CN115598249A - 一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用，所述方法包括：用甲醇和二甲基亚砜依次提取植物样本；合并提取液并进行检测。本发明所述的检测方法检测到的植物激素的种类多，准确度、精密度和灵敏度高，不需要进行柱富集或干燥浓缩步骤，所需的样本量少，操作更为简便，有效降低了人力、时间和资金成本，可用于植物样本或相关样本中34种植物激素的同时检测。

Description

一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，涉及一种植物激素的检测方法、检测试剂盒及其应用。

背景技术

植物激素在植物生长、发育以及对生物和非生物线索的反应中具有关键作用。每一类激素都具有特征性的生物学效应。为了了解植物激素对植物生长和发育的调节作用，需要在器官、细胞和亚细胞水平上准确有效地测量单个植物激素。多类激素的同时定量分析为定义加性、协同或拮抗激素活性和识别调节植物功能的激素网络提供了基础。

现有植物激素测定方法主要有放射免疫测定和酶联免疫吸附测定、HPLC测定法、GC-MS测定法和LC-MS测定法，对于放射免疫测定和酶联免疫吸附测定，其具有灵敏度高的特点，但其所需抗体的交叉反应性通常会导致这些方法的特异性和准确性降低。HPLC测定法容易受基质影响，在多种内源性植物激素测量中灵敏度和特异性受限。GC-MS测定法已成功用于高灵敏度特异性鉴定和定量植物激素，但GC-MS分析通常需要在分析之前进行萃取、纯化和化学衍生化等步骤，比较繁琐，耗时较长。LC-MS测定法具有高的灵敏度、特异性、准确性和重现性，但是目前的检测方法只能达到同时检测几种或十几种植物激素，并不能同时全面反映更多植物激素的含量情况。

因此，在本领域中，期望开发一种能够一次性同时提取更多种植物激素，能够具有高的灵敏度和特异性并且步骤简单、耗时短的植物激素检测方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种植物激素的检测方法。本发明的方法能够一次性提取出20种以上植物激素，能够同时检测20种以上植物激素的有无以及具体含量，并且该方法的准确度、精确度和灵敏度高，步骤简单、耗时短。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一方面，本发明提供一种植物激素的检测方法，所述方法使用甲醇和二甲基亚砜(DMSO)依次提取样本；合并提取液并进行检测。

植物激素在植物等样本中种类多且含量非常低，难以检测完全。本发明人通过大量实验研究了植物激素的提取方法，包括使用单一溶剂或混合溶剂进行单次提取，包括使用甲醇、乙醇、DMSO、甲酸水溶液、盐酸水溶液或氢氧化钠水溶液、甲醇DMSO混合溶液等进行单次提取，其提取效果均不理想，进一步，发明人进行两步提取研究，意外发现：先用甲醇，再用DMSO对样本进行两次提取，再将两次的提取液合并进行检测可以检测到的植物激素的种类最多。如表2、表3、表4中，对不同的植物样本，均是使用甲醇和DMSO组合提取检出的植物激素种类最多，达到了28～33种。

一般本领域的技术人员可能会想到：相对于使用单一提取溶剂，用不同类别的溶剂进行多次提取，可以得到更多种类的化合物。然而，本发明人在使用甲醇溶液两次提取植物样本与先使用水溶液提取再使用甲醇提取植物样本，分别合并提取液进行检测，二者检测到的植物激素的种类是相同的；但是，先使用甲醇，再使用DMSO却明显提高了检测到的植物激素的种类。可能是由于植物激素在甲醇和水中的溶解度没有明显差异，而在甲醇和DMSO中存在一定差异，某种或多种植物激素在甲醇中不溶或难溶，而在DMSO中是易溶的，具体原因仍有待进一步研究。

此外，值得注意的是，发明人发现必须先使用甲醇提取再使用DMSO提取样本；先用DMSO提取再使用甲醇提取的效果与前者是不同的，其提取物合并溶液中检测到的植物激素的种类明显低于先甲醇再DMSO提取条件下的(表2和表3)。或许是由于甲醇分子量小，对植物细胞的渗透性好，易进入细胞内使细胞中的酶失活，而这些酶是可能在提取过程使植物激素水解的，如植物体内的碱性磷酸酯酶会造成核苷酸型细胞分裂素的水解，则先使用甲醇减少了酶对植物激素的水解作用，使提取获得的植物激素种类更多。也有可能是由于先使用甲醇改变了植物细胞的渗透性，再使用DMSO提取时，DMSO更容易进入细胞内部，使细胞内部的激素更容易被DMSO溶解出来。也有可能是上述二者的共同作用，具体原因需要进一步研究。

