具有简单，快速，获得信息全面等优点。
Description
技术领域
本发明属于水产品中重金属毒性评价领域，具体涉及一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，是一种基于质谱的检测方法，通过水产品中重金属对细胞脂质代谢通路的影响水平来评估其细胞毒性。
背景技术
随着工业的发展，重金属通过多种方式进入海洋水产品中，使得多种水产品遭受重金属的污染。由于水产品的生物富集作用，各种重金属可以在其体内富集很高的浓度。最后高浓度的砷会随着食物链传递进入人体，然后通过各种过程转化为具有不同毒性的存在形态，影响人体的代谢过程，严重威胁着人类的生命。
目前针对重金属暴露对脂质代谢影响评定的方法还存在一定的问题，例如检测所需时间长、所需要的成本比较高、检测需要较高的技术手段与专业知识支撑，因此检测技术对于大众难以实现。本发明采用代谢组学技术对生物样本受到外界环境刺激以后其体内多种脂质代谢产物变化进行研究，其能够将生物体受到外界刺激后内部脂质代谢物的变化加以放大，来表征重金属的毒性机制。在此过程中借助于液相色谱与质谱联用技术，所需要的要求较低，操作简便、检测快速，弥补了上述所存在的问题。另外，生物体内含有多种脂质代谢产物，当其受到外界环境压力以后，会有多种脂质代谢产物随之发生变化，因此借助代谢组学与液相色谱质谱联用技术可以采集到更多的数据信息，从而可以实现对生物样本中脂质代谢产物的全景式分析。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、PC12细胞接种于细胞培养板中进行培养，培养时间为24～36小时；待细胞铺满孔板底部面积的75％～85％，用重金属对细胞进行暴露，20～26小时后收取细胞样品；
S2、上述细胞样品提取胞内脂质代谢产物；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量分析；对细胞内提取的脂质代谢产物信息进行单维统计分析与多维统计分析(包括偏最小二乘、热图等)。
优选方式下，所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将PC 12细胞接种于细胞培养板中进行培养，接种密度为1.0×105～1.5×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，37℃，5％CO2培养24～36h；待细胞铺满孔板底部面积的75％～85％；遗弃原培养基，重金属暴露组每孔加入含重金属离子浓度6μM～24μM的培养基2ml，对照组加入2ml纯培养基，置于37℃，5％CO2培养20～26h，每组设置4～8个平行；
其中，所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，加体积分数为1％青链霉素双抗；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对重金属暴露组与对照组提取脂质代谢产物，步骤如下：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1～2ml的PBS洗涤并移弃，然后加入2～3ml液氮；液氮挥发后每孔加入1～2ml PBS，用移液枪混匀后对细胞进行超声破碎，即在功率680～720W的冰水浴中超声4～6分钟得破碎悬液，吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度0.8～1.2Pa，冷阱温度-48～-52，样品温度-18～-22℃下冷冻干燥46～50小时，冻干后每个离心管加入10～20μL内标混合液涡旋混匀；再向所述离心管加入甲醇1-2mL，然后加入2～4ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取10～15min，再加入600～900μl水，涡旋1～2min形成两相体系，在4～8℃静置平衡10min-15min，4～8℃、转速为10000～13000g离心10～20min，取上清氮气吹干，最后用200～300μl的复溶液进行复溶，得脂质代谢产物待测试样；其中，所述内标混合液中各物质为：1～2mg/ml PC(磷脂酰胆碱)、0.5～1mg/ml PE(磷脂酰乙醇胺)、1～2mg/ml TAG(甘油三酯)、0.5～1mg/ml PG(磷脂酰甘油)、0.01～1mg/ml PI(磷脂酰肌醇)，溶剂为甲基叔丁基醚；所述复溶液由含有4～8mM乙酸铵的乙腈、异丙醇和水按体积比60～70:20～30:5～10混合而成；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量；脂质代谢产物的定量分析中，非极性组分脂质分离所用的色谱柱为Acquity UPLC BEH C8色谱柱，色谱柱直径为2.1mm、柱长为100mm、粒径为1.7μm，流动相A为含有10～15mM乙酸铵的乙腈和水按体积比50:50～60:40混匀所得溶液，流动相B为含10～15mM乙酸铵的异丙醇和乙腈按体积比70:30～90:10混匀所得溶液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数60％～70％，流动相B体积分数30％～40％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到80％～90％，流动相A的体积分数线性降低至20％～10％；15.5～15.6min流动相B的体积分数线性增加到90％～98％，流动相A的体积分数为10％～2％维持2.4min；18～18.1min流动相B的体积分数回到30％～40％，流动相A的体积分数为60％～70％，维持1.9min平衡柱，整个过程中流动相的流速始终为0.26ml/min，所述脂质代谢产物待测试样的进样量为2～3μl；
质谱扫描采用的离子源为ESI，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成。数据采集过程中MRM扫描模式质谱参数设置如下：正离子模式下离子喷雾电压为4～5.5kV，温度400～550℃，GAS 1和2流速均是50-65，负离子模式下离子喷雾电压为-4.5～-5.5kV，加热温度为400～550℃，GAS1和2流速设置为40～60，在两种模式下碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35～45；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物进行单维统计分析(显著性分析)，由此得出重金属暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行多维统计分析，包括主成分分析、偏最小二乘、热图，得到对照组、重金属暴露组是否出现了组别显著的区分聚类；最后对检测出的差异代谢物进行了通路分析，借助KEGG数据库以及metaboanalyst来对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
优选方式下，所述重金属离子为镉离子或砷离子。
