CN108918710B - 一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法 - Google Patents

Abstract

本申请属于烟草代谢组学技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法专利申请事宜。该方法可对新鲜烟叶中的SA、IAA、IBA、JA、ABA、GA、BR中一种或任意几种组合同时进行检测，该方法包括：对预处理后新鲜烟叶进行萃取，制备待检液，液相色谱‑串联质谱检测分析等操作。本申请采用LC‑MS/MS法进行检测时，灵敏度较高，且可单独测一种、或者同时测几种、甚至同时对7种内源性植物激素进行定性或定量测定。再者，由于正负离子选择性检测模式选择性好、干扰小、效率高，尤其是检测一个样本的时间仅10 min，因此本发明能有效地提高分析效率，非常适合复杂基质中低含量目标物的分析。

Description

一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法

技术领域

本申请属于烟草代谢组学技术领域，具体涉及一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法专利申请事宜。

背景技术

植物内源性激素能够相互协调地调控植物的生长发育与分化，是植物生长的关键性因素之一。植物内源性激素在植物体内含量很低，通常在鲜重0.1～50 μg/kg 的范围内，但对植物生长的影响又具有重要影响。因此准确检测判定植物激素在植物内的浓度变化以及组织特异性分布，是了解内源性激素代谢途径、运输过程以及如何调控植物生长的重要前提。也因此，对于植物内源性激素的定量与定性一直是植物激素研究领域的重点。

现有技术中，对于植物内源激素的测定方法主要有气相色谱-质谱联用法(GC/MS)和高效液相色谱法( HPLC)及液相色谱-串联质谱法等。其中液质联用可实现优势互补，其样品处理简单、灵敏度高，适用于复杂基质样品的分析，能够得到丰富的信息，定性定量结果可靠，且快速简便、高自动化、回收率高。因此液质联用技术已经发展为样品中激素检测的主流方法。

烟叶既是一种经济作物，也是植物学研究中的模式植物之一。因此，对于烟叶中内源性植物激素进行较为精确的定量检测，无论对于烟叶生理研究、烟草培育，还是对于植物学研究都具有十分重要的意义。但另一方面，植物内源性激素中通常存在不止一种激素，因此，就植物内源性激素检测而言，如果能够对于多种内源性激素同时进行检测评价，对于研究植物激素分布规律、协调作用过程具有十分重要的意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种针对新鲜烟叶的烟叶中内源性植物激素的检测方法，该方法可对新鲜烟叶中的水杨酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素甾醇（BR）中一种或几种同时进行检测鉴定，从而可为相关植物生理学研究、基因组功能组学等进一步深入研究奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，该方法可对新鲜烟叶中的水杨酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素甾醇（BR）中一种或任意几种组合（两种任意组合、三种任意组合、四种任意组合、五种任意组合、六种任意组合或者七种）同时进行检测；该方法主要分为萃取和液相色谱-串联质谱分析两个过程，具体操作包括如下步骤：

（一）对预处理后新鲜烟叶进行萃取

首先，对待测新鲜烟叶进行预处理，具体而言：先用液氮速冻，冷冻干燥后，再用粉碎机打碎（100~300目粉碎）备用；

其次，用萃取溶剂对打碎后新新鲜烟叶进行萃取；

所述萃取溶剂，为甲醇与水混合物，以体积比计，甲醇：水=3~5：1；

萃取时，优选采用超声辅助萃取；

具体物料用量方面，参考设置如下：

新鲜烟叶样品：萃取溶剂=200mg：1~4ml；具体例如为：新鲜烟叶样品200mg，萃取溶剂2 ml；

超声辅助（具体例如采用超声波细胞破碎仪）萃取时间为20~30 min（超声功率在30kHZ以上）；

（二）制备待检液

分离获得步骤（一）中含有植物激素的萃取相，冷冻、离心（20000转离心10 min），取上清液过Elut C18固相萃取小柱富集后收集液体，将该液体冷冻干燥；

具体过柱分离操作过程为：先用2 ml甲醇活化Elut C18固相萃取小柱，然后将步骤（一）中萃取液5倍体积稀释后上样，过柱分离后用3 ml、5%甲醇-水混合液洗涤固相萃取小柱，2 ml乙腈洗脱，收集乙腈洗脱下的样品，进行冷冻干燥处理；