在一些实施方式中，用甲醇和二甲基亚砜依次提取植物样本的具体步骤包括：

(1)取植物样本，加入甲醇，恒温震荡，离心或过滤得提取液，并取滤渣备用；

(2)向步骤(1)的滤渣中加入DMSO，恒温震荡，离心或过滤取提取液。

将步骤(1)和步骤(2)的提取液合并即得样本溶液。

优选地，在步骤(1)恒温震荡前加入内标，所述内标包括IAA-D₅(吲哚乙酸-D₅)和/或ABA-D₆(脱落酸-D₆)。

优选地，步骤(1)中恒温震荡为在20℃及以下(例如20℃、15℃、10℃、5℃等)震荡不少于3h(例如3h、5h、8h、10h等)；步骤(2)中恒温震荡为在20℃及以下(例如20℃、18℃等)震荡不少于2h(例如3h、5h、8h、10h等)。步骤(1)和步骤(2)中震荡的频率为1000～1500rpm(例如1000rpm、1100rpm、1200rpm、1300rpm、1400rpm或1500rpm)。植物激素不稳定、易分解、对温度等条件比较敏感，如赤霉素类激素通常在偏酸性条件下才比较稳定；同时温度超过40℃就会发生快速分解。步骤(1)和步骤(2)中分别使用甲醇和DMSO提取，其中20℃以下的温度一般不低于提取溶剂的熔点，以防溶剂凝固成固体。提取温度、提取时间和震荡频率等均会影响提取效率和植物激素的稳定性，步骤(1)和步骤(2)的恒温震荡条件是由发明人通过大量实验优化获得的，在该条件下能提高提取效率同时最大程度的减小温度的影响。在一些实施方式中，样本为植物的茎、花、叶等较为疏松柔软的植物组织时，步骤(1)的震荡时间为3h即可；当植物样本为种子等较致密的植物组织时，可适当延长步骤(1)的时间，可为4h及以上；也可根据样本的不同，适当延长步骤(2)的提取时间。

优选地，所述样本为植物组织的冻干粉末；相对于20～400mg(例如20mg、50mg、80mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg或400mg)的样本，所述甲醇的用量为800～1200μL(例如800μL、900μL、1000μL、1100μL或1200μL)；所述二甲基亚砜的用量为200～600μL(例如200μL、300μL、400μL、500μL或600μL)。

本发明的方法尤其适用于少量植物样本的提取，植物样本量可低至20～400mg，先使用800～1200μL甲醇再使用200～600μL的DMSO提取，可以获得更多种类和更高浓度的植物激素，因而可以直接取提取液进行检测，不需经过浓缩过程。在研究过程中，发明人为了能检测更多的植物激素，曾尝试增大植物样本量并通过浓缩的方式以富集极低浓度的植物激素使这些植物激素能被检测到，但是植物激素是不稳定的，浓缩过程会导致植物激素的损失，没有取得理想的效果。

当然，一般技术人员知道，等比例的放大样本量和提取溶剂的体积，对提取效果的影响是可以忽略不计的，上述样本、甲醇和二甲基亚砜的用量是可以等比例的放大，例如三者用量可以等比例放大2倍、5倍、10倍、20倍、30倍等等。

在本发明的一些优选实施例中，样本、甲醇和二甲基亚砜的用量分别为50mg、1000μL、500μL，对大多数植物样本或相关样本，如小麦种子、车轱辘花，该比例下的提取效果最好。

在一些实施方式中，所述植物激素包含以下的一种或至少两种的组合：茉莉酸甲酯(MEJA)、6-苄氨基嘌呤(6-BA)、激动素(KT)、异戊烯基腺嘌呤核苷(IPA)、油菜素内酯(BR)、异戊烯基腺嘌呤(IP)、反式玉米素核苷(TZR)、褪黑素(MT)、顺式玉米素(CZ)、反式玉米素(TZ)、二氢玉米素(DZ)、吲哚-3-乙酸甲酯(MeIAA)、吲哚丁酸(IBA)、吲哚乙酸(IAA)、1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)、独脚金内酯(GR24)、赤霉素3(GA3)、赤霉素1(GA1)、赤霉素4(GA4)、脱落酸(ABA)、赤霉素7(GA7)、赤霉素5(GA5)、赤霉素19(GA19)、赤霉素24(GA24)、N-茉莉酸-异亮氨酸(JA-ILe)、糖基化水杨酸(SAG)、赤霉素51(GA51)、茉莉酸(JA)、赤霉素8(GA8)、二氢茉莉酸(DHJA)、水杨酸(SA)、3-吲哚甲酸(ICA)、吲哚-3-甲醛(ICAld)、12-氧代植物二烯酸(OPDA)。

在一些实施方式中，所述植物激素包含BR。在本申请的一些实施例和对比例中，使用先甲醇再DMSO提取的方式可以检测到BR，而使用两次甲醇提取检测不到BR，使用30％甲醇提取再DMSO或其他两次组合提取的方法，也检测不到BR。说明先甲醇再DMSO的提取方式尤其适用于检测植物样本中的BR。此外，值得注意的是，在本申请的实施例中，不同样本中的BR均可检出，这些样本有小麦种子、桃花、车轱辘花、蜂蜜和麦冬植株。