优选方式下，所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞接种于六孔板中进行培养，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，待细胞铺满孔板底部面积的80％左右；用砷、砷与金属硫蛋白复合物对细胞进行暴露，即移弃所所述六孔板中的原培养液，砷暴露组每孔加入以培养基稀释的6μM As2O32ml，金属硫蛋白联合暴露组每孔加入金属硫蛋白混合液2ml；对照组为纯培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，每组平行样品个数为6个；
其中，所述金属硫蛋白混合液含6μM As2O3、15μM金属硫蛋白，余量为培养基；所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基，所述DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对砷暴露组、金属硫蛋白联合暴露组与对照组提取脂质代谢产物：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃；然后加入液氮3ml；液氮挥发后每孔加入1ml PBS，混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃下冷冻干燥48小时，向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀；再加入甲醇1mL，甲基叔丁基醚3.3ml涡旋震荡15min，加入830μl H2O涡旋震荡1min，形成两相体系，在4℃静置15min，4℃、转速10000g、离心10min；然后取上清氮气吹干，用200μl混合液复溶，得脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中，PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml，PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后从对照组、砷组以及砷与金属硫蛋白联合暴露组的每个样品中分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述超高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合溶液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数为68％，流动相B体积分数为32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6min流动相B体积分数增加到97％、流动相A体积分数降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速始终为0.26ml/min，每次检测所述脂质代谢产物待测试样的进样量为2μl；质谱扫描采用ESI源，Schedule MRM模式，整个分析过程20min内完成；
数据采集过程中采用的离子源为ESI，MRM扫描模式为正离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35，采用的流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，得出砷暴露组与砷和金属硫蛋白联合暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，然后对显著性分析出的差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、砷组与砷和金属硫蛋白联合暴露组三个组别间是否出现了组别显著的区分聚类；最后用KEGG数据库以及metaboanalyst对检测出的差异代谢物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
优选方式下，所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时；待细胞铺满孔板底部面积的80％左右，用镉对细胞进行暴露，即移弃原培养液，镉暴露组每孔加入培养基稀释的浓度24μM的氯化镉溶液2ml，对照组为纯培养基培养即加入培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时每组平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，加体积分数1％青链霉素双抗。
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对镉暴露组、对照组提取脂质代谢产物：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃，然后加入液氮3ml；液氮挥发后每孔加入1mlPBS混匀进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃、冷冻干燥48小时，向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀，加入甲醇1mL和3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，再加入830μl水涡旋1min形成两相体系，在4℃静置15min，4℃、10000g离心10min，然后取上清氮气吹干，最后用200μl混合液复溶，得脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml，PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，余量为甲基叔丁基醚；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后对镉暴露组、对照组中的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的重复性与稳定性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述超高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数68％，流动相B体积分数32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6流动相B增加到体积分数97％、流动相A降低到体积分数3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时一针进样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为ScheduleMRM，整个分析过程20min内完成；