将冷冻干燥后的样品复溶后离心（20000转离心5 min），取上清液备用待检；

所述复溶，采用0.1%甲酸-甲醇作为复溶溶剂，对应步骤（一）中物料用量及上述过柱分离样品量，复溶溶剂用量为200μL；

（三）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测分析

液相色谱、质谱条分析时，具体参数参考设置如下：

色谱柱：采用SB-C18超高压柱（Agilent公司产品），柱的规格为：2.1 mm×100 mm（i.d.，内径）, 1.8 μm；

色谱检测分析时：

柱温30℃；

流动相为：A，含0. 1%甲酸的水；B，含0. 1%甲酸的甲醇；

流速：0.3 mL/ min；进样量：1μL；

梯度洗脱：

0 min：95% A+5% B；

0.2 min（0~0.2min）：52% A+48% B；

7 min（0.2min~7min）：43% A+57% B；

7.5 min（7min~7.5min）：4% A+96% B；

10 min（7.5min~10min）：100% B；

质谱检测分析时：

离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描，多反应检测扫描（MRM模式，multireaction monitoring）；

干燥气温度：290℃；干燥气流量：12 L/min；

雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L/min；

正离子电离模式下毛细管电压：4 kV；负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV。

所述新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，具体检测分析过程中，MRM模式下7种植物激素的特征碎片离子：

。

需要说明的是，质谱检测分析时，针对激素 IAA、IBA、BR、SA、ABA、GA分别能检测到2个碎片离子，而进一步分析表明，子母离子对176.07/130.10、204.10/186.00、481.30/445.2、137.02/93.00、263.13/219.0、345.13/143.10的响应值高且结果稳定、重现性好，杂质干扰也较少，因此，以这些子母离子对作为定量离子，以对待测样品中激素IAA、IBA、BR、SA、ABA、GA进行定量；

而针对激素JA，以碎片离子209.12/58.9作为定量离子，以该离子检测响应值对待测样品中JA进行定量；

具体定量测定时：利用0.1%甲酸-甲醇溶液分别配制水杨酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素和油菜素甾醇的母液以及其混合标准工作溶液；然后分别配制用于正、负离子扫描模式的系列浓度的标准溶液，并进行测定，以目标组分定量离子的峰面积平均值（Y）对质量浓度( X，μg /L) 进行线性回归分析，得到7种植物激素的线性方程和相关系数(R2 )；以信噪比( S/N)为3确定7种激素的检出限( LOD)，具体结果如下表所示：

。

基于此线性方程，以及待测样品的峰面积检测结果，从而计算获得待测样品中一种或几种植物激素的具体含量。

总体而言，本申请所提供内源性激素检测方法，首先对前处理过程进行了进一步的优化；另一方面，相较于现有植物激素测定方法，本申请采用LC-MS/MS法进行检测时，灵敏度较高，且可单独测一种、或者同时测定其中几种、甚至同时对7种内源性植物激素进行定性或定量测定。再者，由于正负离子选择性检测模式（MRM模式）选择性好、干扰小、效率高，尤其是检测一个样本的时间仅10 min，因此本发明能有效地提高分析效率，非常适合复杂基质中低含量目标物的分析。

总之，相对于传统的植物激素分析方法，本申请所提供检测方法具有分析速度快、研究对象多、精密度好、加标回收率高、稳定性良好等优点，因而具有较好的实用价值和推广应用意义。

附图说明

图1为七种内源性植物激素混合标样的总离子流TIC图（总粒子流图）；

图2为TMV特异引物对烟叶样品PCR检测结果的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为7种内源性激素在注射TMV样品和对比样品中的含量平均值及偏差。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

样品材料：下述实施例中新鲜烟叶样品为被TMV感染的鲜烟叶（K326烟叶，生长2个月左右烟叶）片和未被感染的正常对照烟叶；

其他相关试剂及仪器均为本领域常用试剂和常见仪器，不再赘述。

实施例

以对新鲜烟叶中的内源性激素水杨酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、茉莉酸（JA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、油菜素甾醇（BR）的同时检测为例，就本申请所提供的检测方法详细介绍如下。