BR是油菜素甾醇类的一员，油菜素甾醇类普遍存在于植物体中，其作用机理独特，生理效应广泛，但用量极微，只有其他五大类激素中任意一种的千分之一。另外，油菜甾醇类在质谱上的离子化效率低，液相色谱-质谱联用直接分析油菜甾醇的检测限只能达到1～10mg/L(潘加亮等，油菜素甾醇激素分析的研究进展，色谱，2010，第2期，第29卷，105～110)。通常需要进行富集浓缩和/或衍生化才能检测到植物样本中的油菜素甾醇激素，例如中国专利201210486507.3(公告号：CN102980953B)使用双层固相萃取小柱、液液萃取和吹干浓缩等过程以定量检测油菜素甾醇(包括BR)。本发明的方法不需要经过富集浓缩或衍生化过程即可进行植物样本中BR的检测。

在一些实施方式中，所述检测采用LC-MS进行检测；LC-MS的LC条件包括：采用ACQUITY UPLC CSH C₁₈色谱柱，进样量为2μL～5μL，柱温40℃；用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为2mM甲酸铵0.05％甲酸水，流动相B为0.05％甲酸甲醇；梯度洗脱条件包括：0～2min，10％流动相B；2～4min，10～30％流动相B；4～19min，30～95％流动相B；19～19.10min，95～10％流动相B；19.10～22min，10％流动相B，流速为0.25mL/min。

LC-MS的MS条件包括：采用电喷雾电离源，正离子模式下质谱电压4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi；负离子模式下质谱电压-4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi。

在一些实施方式中，所述样本为冻干粉末，如4℃下的低温冻干粉末。

在一些实施方式中，所述样本为植物根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、虫瘿、枝条等中的一种或至少两种的组合。

在一些实施方式中，所述样本为小麦种子、桃花、麦冬草、苹果果实、蜂蜜、火龙果果实、拟南芥、车轱辘花中的一种或至少两种的组合。

本发明的另一方面提供了一种检测植物激素的试剂盒，所述试剂盒包括：提取试剂1、提取试剂2和对照品；所述提取试剂1为甲醇，所述提取试剂2为DMSO；所述对照品包括植物激素类化合物。该试剂盒包括上述方法中的提取试剂和对照品，可以用于配制样品溶液和一系列浓度的植物激素的对照品溶液，便于按上述方法进行样本中植物激素的检测。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括稀释剂，所述对照品包括以下的一种或至少两种固体化合物：茉莉酸甲酯、6-苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N-茉莉酸-异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3-吲哚甲酸、吲哚-3-甲醛或12-氧代植物二烯酸；所述对照品能溶解于所述稀释剂中。植物激素的稳定性较差，可以将其对照品以固体的形式置于试剂盒中，并准备对应的稀释剂，在使用时溶解稀释即可，这样既便捷又能延长试剂盒的效期。

在一些实施方式中，所述对照品为不同浓度梯度的混合对照品溶液或者混合对照品储备液。这里的混合对照品储备液中各对照品的浓度较高，可以是检测时(例如LC-MS检测)进样浓度的2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、500倍、1000倍等，(高浓度的)混合对照品储备液较低浓度的混合对照品溶液更加稳定，有利于储存运输，此外，可以将一份(高浓度的)混合对照品储备液稀释成一系列不同浓度的混合对照品，再进行检测。所述混合对照品溶液和混合对照品储备液中包括以下的一种或至少两种化合物：茉莉酸甲酯、6-苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N-茉莉酸-异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3-吲哚甲酸、吲哚-3-甲醛或12-氧代植物二烯酸。

在一些实施方式中，所述试剂盒还包括内标，所述内标包括IAA-D₅和ABA-D₆。

本发明的第三方面提供了所述方法和试剂盒在检测植物激素方面的应用

在一些实施方式中，可用所述方法或试剂盒用于检测植物样本，并通过该植物样本的检测结果对植物的生长状态或健康状态，或者植物某一部位的生长状态或健康状态进行判别。

植物生长状态不同或健康状态不同，其植物激素的种类、含量、分布情况等是不同的。通过测定植物激素的的种类、含量、分布情况即可对植物的生长状态或健康状态进行鉴定。例如，通过所述方法测定植株的植物激素含量，或植物某一部位，如花、叶等，研究健康植物和患某种或多种疾病植物的植物激素种类、含量或分布情况，再测定待测样本，将样本的植物激素种类、含量或分布情况等与健康或患病植株进行对比，即可判断样本是健康的还是患病的。同理，所述方法也可以用于判别或区分患病植株患有某种疾病，或判断样本处于生长的某个阶段或生长年限等，例如在本发明的一个实施例中，通过所述方法可以判别车轱辘花是新鲜的还是枯萎的。也可以测定多份或大量的植物样本，通过植物激素的情况将样本中的健康和患病植株区分开或者将不同种患病植株区分开或者将不同生长阶段植株区分开或者从一个整体中挑选出患某种疾病的植株等，如通过主成分分析等聚类方法对所有检测结果进行聚类，即能使同一类别聚集在同一区域，不同类别植株聚集在不同区域，如健康植株聚集在同一区域，患病植株聚集在另一区域，从而将其区分开。