数据采集过程中采用的离子源为ESI,MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35；流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，得出镉暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、镉暴露组间是否出现了组别显著的区分聚；借助KEGG数据库以及metaboanalyst对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
优选方式下，所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时；待细胞铺满孔板底部面积的80％左右，用砷对细胞进行暴露，即移弃原培养液，砷暴露组每孔加入用培养基稀释的24μM As2O3溶液2ml，对照组为纯培养基培养即加入培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，每组平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，加体积分数1％青链霉素双抗；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对砷暴露组、与对照组提取脂质代谢产物：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃，然后加入液氮3ml，液氮挥发后每孔加入1ml PBS混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃冷冻干燥48小时，向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀，每管加入甲醇1mL和3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，每个离心管加入830μl水涡旋1min，在4℃静置15min，4℃、转速为10000g离心10min，取上清氮气吹干，用200μl混合液复溶，得脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml，PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚)；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后对照组、砷暴露组的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，柱径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数68％，流动相B体积分数32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6流动相B体积分数增加到97％、流动相A体积分数降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时一针进样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成。
数据采集过程中采用的离子源为ESI,MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35，流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，在显著性0.05的水平下，得出砷暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、砷暴露组间是否出现了组别显著的区分聚；借助KEGG数据库以及metaboanalyst对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
本发明的有益效果是：
(1)本发明通过重金属暴露细胞后，以脂质代谢作为评价指标，获得的信息直观全面；
(2)本发明具有灵敏度高、针对性强并且获得的信息量全面等优点。本发明利用代谢组学技术，通过利用重金属对PC 12细胞进行暴露以后，对胞内所有脂质代谢产物进行定量分析，来找寻由于重金属的毒性导致的脂质差异代谢物。
本发明以PC12细胞为模型，建立了一种细胞受重金属暴露后脂质代谢受到影响的评估方法。该方法利用重金属暴露后的差异代谢产物来寻找相关受影响的代谢通路，全面直观地分析了重金属暴露对细胞脂质代谢的影响，因此对于水产品中重金属的细胞毒性评估是一种有效的手段。
附图说明
图1为本发明实施例3细胞内代谢产物的主成分分析，CON代表对照组，EXP代表实验组，QC代表质控；
图2为本发明实施例3细胞内代谢产物的偏最小二乘分析，CON代表对照组，EXP代表实验组；
图3为本发明实施例的技术流程图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所采用的技术方案如下：
(a)细胞接种于六孔板中进行培养，培养时间为24-36小时；
(b)待细胞铺满孔板底部面积的75％-85％，用重金属对细胞进行暴露，20-26小时后收取细胞样品；
(c)上述细胞样品提取胞内脂质代谢产物，利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量分析；
步骤(c)中提取脂质代谢产物的过程如下所述：移弃六孔板中的原培养液，每孔加入1-2ml的PBS快速洗涤并移弃去除其中的死细胞；加入液氮淬灭终止细胞的代谢活动，液氮用量为2-3ml；液氮完全挥发后每孔加入1-2ml PBS对细胞超声破碎(4-5min)，得到破碎悬液，吸取每孔内的破碎悬液分别置于单独的离心管，于-30℃--40℃冷冻干燥；
冻干后每个离心管加入10-20μL内标混合液涡旋混匀，内标中PC(磷脂酰胆碱)浓度为1-2mg/ml,PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.5-1mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1-2mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.5-1mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.01-1mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚。代谢物的提取溶剂为甲醇/甲基叔丁基醚/水的混合溶液，每管加入甲醇1-2mL,然后加入2-4ml甲基叔丁基醚涡旋提取10-15min，每个离心管加入600-900μl水涡旋1-2min形成两相体系，在4-8℃平衡10min-15min，高速离心，即4-8℃下离心10-20min，转速为10000-13000g，然后取上清氮气吹干。最后用含有4-8mM乙酸铵的乙腈/异丙醇/水(60-70/20-30/5-10，v/v/v)复溶直接用于上机分析。