（一）对预处理后新鲜烟叶进行萃取

首先，取200mg被TMV感染的新鲜烟叶片，先用液氮速冻，冷冻干燥后，再用粉碎机打碎（200目粉碎）备用；

其次，将粉碎后烟叶样品置于离心管中，加入2 mL萃取溶剂（甲醇与水混合物，以体积比计，甲醇：水=4：1）

萃取时，将含有萃取溶剂的离心管置于超声波细胞破碎仪（美国，sonics公司）内，超声萃取30 min。

（二）制备待检液

分离获得步骤（一）中含有植物激素的萃取相，冷冻、离心（20000转离心10 min），取上清液过Elut C18固相萃取小柱富集后收集液体，将该液体冷冻干燥；

具体过柱分离操作过程为：先用2 ml甲醇活化Elut C18固相萃取小柱，然后将步骤（一）中萃取液5倍体积稀释后上样，过柱分离后用3 ml、5%甲醇-水混合液洗涤固相萃取小柱，2 ml乙腈洗脱，收集乙腈洗脱下的样品，进行冷冻干燥处理；

将冷冻干燥后的样品用200μL、0.1%甲酸-甲醇复溶后离心（20000转离心5 min），取上清液备用待检。

（三）液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测分析

液相色谱、质谱条分析时，具体参数设置如下：

色谱柱：采用SB-C18超高压柱（Agilent公司产品），柱的规格为：2.1 mm×100 mm（i.d.，内径）, 1.8 μm；

色谱检测分析时：

柱温30℃；

流动相为：A，含0. 1%甲酸的水；B，含0. 1%甲酸的甲醇；

流速：0.3 mL/ min；进样量：1μL；

梯度洗脱：

0 min：95% A+5% B；

0.2 min：52% A+48% B；

7 min：43% A+57% B；

7.5 min：4% A+96% B；

10 min：100% B；

质谱检测分析时：

离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描，多反应检测扫描（MRM模式，multireaction monitoring）；

干燥气温度：290℃；干燥气流量：12 L/min；

雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L/min；

正离子电离模式下毛细管电压：4 kV；负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV。

参考上述操作，对未受TMV感染的新鲜烟叶片进行色谱-质谱分析。

需要解释和说明的是，在对待测样品进行具体质谱分析前，发明人首先分别对7种植物激素标准品在MRM模式下的特征碎片离子情况进行了具体检测分析。7种植物激素标准品在MRM模式下的特征碎片离子情况如下表1所示。

表1 7种植物激素标准品在MRM模式下获得的特征碎片离子

针对激素 IAA、IBA、BR、SA、ABA、GA，在质谱分析时可分别能检测到2个碎片离子，而进一步分析表明，子母离子对176.07/130.10、204.10/186.00、481.30/445.2、137.02/93.00、263.13/219.0、345.13/143.10的响应值高且结果稳定、重现性好，杂质干扰也较少，因此可作为定量离子，后续以该离子检测响应值分别对待测样品中IAA、IBA、BR、SA、ABA、GA进行定量。

针对激素JA，以碎片离子209.12/58.9作为定量离子，其它离子均不稳定,以该离子检测响应值对待测样品中JA进行定量。

具体定量测定时：首先利用0.1%甲酸-甲醇溶液分别配制水杨酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素和油菜素甾醇的母液以及其混合标准工作溶液；然后分别配制用于正、负离子扫描模式的系列浓度的标准溶液，并进行测定（混合标样检测结果如图1所示），每个浓度平行测定3 次，以目标组分定量离子的峰面积平均值（Y）对质量浓度( X，μg /L) 进行线性回归分析，得到7种植物激素的线性方程和相关系数(R2 )；以信噪比( S/N)为3确定7种激素的检出限( LOD)，具体结果如下表2所示：