在一些实施方式中，所述方法或试剂盒用于检测和判别水果或鲜花的新鲜程度，这对市场上水果或鲜花质量的检测控制等具有重要意义。

在一些实施方式中，所述方法或试剂盒用于检测和判别小麦等种子的发芽阶段，通过判别和监测小麦等种子的发芽阶段，将有利于发芽条件的研究和对播种时期的精准把握。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：本发明的方法提取检测到的植物激素种类多，特别是能检测到BR，另外，方法的灵敏度和特异性高，准确度和精密度好。同时，本发明的方法适用于检测小样本，不需要进行浓缩、衍生等过程，减少了植物样本量，操作简便，有效降低了人力、时间和资金成本。

附图说明

图1对照品溶液的TIC图(正负离子)；

图2对比例1条件下CZ和TZ的EIC图；

图3实施例1条件下CZ和TZ的EIC图；

其中，TIC为总离子流图，EIC为提取离子流图。

具体实施方式

为了对样本，主要为植物样本，如小麦、花朵、火龙果果实、麦冬草植株、拟南芥植株，另外还有含植物激素的其他样本，例如蜂蜜、植物发酵物、以植物为原料制成的产品，等中的植物激素进行检测。本申请的发明人对植物激素的提取条件、液相和色谱条件等进行了研究，开发获得了同时测定样本中34种植物激素的检测方法，该方法准确度、精密度和灵敏度高，可同时进行34种植物激素的定性和定量检测。

本申请中各植物激素的简写、中英文名称、CAS号以及下述实施例或对比例中使用的对照品来源信息如下表1所示。

表1 34种植物激素信息列表

以下为具体实施例和相关对比研究，本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。本领域技术人员在本发明的思想下所作的常规调整都应在本发明的保护范围内。

实施例1

一种植物激素的检测方法

1、溶液配制

①对照品溶液

分别称取MEJA、6-BA、KT、IPA、BR、IP、TZR、MT、CZ、TZ、DZ、Me-IAA、IBA、IAA、GR24、GA3、GA1、GA4、ABA、GA7、GA5、GA19、GA24、JA-ILe、SAG、GA51、JA、GA8、DHJA、SA、ICA、ICAld、OPDA、ACC对照品，用甲醇溶解并稀释，配制成一系列浓度的对照品溶液。

②内标混合标准溶液

取IAA-D₅(吲哚乙酸-D₅)和ABA-D₆(脱落酸-D₆)对照品，用甲醇溶解并稀释配制成内标混合标准溶液。

③样本溶液

(1)取20～400mg样本，加入内标混合标准溶液和提取试剂1，提取试剂1为甲醇，加入的甲醇总体积为800～1200μL，20℃下恒温震荡3h以上，震荡频率为1000～1500rpm。离心取上清液或者过滤取滤液，即得到第一次提取液。

(2)向剩余的滤渣中加入提取试剂2 200～600μL，提取试剂2为DMSO，20℃下恒温震荡2h以上，震荡频率为1000～1500rpm。离心取上清液或者过滤取滤液，即得到第二次提取液。

(3)合并两次提取液得样本溶液。

注：A、为了提高提取效率，步骤(1)中的样本一般为粉末，如低温冻干研磨获得的粉末。

B、步骤(1)中，可以使用低浓度的内标混合标准溶液，直接加入800～1200μL的该溶液即加入了800～1200μL的甲醇。也可以使用更高浓度的内标混合标准溶液，再加入甲醇，使加入的甲醇总体积为800～1200μL，例如加入50μL内标混合标准溶液再加入950μL甲醇，或加入200μL内标混合标准溶液再加入800μL甲醇等等。

C、步骤(1)和(2)中，优选低温离心，离心速率不低于12000rpm/min。过滤可以使用微孔滤膜，例如孔径在0.45μm及以下的微孔滤膜。

D、也可以在步骤(2)时不离心或过滤，而是将步骤(1)得到的第一次提取液加入步骤(2)恒温震荡后的固液混合物中，再离心或过滤得到样本溶液。

2、液相色谱条件

Exion LC超高效液相系统(AB Sciex，USA)采用ACQUITY

CSH C₁₈色谱柱(2.1×150mm，1.7μm，美国Waters公司)，进样量为2～5μL，柱温40℃。采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱。流动相A-2mM甲酸铵含0.05％甲酸水，B-0.05％甲酸甲醇。梯度洗脱条件为0～2min，10％ B；2～4min，10～30％ B；4～19min，30～95％ B；19～19.10min，95～10％B；19.10～22min，10％ B。流速0.25mL/min。

3、质谱条件

AB SCIEX 6500+Qtrap质谱仪(美国AB Sciex公司)，采用多重反应监测(MRM进行扫描)，电喷雾电离(ESI)源。正离子模式下质谱电压4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi。负离子模式的质谱电压为-4500v，其他离子源温度、气帘气、雾化气和辅助气条件同正离子模式。