脂质代谢产物的定量分析中，非极性组分脂质分离所用的色谱柱为C8反相色谱柱，流动相A为10-15mM乙酸铵的乙腈/水(50：50-60：40，v/v)，流动相B为含10-15mM乙酸铵的异丙醇/乙腈(70：30-90：10，v/v)；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数(括号内为流动相的优选比例))：0-1.5min，流动相A 60-70％(68％)，流动相B 40-30％(32％)；1.5-15.5min时流动相B线性增加到80-90％(85％)；15.5-15.6流动相B增加到90-98％(97％)，维持2.4min；18-18.1min流动相B回到30-40％(32％)，维持1.9min平衡柱，整个过程中流动相的流速始终为0.26ml/min，进样量为2-3μl；
质谱扫描采用的离子源为ESI，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成。数据采集过程中MRM扫描模式质谱参数设置如下：正离子模式下离子喷雾电压为4-5.5kV，温度400-550℃，GAS 1和2流速均是50-65，负离子模式下离子喷雾电压为-4.5--5.5kV，加热温度为400-550℃，GAS1和2流速设置为40-60，在两种模式下碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35-45。
利用高相液相色谱-质谱采集的脂质代谢物数据，经过步骤(c)得到了细胞内与脂质代谢相关的代谢产物的变化，通过对这些生物学指标的研究发现经过重金属的暴露以后，细胞的代谢活动发生改变，尤其是脂质代谢发生紊乱。接下来采用路径分析系统对细胞内检测出的差异代谢物进行追踪分析，实验组与对照组相比较，计算出重金属处理组对细胞模型具有显著性影响的代谢路径并对影响的程度做分析；路径分析系统计算出的与对照组显著差异的代谢路径即限定为重金属影响的主要代谢路径。
优选方式下，所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，包括步骤：
S1、PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1×105个/ml，放置于37℃，5％的CO2的培养箱中进行培养，培养时间为24小时；待细胞铺满孔板底部面积的80％左右，用重金属进行暴露，暴露时间为24小时，24小时以后收取细胞样品；
S2、提取上述细胞中的脂质代谢物，提取溶剂采用甲醇/甲基叔丁基醚/水进行提取；
S3、对于提取的脂质代谢产物先用异丙醇/甲基叔丁基醚/水(65：30：5，v/v/v)的溶剂进行复溶后。采用高效液相色谱串联质谱进行检测。检测过程中采用梯度洗脱进行检测。
实施例1：砷对细胞脂质代谢通路的影响
本发明利用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞(中国科学院细胞库，TCR 9)为实验模型，首先对细胞进行培养与暴露，步骤如下：
(a)PC 12细胞接种于六孔板中进行培养，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)，待细胞铺满孔板底部面积的80％左右；用砷、砷与金属硫蛋白对细胞进行暴露，即移弃六孔板中的原培养液，砷组每孔加入以培养基稀释的6μM As2O3溶液2ml，砷与金属硫蛋白联合暴露组每孔加入金属硫蛋白与6μM As2O3的混合液2ml；对照组为纯培养基培养即加入培养基2ml，24小时(37℃，5％CO2)后收取细胞样品，平行样品个数为6个；
其中，所述金属硫蛋白与As2O3的混合液含6μM As2O3、15μM金属硫蛋白，余量为培养基；所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)，所述DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为9:1，加体积分数1％青链霉素双抗。
(b)细胞内脂质代谢物的提取与分析
24小时暴露后，进行细胞中脂质代谢物的提取，对照组、砷组与砷和金属硫蛋白联合暴露组采取同样的提取步骤，步骤如下：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1ml的PBS快速洗涤并移弃去除死细胞；然后加入液氮淬灭终止细胞的代谢活动，液氮用量为3ml；液氮完全挥发后每孔加入1ml PBS，混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液。吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度1Pa，冷阱温度-50，样品温度-20℃下冷冻干燥48小时，冻干后每个离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀(所述内标混合液中，PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml,PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚)；
接下来进行脂质的提取，对照组、砷组以及砷和金属硫蛋白联合暴露组的每个样品中加入甲醇1mL，然后加入3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡15min，每个离心管加入830μlH2O涡旋震荡1min，形成两相体系，在4℃静置15min，高速离心，即4℃下离心10min，转速为10000g；然后取上清氮气吹干，用200μl混合液复溶；所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；然后从对照组、砷组以及砷与金属硫蛋白联合暴露组的每个样品中分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求。最后对所述脂质进行超高相液相色谱-质谱分析；
所述超高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，色谱柱直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合溶液；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数，流动相总流速)：0～1.5min，流动相A 68％，流动相B 32％；1.5～15.5min时流动相B线性增加到85％、流动相A降低到15％；15.5～15.6min流动相B增加到97％、流动相A降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B回到32％、流动相A回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速始终为0.26ml/min，每次检测进样量为2μl；质谱扫描采用ESI源，Schedule MRM模式，整个分析过程20min内完成。