表2 7种植物激素的线性方程、相关系数及检出限

基于此线性方程，以及待测样品的峰面积检测结果，从而计算获得待测样品及对照样品中植物激素的具体含量。

依据上述回归方程及最终色谱-质谱检测结果，最终计算可知，TMV侵染的烟叶中所含水杨酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素、生长素和油菜素甾醇分别为289.15 ng/g，1.13 ng/g，1.06 ng/g，0.41 ng/g，135.33 ng/g，0.53 ng/g，2.52 ng/g；而对照样品的水杨酸、吲哚乙酸、吲哚丁酸、茉莉酸、脱落酸、赤霉素、生长素和油菜素甾醇的含量分别为216.07 ng/g，0.81 ng/g，0.61 ng/g，0.25 ng/g，88.09 ng/g，0.60 ng/g，2.44ng/g。

需要说明的是，为确保上述激素检测结果的准确性，确定相关激素含量差异是由TMV侵染所导致的，在具体检测前，发明人以特异性引物对烟叶样品进行了PCR检测，确定了TMV烟叶样品与对照样品之间差异的真实性（具体PCR检测验证结果如图2所示）。

进一步地，为确定本申请所提供检测方法的准确性和可重复性，发明人对同一烟叶样品在一天内进行5次平行测定及分别进行了5天连续性测定，由测定结果的相对标准偏差可表示、反应本申请检测方法的日内精密度和日间精密度。检测过程中同时进行了加标回收率实验，具体结果如表3和表4所示。

表3 本申请检测方法的日内精密度( RSD，%，n = 5)、日间精密度( RSD，%，n = 5)

表4 7种植物激素的加标回收率和RSD ( n = 3)

对上表结果进行分析可以看出，该检测方法的精密度好、加标回收率高，可较好满足大批量样品的检测分析要求，因而具有较好的实用价值。

Claims (5)

1.一种新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，其特征在于，该方法对新鲜烟叶中的SA、IAA、IBA、JA、ABA、GA3、BR这七种植物激素同时进行检测；具体操作包括如下步骤：

（一）对预处理后新鲜烟叶进行萃取

首先，对待测新鲜烟叶进行预处理，具体而言：先用液氮速冻，冷冻干燥后，再用粉碎机打碎备用；

其次，用萃取溶剂对打碎后新鲜烟叶进行萃取；

所述萃取溶剂为甲醇与水混合物，以体积比计，甲醇：水=3~5：1；

萃取时，采用超声辅助萃取；

（二）制备待检液

分离获得步骤（一）中含有植物激素的萃取相，冷冻、离心，取上清液过固相萃取小柱富集后收集液体，将该液体冷冻干燥；

将冷冻干燥后的样品复溶后离心，取上清液备用待检；

（三）液相色谱-串联质谱检测分析

液相色谱、质谱分析时，具体参数参考设置如下：

色谱柱：采用SB-C18超高压柱，柱的规格为：2.1 mm×100 mm，1.8 μm；

色谱检测分析时：

柱温30℃；

流动相为：A，含0. 1%甲酸的水；B，含0. 1%甲酸的甲醇；

流速：0.3 mL/ min；进样量：1μL；

梯度洗脱：

0 min：95% A+5% B；

0.2 min：52% A+48% B；

7 min：43% A+57% B；

7.5 min：4% A+96% B；

10 min：100% B；

质谱检测分析时：

离子源：电喷雾离子源，正/负离子扫描，多反应检测扫描；

干燥气温度：290℃；干燥气流量：12 L/min；

雾化器压力：40 psi；鞘气温度：200℃，鞘气流量：11L/min；

正离子电离模式下毛细管电压：4 kV；负离子电离模式下喷雾电压：3.5 kV。

2.如权利要求1所述新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，其特征在于，定量分析时，7种植物激素的特征碎片离子为：

。

3.如权利要求2所述新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，其特征在于，以目标组分定量离子的峰面积平均值Y对质量浓度X进行线性回归分析，得到7种植物激素的线性方程和相关系数R2 ；以信噪比S/N为3确定7种激素的检出限LOD，具体如下表所示：

。

4.如权利要求1所述新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，其特征在于，步骤（二）中，所述固相萃取小柱为Elut C18固相萃取小柱。

5.如权利要求1所述新鲜烟叶中内源性植物激素的检测方法，其特征在于，步骤（二）中，所述复溶，采用0.1%甲酸-甲醇作为复溶溶剂。

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