AB SCIEX 6500+Qtrap质谱仪可同时进行正负离子模式的检测，因此，只需要进一针样品即可获得正离子模式和负离子模式的检测结果，对于其他不能同时使用正负离子模式的质谱仪，则可以先在正离子模式下进一针样品，再在负离子模式下进一针样品，或者先负离子再正离子模式，以获得两种模式下的检测结果。

取一系列浓度的对照品溶液和样本溶液注入高效液相-质谱连用仪，按上述条件进行检测。对照品溶液的正负离子模式的TIC图如图1。通过标准曲线法计算样本溶液中待测植物激素的浓度。

对比例1

取含有CZ和TZ对照品的溶液，按下述洗脱梯度进行检测，其他条件同实施例1。

梯度洗脱条件为0～2min，30％ B；2～16min，30～95％ B；16～17.1min，95～30％B；17.1～20min，30％ B。

在该洗脱条件下，选取220.1→136.0离子对检测CZ和TZ，如图2二者几乎完全重叠。

CZ和TZ为顺反异构体，其结构类似，在反相色谱条件下难以实现分离。又因二者具有相同的母离子和子离子，需要实现完全分离才能进行定性或定量检测。使用实施例1的梯度洗脱条件实现了完全分离(如图3)，能用于CZ和TZ的同时定量检测。

需要说明的是，所述的34种植物激素中除了CZ和TZ这两个顺反异构体外，还包括多种赤霉素，例如GA1、GA4、GA7、GA8、GA19等等，这些赤霉素类具有相似的结构，其中部分也是同分异构体，如GA5和GA7；此外，ICA、IAA、IBA等的结构也是类似的。这些相似结构的化合物是难以在同一液相和质谱条件下实现同时检测的，适用于同时检测34种植物激素的液相和质谱更是难以获得。此外，植物激素在植物样本的含量是非常低的，通常只有植物次生代谢产物的万分之一甚至更低，在0.1～50ng·g-1鲜重范围内(符继红等，植物激素定量分析方法研究进展，科学通报，2010年第55卷第33期：3163-3176)。因此，对仪器的灵敏度要求也非常苛刻。为了使34种植物激素被高效液相-质谱联用仪检测到，发明人进行了大量液相和质谱条件的优化，包括流动相组成、梯度、流速、柱温、色谱柱类型、质谱的离子源温度、电压、雾化气压力等等，意外获得了实施例1所述的液相和色谱条件，使能满足样本中34种微量植物激素的同时检测。

对比例1仅是优化过程的不符合分析要求的代表条件及数据。在研究过程，有的液相条件不满足分离要求，有的质谱条件不满足灵敏度要求，有的满足分离条件的液相条件又会影响质谱的灵敏度等等，其他不满足要求的条件在此就不一一列举了。

植物激素在植物体内的含量极低，同时植物激素的状态不稳定。如何将更多植物激素提取出来、在提取过程避免植物激素的损失以及减少植物中其他复杂基质的干扰等是植物激素提取过程中面临的难题。对于不同植物样本，植物激素的提取方法以及相关研究过程如下。

实施例2

样本为小麦种子，样本溶液制备方法如下：

(1)将小麦种子冻干后研磨成粉，称取50mg加入棕色离心管中，加入950μL提取试剂和50μL内标混合标准溶液，其中提取试剂为甲醇，内标混合标准溶液为IAA-D₅(0.5μg/ml)和ABA-D₆(1μg/ml)的甲醇溶液。20℃下恒温震荡4h，震荡频率为1500rpm，离心取上清液。

(2)向步骤(1)剩余的滤渣中加入DMSO 500μL，20℃下恒温震荡4h，震荡频率为1500rpm，离心取上清液。

(3)合并两次上清液得样本溶液。

取样本溶液按实施例1的条件进行检测。

对比例2

步骤(2)中提取试剂为甲醇，其他均同实施例2。

对比例3

与实施例2的区别仅在于，将实施例1中步骤(1)中甲醇替换为DMSO，步骤(2)中DMSO替换为甲醇。

测试结果如表1所示。

表2小麦种子样本溶液中植物激素的峰面积(EIC)结果

注：表中N/A代表未检出，未检出指低于检测限，各植物激素的检测限详见下述表7，以下各表中的N/A具有相同的意义。

表中结果显示甲醇+DMSO的组合(实施例2)，过检测限的化合物种类最多，即实施例2的方法检测到小麦种子中植物激素的种类最多，比甲醇+甲醇的组合(对比例2)多5种。此外，实施例2的方法可以检测到小麦种子中的BR、GA7、GA5和GA8，对比例2-3均未检测到小麦种子中的这几种化合物。说明实施例2的甲醇+DMSO的组合提取方法比对比例2(甲醇+甲醇)和对比例3(DMSO+甲醇)提取方法更优。值得注意的是，实施例2与对比例3相比，提取试剂种类是相同的，仅第一步提取试剂和第二步试剂种类进行了替换，其结果却存在很大差异。说明先甲醇再DMSO的提取顺序不能更改。