(c)数据采集过程中采用的离子源为ESI，MRM扫描模式为正离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35，采用的流动相与色谱参数设置如上所述。
接下来利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物检测出的峰面积进行单维统计分析(显著性分析)，由此得出砷暴露组与砷和金属硫蛋白联合暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，然后接下来对上述检出的差异化合物进行多维统计分析(主成分分析、偏最小二乘、热图)，得到对照组、砷组与砷和金属硫蛋白联合暴露组三个组别间是否出现了组别显著的区分聚类。最后为了进一步探索砷对细胞的毒性机制，对检测出的差异代谢物进行了通路分析，借助KEGG数据库以及metaboanalyst来对上述检出的差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
实施例2：镉对细胞脂质代谢通路的影响
本发明利用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞(中国科学院细胞库，TCR 9)为实验模型，首先对细胞进行培养与暴露，步骤如下：
(a)PC12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)；待细胞铺满孔板底部面积的80％左右，用铬对细胞进行暴露，即移弃原培养液，镉暴露组每孔加入氯化镉(主要以镉离子形式存在)即培养基稀释的浓度24μM的氯化镉溶液2ml，对照组为纯培养基培养，即加入培养基2ml，培养时间为24小时(37℃，5％CO2)，24小时后收取细胞样品，平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为9:1，加体积分数1％青链霉素双抗。
(b)细胞内脂质代谢物的提取与分析
24小时暴露后，对照组、镉暴露组采取同样的方法进行脂质组分的提取。步骤如下：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS快速洗涤并移弃去除死细胞。然后加入液氮淬灭终止细胞的代谢活动，液氮用量为3ml；液氮完全挥发后每孔加入1ml PBS混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液。吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度1Pa，冷阱温度-50，样品温度-20℃下冷冻干燥48小时。冻干后每个离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀(所述内标混合液中PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml,PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚)；
接下来进行脂质的提取，每管加入甲醇1mL,然后加入3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，每个离心管加入830μl水涡旋1min形成两相体系。在4℃静置15min，高速离心，即4℃下离心10min，转速为10000g，然后取上清氮气吹干，最后用200μl混合液复溶；所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；然后对镉暴露组、对照组中的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求。最后对所述脂质进行高相液相色谱-质谱分析。
所述高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，色谱柱柱径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数，流动相总流速)：0～1.5min，流动相A68％，流动相B 32％；1.5～15.5min时流动相B线性增加到85％、流动相A降低到15％；15.5～15.6流动相B增加到97％、流动相A降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B回到32％、流动相A回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时一针进样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成。
(c)数据采集过程中采用的离子源为ESI,MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35。流动相与色谱参数设置如上所述。
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物的峰面积进行单维统计分析(显著性分析)，由此得出镉暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，然后接下来对上述检出的差异化合物进行多维统计分析(主成分分析、偏最小二乘、热图)，得到对照组、镉暴露组间是否出现了组别显著的区分聚类。最后为了进一步探索镉对细胞的毒性机制，对检测出的差异代谢物进行了通路分析，借助KEGG数据库以及metaboanalyst来对上述检出的差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
实施例3：砷对细胞脂质代谢通路的影响
本发明利用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞(中国科学院细胞库，TCR 9)为实验模型，首先对细胞进行培养与暴露，步骤如下：
(a)PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，在培养箱培养24小时(37℃，5％CO2)。待细胞铺满孔板底部面积的80％左右，用砷对细胞进行暴露，即移弃原培养液，实验组砷组每孔加入以As2O3为基质的三价砷标准液，即加入用培养基稀释的6μM As2O3溶液2ml，对照组为纯培养基培养即加入培养基2ml，培养时间为24小时(37℃，5％CO2)，24小时后收取细胞样品，平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清(四季青)、青链霉素双抗(Hycone)的DMEM高糖培养基(Gibco)；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，加体积分数1％青链霉素双抗。
(b)细胞内脂质代谢物的提取与分析
24小时暴露后，对照组、砷组采取同样的方法进行脂质组分的提取，步骤如下：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS快速洗涤并移弃去除死细胞。然后加入液氮淬灭终止细胞的代谢活动，液氮用量为3ml；液氮完全挥发后每孔加入1ml PBS混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟(每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内)，得到破碎悬液。吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度1Pa，冷阱温度-50，样品温度-20℃下冷冻干燥48小时。冻干后每个离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀(所述内标混合液中PC(磷脂酰胆碱)浓度为1mg/ml,PE(磷脂酰乙醇胺)浓度为0.49mg/ml，TAG(甘油三酯)浓度为1mg/ml，PG(磷脂酰甘油)浓度为0.53mg/ml，PI(磷脂酰肌醇)浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚)；
接下来进行脂质的提取，每管加入甲醇1mL，然后加入3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，每个离心管加入830μl水涡旋1min形成两相体系。在4℃静置15min，高速离心，即4℃下离心10min，转速为10000g，然后取上清氮气吹干，最后用200μl混合液复溶；所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；然后对照组、砷组的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求。最后对所述脂质进行高相液相色谱-质谱分析。
所述高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，色谱柱柱径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为(时间，流动相的体积百分数，流动相总流速)：0～1.5min，流动相A 68％，流动相B 32％；1.5～15.5min时流动相B线性增加到85％、流动相A降低到15％；15.5～15.6流动相B增加到97％、流动相A降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B回到32％、流动相A回到68％，维持1.9min平衡柱，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时一针进样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为ScheduleMRM，整个分析过程20min内完成。
(c)数据采集过程中采用的离子源为ESI,MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35。流动相与色谱参数设置如上所述。
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools(JRE1.6)对细胞内提取的脂质代谢产物的峰面积进行单维统计分析(显著性分析)，由此得出砷暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，然后接下来对上述检出的差异化合物进行多维统计分析(主成分分析、偏最小二乘、热图)，得到对照组、砷组两个组别间、出现了显著的区分聚类。(结果见图1和图2)
本发明以细胞内脂质代谢产物为评价指标，借助代谢组学方法考察了重金属暴露对细胞脂质代谢的影响，检测指标比较灵敏，获得的信息直观全面，能够真实反映重金属暴露后和脂代谢相关通路的改变。本发明以PC12细胞为模型来研究重金属的毒性作用，用于探索重金属的毒性作用机制具有一定的指导的意义。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将PC12细胞接种于细胞培养板中进行培养，接种密度为1.0×105～1.5×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，37℃，5％CO2培养24～36h；待细胞铺满孔板底部面积的75％～85％；遗弃原培养基，重金属暴露组每孔加入含重金属离子浓度6μM～24μM的培养基2ml，对照组加入2ml纯培养基，置于37℃，5％CO2培养20～26h，每组设置4～8个平行；
其中，所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基；其中所述DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对重金属暴露组与对照组提取脂质代谢产物，步骤如下：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1～2ml的PBS洗涤并移弃，然后加入2～3ml液氮；液氮挥发后每孔加入1～2ml PBS，混匀后对细胞进行超声破碎，在功率680～720W的冰水浴中超声4～6分钟得破碎悬液，吸取每孔内的破碎悬液分别置于不同的对应离心管，于真空度0.8～1.2Pa，冷阱温度-48～-52，样品温度-18～-22℃冷冻干燥46～50小时，冻干后每个离心管加入10～20μL内标混合液涡旋混匀；再向所述离心管加入甲醇1～2ml，然后加入2～4ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取10～15min，再加入600～900μl水，涡旋1～2min形成两相体系，在4～8℃静置平衡10min～15min，4～8℃、转速为10000～13000g离心10～20min，取上清氮气吹干，最后用200～300μl的复溶液进行复溶，得脂质代谢产物待测试样；其中，所述内标混合液中各物质为：1～2mg/ml磷脂酰胆碱、0.5～1mg/ml磷脂酰乙醇胺、1～2mg/ml甘油三酯、0.5～1mg/ml磷脂酰甘油、0.01～1mg/ml磷脂酰肌醇，溶剂为甲基叔丁基醚；所述复溶液由含有4～8mM乙酸铵的乙腈、异丙醇和水按体积比60～70:20～30:5～10混合而成；
S3、利用基于超高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量分析；脂质代谢产物的定量分析中，非极性组分脂质分离所用的色谱柱为Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含有10～15mM乙酸铵的乙腈和水按体积比50:50～60:40混匀所得溶液，流动相B为含10～15mM乙酸铵的异丙醇和乙腈按体积比70:30～90:10混匀所得溶液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数60％～70％，流动相B体积分数30％～40％；