实施例3

样本为桃花，样本溶液制备方法如下：

(1)将桃花样本(新鲜)冻干后研磨成粉，称取20mg至棕色离心管中，加入750μL提取试剂和50μL内标混合标准溶液，加入提取试剂和内标，其中提取试剂为甲醇，内标混合标准溶液为IAA-D₅(0.5μg/ml)和ABA-D₆(1μg/ml)的甲醇溶液。20℃下恒温震荡3h，震荡频率为1200rpm，离心取上清液。

(2)向步骤(1)剩余的滤渣中加入提取试剂DMSO 200μL，20℃下恒温震荡3h，震荡频率为1200rpm。

(3)将步骤(1)的上清液与步骤(2)恒温震荡后的液体合并，离心，取上清液。

取样本溶液按实施例1的条件进行检测。

对比例4

与实施例3不同之处仅在于，将实施例3中步骤(1)中甲醇替换为甲醇：DMSO体积比60:40的混合溶液；步骤(2)中DMSO替换为甲醇：DMSO体积比60:40的混合溶液。

对比例5

与实施例3不同之处仅在于，将实施例3中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸水：甲醇体积比为30:70的混合溶液；步骤(2)中DMSO替换为0.1％甲酸水：甲醇体积比为30:70的混合溶液。

对比例6

与实施例3不同之处仅在于，将实施例3中步骤(1)中甲醇替换为DMSO，步骤(2)中DMSO替换为甲醇，其他(包括提取试剂体积、恒温振荡温度、频率、时间)先按实施例3步骤(2)的条件进行提取，再按步骤(1)的条件进行提取。

实施例3、对比例4至6中植物激素检测结果如下表：

表3桃花样本溶液中植物激素的峰面积(EIC)

检测结果如表3，结果显示甲醇+DMSO的组合(实施例3)中过检测限的植物激素种类多于其他组合。实施例3检出了桃花样本中的BR、GA4、GA24、GA51、GA8，对比例4-6均未检出。

有趣的是，对比例6和实施例3相比，对提取剂1和提取剂2种类进行了替换，变换了提取顺序，其结果却存在很大差异，说明甲醇和DMSO的提取顺序是不能颠倒的。

实施例4

样本为麦冬草(新鲜植株)，样本溶液制备方法如下：

(1)将麦冬草冻干后研磨成粉，称取100mg加入棕色离心管中，加入1150μL甲醇和50μL内标混合标准溶液，其中提取试剂为甲醇，内标混合标准溶液为IAA-D₅(0.5μg/ml)和ABA-D₆(1μg/ml)的甲醇溶液。20℃下恒温震荡3h，震荡频率为1500rpm，离心取上清液。

(2)向步骤(1)剩余的滤渣中加入DMSO 300μL，20℃下恒温震荡2h，震荡频率为1500rpm，离心取上清液。

(3)合并两次上清液得样本溶液。

取样本溶液按实施例1的条件进行检测。

对比例7

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸水：甲醇体积比为30:70的混合溶液；步骤(2)中DMSO替换为0.1％甲酸水：甲醇体积比为30:70的混合溶液。

对比例8

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸水：甲醇体积比为50:50的混合溶液。

对比例9

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸水：甲醇(体积比为40:60)的混合溶液。

对比例10

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸水：甲醇(体积比为20:80)的混合溶液。

对比例11

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为0.1％甲酸甲醇，将实施例4中步骤(2)中DMSO替换为0.1％甲酸甲醇。

对比例12

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中提甲醇替换为甲醇：DMSO(体积比为60:40)的混合溶液。

对比例13

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为甲醇：DMSO(体积比为70:30)的混合溶液。

对比例14

与实施例4不同之处在于，将实施例4中步骤(1)中甲醇替换为甲醇：DMSO(体积比为80:20)的混合溶液。

实施例4、对比例7-14的实验结果如下表：

表4-1对比例7-11中测得的各植物激素的峰面积(EIC)

表4-2对比例12-14以及实施例4中测得的各植物激素的峰面积(EIC)

由表4-1以及表4-2中结果可知，使用甲醇+DMSO的组合(实施例4)依次提取麦冬草，检测到的植物激素的种类最多，特别地，该条件下可以检测到麦冬草中的BR且峰面积最高，说明该条件尤其适用于BR的提取。对比例7-14添加了甲酸、和/或在提取剂1甲醇中添加了一定比例的水或DMSO、和/或提取剂DMSO用甲醇代替，其测得的植物激素的种类均低于实施例4。另外，实施例4检出了麦冬草中的GA1、GA4和GA8，对比例7-14均未检出。