1.5～15.5min流动相B体积分数线性增加到80％～90％，流动相A的体积分数线性降低至20％～10％；15.5～15.6min流动相B的体积分数线性增加到90％～98％，流动相A的体积分数为10％～2％，维持2.4min；18～18.1min流动相B的体积分数回到30％～40％，流动相A的体积分数为60％～70％，维持1.9min，整个过程中流动相的流速始终为0.26ml/min，所述脂质代谢产物待测试样的进样量为2～3μl；
质谱扫描采用的离子源为ESI，扫描模式为Schedule MRM，整个分析过程20min内完成；数据采集过程中MRM扫描模式质谱参数设置如下：正离子模式下离子喷雾电压为4～5.5kV，温度400～550℃，GAS 1和2流速均是50～65，负离子模式下离子喷雾电压为-4.5～-5.5kV，加热温度为400～550℃，GAS 1和2流速设置为40～60，在两种模式下碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35～45；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools JRE1.6对步骤S2所得结果进行显著性分析，得出重金属暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行多维统计分析，包括主成分分析、偏最小二乘、热图，得到对照组、重金属暴露组是否出现了组别显著的区分聚类；最后借助KEGG数据库以及metaboanalyst来对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
2.根据权利要求1所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，所述步骤S1所述重金属离子为镉离子或砷离子。
3.根据权利要求1所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，待细胞铺满孔板底部面积的80％，移弃所述六孔板中的原培养基，砷暴露组每孔加入以培养基稀释的6μM As2O3 2ml，金属硫蛋白与砷联合暴露组每孔加入含金属硫蛋白的混合液2ml；对照组为培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，每组平行样品个数为6个；
其中，所述金属硫蛋白混合液含6μM As2O3、15μM金属硫蛋白，余量为培养基；所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基，所述DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对砷暴露组、金属硫蛋白联合暴露组与对照组提取脂质代谢产物：移弃含有暴露样品的培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃；然后加入液氮3ml；液氮挥发后每孔加入1mlPBS，混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟，每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃冷冻干燥48小时，向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀，再加入甲醇1mL，甲基叔丁基醚3.3ml涡旋震荡15min，加入830μl H2O涡旋震荡1min，4℃静置15min，4℃、转速10000g、离心10min，取上清氮气吹干，用200μl混合液复溶，作为脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中，磷脂酰胆碱浓度为1mg/ml，磷脂酰乙醇胺浓度为0.49mg/ml，甘油三酯浓度为1mg/ml，磷脂酰甘油浓度为0.53mg/ml，磷脂酰肌醇浓度为0.02mg/ml，余量为甲基叔丁基醚；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后从对照组、砷组以及砷与金属硫蛋白联合暴露组的每个样品中分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；
S3、利用基于超高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述超高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合溶液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数为68％，流动相B体积分数为32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6min流动相B体积分数增加到97％、流动相A体积分数降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min，整个分析过程中总流速始终为0.26ml/min，每次检测所述脂质代谢产物待测试样的进样量为2μl；质谱扫描采用ESI源，Schedule MRM模式，整个分析过程20min内完成；
数据采集过程中采用的离子源为ESI，MRM扫描模式为正离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35，采用的流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools JRE1.6对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，得出砷暴露组与砷和金属硫蛋白联合暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，然后对显著性分析出的差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、砷组与砷和金属硫蛋白联合暴露组三个组别间是否出现了组别显著的区分聚类；最后用KEGG数据库以及metaboanalyst对检测出的差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
4.根据权利要求1所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时；待细胞铺满孔板底部面积的80％，移弃原培养基，镉暴露组每孔加入培养基稀释的浓度24μM的氯化镉溶液2ml，对照组为纯培养基培养即加入培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，每组平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对镉暴露组、对照组提取脂质代谢产物：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃，然后加入液氮3ml；液氮挥发后每孔加入1mlPBS混匀进行超声破碎，在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟，每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃、冷冻干燥48小时；向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀，加入甲醇1mL和3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，再加入830μl水涡旋1min，在4℃静置15min，4℃、10000g离心10min，然后取上清氮气吹干，最后用200μl混合液复溶，得脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中磷脂酰胆碱浓度为1mg/ml，磷脂酰乙醇胺浓度为0.49mg/ml，甘油三酯浓度为1mg/ml，磷脂酰甘油浓度为0.53mg/ml，磷脂酰肌醇浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后对镉暴露组、对照组中的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中，并混合均匀看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测所建序列的重复性与稳定性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数68％，流动相B体积分数32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6流动相B增加到体积分数97％、流动相A降低到体积分数3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时进样脂质代谢产物待测试样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为ScheduleMRM，整个分析过程20min内完成；
数据采集过程中采用的离子源为ESI,MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS 1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35；流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB toolsn JRE1.6对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，得出镉暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、镉暴露组间是否出现了组别显著的区分聚；借助KEGG数据库以及metabo-analyst对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
5.根据权利要求1所述重金属暴露对细胞脂质代谢影响的检测方法，其特征在于，包括步骤：
S1、使用重金属对细胞进行暴露：将大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC 12细胞接种于六孔板中，接种密度为1.0×105个/ml，每孔培养基体积为2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时；待细胞铺满孔板底部面积的80％，移弃原培养液，砷暴露组每孔加入用培养基稀释的24μM As2O3溶液2ml，对照组加入培养基2ml，置于37℃、5％CO2培养24小时，每组平行样品个数为6个；
其中，所述培养基为：含胎牛血清、青链霉素双抗的DMEM高糖培养基；其中DMEM高糖培养基和胎牛血清体积比为为9:1，所述培养基中青链霉素双抗的体积分数为1％；
S2、提取脂质代谢产物：分别按下述方法对砷暴露组与对照组提取脂质代谢产物：移弃培养基，每孔加入1ml的PBS洗涤并移弃，然后加入液氮3ml，液氮挥发后每孔加入1mlPBS混匀后进行超声破碎，即在功率720W的冰水浴中超声破碎5分钟，每超声2s停止2s，所述停止2s的时间不包含在超声时长范围内，得到破碎悬液；吸取每孔内的破碎悬液分别置于离心管，于真空度1Pa、冷阱温度-50、样品温度-20℃冷冻干燥48小时，向所述离心管加入10μL内标混合液涡旋混匀，再加入甲醇1mL和3.3ml甲基叔丁基醚涡旋震荡提取15min，加入830μl水涡旋1min，在4℃静置15min，4℃、转速为10000g离心10min，取上清氮气吹干，用200μl混合液复溶，得脂质代谢产物待测试样；
其中，所述内标混合液中磷脂酰胆碱浓度为1mg/ml，磷脂酰乙醇胺浓度为0.49mg/ml，甘油三酯浓度为1mg/ml，磷脂酰甘油浓度为0.53mg/ml，磷脂酰肌醇浓度为0.02mg/ml，溶剂为甲基叔丁基醚；
所述混合液为含有5mM乙酸铵的乙腈溶液、异丙醇和水按体积比65:30:5混合而成；
然后对照组、砷组的每个样品分别取10μl于一个进样瓶中并混合均匀作为质控样本，看质控样本在主成分分析模型原点的聚合程度来检测分析序列的稳定性与重复性，若建立的模型中质控样本在原点聚合的越紧密，重叠性越好，分析序列具有较好的稳定性和重复性，满足定量分析的要求；
S3、利用基于高相液相色谱-质谱对脂质代谢产物进行定量，所述高相液相色谱-质谱分析具体为：分离色谱柱采用Acquity UPLC BEH C8色谱柱，直径2.1mm、柱长100mm、粒径1.7μm，流动相A为含10mM乙酸铵的乙腈溶液和水按体积比60:40组成的混合液，流动相B为含10mM乙酸铵的异丙醇溶液和乙腈按体积比90:10组成的混合液；流动相梯度为：0～1.5min，流动相A体积分数68％，流动相B体积分数32％；1.5～15.5min时流动相B体积分数线性增加到85％、流动相A体积分数降低到15％；15.5～15.6流动相B体积分数增加到97％、流动相A体积分数降低到3％，维持2.4min；18～18.1min流动相B体积分数回到32％、流动相A体积分数回到68％，维持1.9min，整个分析过程中总流速为0.26ml/min，检测时脂质代谢产物待测试样进样为2μl；质谱扫描采用ESI源，负离子模式下检测，扫描模式为ScheduleMRM，整个分析过程20min内完成；
数据采集过程中采用的离子源为ESI，MRM扫描模式为负离子扫描，扫描模式下质谱参数设置如下：离子喷雾电压-5.5kV，温度500℃，GAS1和2流速均为50，碰撞气与气帘气分别设置为“高”与35，流动相与色谱参数设置如上所述；
利用R x64 3.5.3、meteboanalyst以及TB tools JRE1.6对细胞内提取的脂质代谢产物进行显著性分析，在显著性0.05的水平下，得出砷暴露组与对照组相比发生显著变化的差异化合物，对所述差异化合物进行主成分分析、偏最小二乘、热图分析，得到对照组、砷暴露组间是否出现了组别显著的区分聚；借助KEGG数据库以及metaboanalyst对所述差异化合物进行通路分析，找出受影响的通路途径。
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