实施例5

样本为蜂蜜，样本溶液制备方法如下：

(1)将蜂蜜冻干后研磨成粉，称取400mg至棕色离心管中，加入1150μL甲醇和50μL内标混合标准溶液，其中提取试剂为甲醇，内标混合标准溶液为IAA-D₅(0.5μg/ml)和ABA-D₆(1μg/ml)的甲醇溶液。20℃下恒温震荡4h，震荡频率为1000rpm，离心取上清液。

(2)向步骤(1)剩余的滤渣中加入提取试剂DMSO 600μL，20℃下恒温震荡2h，震荡频率为1000rpm，离心取上清液。

(3)合并两次上清液得样本溶液。

取样本溶液按实施例1的条件进行检测。

蜂蜜中植物激素的检测结果如下表：

表5蜂蜜中34种植物激素的检测结果

实施例6

分析方法验证

对实施例3的检测方法进行验证，验证项目包括：线性、定量限、检测限、精密度、准确度，具体如下：

1、线性

分别称取MEJA、6-BA、KT、IPA、BR、IP、TZR、MT、CZ、TZ、DZ、Me-IAA、IBA、IAA、GR24、GA3、GA1、GA4、ABA、GA7、GA5、GA19、GA24、JA-ILe、SAG、GA51、JA、GA8、DHJA、SA、ICA、ICAld、OPDA、ACC对照品，用甲醇溶解并稀释，配制成一系列浓度的对照品溶液，按实施例1的液相和质谱条件进行检测。

线性试验结果如下表：

表6线性和范围试验结果

2、定量限、检测限

取MEJA、6-BA、KT、IPA、BR、IP、TZR、MT、CZ、TZ、DZ、Me-IAA、IBA、IAA、GR24、GA3、GA1、GA4、ABA、GA7、GA5、GA19、GA24、JA-ILe、SAG、GA51、JA、GA8、DHJA、SA、ICA、ICAld、OPDA、ACC对照品配制的对照品溶液，依次稀释按实施例1的液相和质谱条件进行检测，取S/N(信噪比)不低于10的浓度为定量限；进一步稀释、检测，取S/N不低于3的浓度为检测限。定量限浓度下的回收率应满足标准要求。

各植物激素的定量限和检测限结果如下表：

表7定量限和检测限

3、准确度

取桃花样本粉末，加入一定量的34种植物激素的对照品，按实施例3的条件进行提取，配制低浓度(定量限浓度，记为LQC)、中浓度(MQC)以及高浓度(HQC)的加标溶液，每个浓度平行6份。按实施例1的液相和色谱条件进行检测，计算回收率。回收率结果如下表：

表8回收率试验结果

4、精密度

同准确度，配制低浓度(定量限浓度，记为LQC)、中浓度(MQC)以及高浓度(HQC)的加标溶液，每个浓度平行6份并进样检测。通过标准曲线法计算样本溶液中34种植物激素的浓度，并计算平行6份结果的RSD值。精密度试验结果如下表：

表9精密度试验结果

由上述的方法验证结果可知，34种植物激素的线性系数(r)均大于0.99，各植物激素在各自线性范围内线性关系良好。低、中、高浓度点的准确度回收率在85％～115％之间，精密度RSD在15％范围内，说明方法的精密度和准确度高。同时，方法的检测限和定量限在0.001～25ng/mL范围内，说明所述方法的灵敏度高。因此，所述方法能用于桃花中34种植物激素的精准定量。

采用小麦种子、麦冬草以及蜂蜜等样本时的方法验证结果类似，在此不一一赘述。

应用实施例

区分新鲜和枯萎的花朵。

(1)取新鲜和枯萎的车轱辘花，冻干后研磨成粉，分别称取50mg至棕色离心管中，加入950μL甲醇和50μL内标混合标准溶液，其中提取试剂为甲醇，内标混合标准溶液为IAA-D₅(0.5μg/ml)和ABA-D₆(1μg/ml)的甲醇溶液。20℃下恒温震荡4h，震荡频率为1500rpm，离心取上清液。

(2)向步骤(1)剩余的滤渣中加入提取试剂DMSO 500μL，20℃下恒温震荡2h，震荡频率为1500rpm。

(3)将步骤(1)的上清液与步骤(2)恒温震荡后的液体合并，离心，取上清液，得新鲜车轱辘花样本溶液和枯萎车轱辘花样本溶液。

取样本溶液按实施例1的条件进行检测，新鲜和枯萎的车轱辘花中34种植物激素的检测结果如下表：

表10新鲜和枯萎车轱辘花中34种植物激素的检测结果(ng/mL)

由表中结果可知，新鲜车轱辘花中检出的植物激素的种类和含量与枯萎车轱辘花的存在明显差异。进一步进行多元统计分析(包括PCA分析、PLS-DA分析和OPLS-DA分析)并进行差异分析寻找能用于区分新鲜车轱辘花和枯萎车轱辘花的植物激素。最终发现MEJA、ACC、SAG、GA3等为新鲜车轱辘花和枯萎车轱辘花之间的差异代谢物。

由一实验员随机分别取50份新鲜和枯萎车轱辘花，按上述方法配制成样本溶液并进行检测。再由另一实验员根据上述发现的差异代谢物及检测值，对样本是新鲜的还是枯萎的车轱辘花进行判断，准确率能达到100％。因此，所述的植物激素的检测方法能应用于新鲜与枯萎花朵的判别或区分。

发明人通过所述植物激素的检测方法对新鲜苹果、腐烂苹果的未腐烂部分、腐烂苹果的腐烂部分进行检测，并进行对比分析，发现这三者之间存在明显差异，通过多元统计分析以及差异分析寻找差异代谢物，再通过所述植物激素的方法检测这些差异代谢物实现了三者的区分。

同理，发明人通过上述方法检测未发芽小麦、发芽未长根小麦以及发芽长根小麦中的植物激素，发现这三者之前也存在显著性差异，通过所述植物激素的检测方法可以实现这三种生长状态小麦的区分。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的植物激素提取和定量检测方法，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (17)

1.一种植物激素的检测方法，其特征在于，所述方法使用甲醇和二甲基亚砜依次提取样本；合并提取液并进行检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述使用甲醇和二甲基亚砜依次提取样本的具体步骤包括：

(1)取样本，加入甲醇，恒温震荡提取，离心或过滤得提取液，并取滤渣备用；

(2)向步骤(1)的滤渣中加入二甲基亚砜，恒温震荡，离心或过滤得提取液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在步骤(1)恒温震荡前加入内标，所述内标包括吲哚乙酸-D₅和脱落酸-D₆。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中恒温震荡为在20℃及以下震荡不少于3h；步骤(2)中恒温震荡为在20℃及以下震荡不少于2h；步骤(1)和步骤(2)中震荡的频率为1000rpm～1500rpm。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为冻干粉末，相对于20～400mg的样本，所述甲醇的用量为800～1200μL；所述二甲基亚砜的用量为200～600μL。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物激素包括如下植物激素中的一种或至少两种的组合：茉莉酸甲酯、6-苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N-茉莉酸-异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3-吲哚甲酸、吲哚-3-甲醛或12-氧代植物二烯酸。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物激素包括油菜素内酯。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测采用LC-MS进行检测；

LC-MS的LC条件包括：采用ACQUITY UPLC CSH C₁₈色谱柱，进样量为2μL～5μL，柱温40℃；用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为2mM甲酸铵0.05％甲酸水，流动相B为0.05％甲酸甲醇；梯度洗脱条件包括：0～2min，10％流动相B；2～4min，10～30％流动相B；4～19min，30～95％流动相B；19～19.10min，95～10％流动相B；19.10～22min，10％流动相B，流速为0.25mL/min；

LC-MS的MS条件包括：采用电喷雾电离源，正离子模式下质谱电压4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi；负离子模式下质谱电压-4500V，离子源温度400℃，气帘气40psi，雾化气为40psi和辅助气为35psi。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为植物组织的冻干粉末；所述植物组织为根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、虫瘿或枝条中的一种或至少两种的组合。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述样本为小麦种子、桃花、麦冬草、苹果果实、蜂蜜、火龙果果实、拟南芥或车轱辘花中的任意一种或至少两种的组合。

11.一种检测植物激素的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：提取试剂1、提取试剂2和对照品；所述提取试剂1为甲醇，所述提取试剂2为二甲基亚砜；所述对照品包括植物激素类化合物。

12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括稀释剂，所述对照品包括以下的一种或至少两种固体化合物：茉莉酸甲酯、6-苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N-茉莉酸-异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3-吲哚甲酸、吲哚-3-甲醛、12-氧代植物二烯酸；所述对照品能溶解于所述稀释剂中。

13.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述对照品为不同浓度梯度的混合对照品溶液或者混合对照品储备液；所述混合对照品溶液和混合对照品储备液中包括以下的一种或至少两种化合物：茉莉酸甲酯、6-苄氨基嘌呤、激动素、异戊烯基腺嘌呤核苷、油菜素内酯、异戊烯基腺嘌呤、反式玉米素核苷、褪黑素、顺式玉米素、反式玉米素、二氢玉米素、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚丁酸、吲哚乙酸、1-氨基环丙烷-1-羧酸、独脚金内酯、赤霉素3、赤霉素1、赤霉素4、脱落酸、赤霉素7、赤霉素5、赤霉素19、赤霉素24、N-茉莉酸-异亮氨酸、糖基化水杨酸、赤霉素51、茉莉酸、赤霉素8、二氢茉莉酸、水杨酸、3-吲哚甲酸、吲哚-3-甲醛、12-氧代植物二烯酸。

14.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内标，所述内标包括吲哚乙酸-D₅和脱落酸-D₆。

15.根据权利要求1-10之一所述的方法和11-14所述的试剂盒在植物激素检测方面的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述方法或试剂盒用于检测植物样本，并通过该植物样本的检测结果对植物的生长状态或健康状态，或者植物某一部位的生长状态或健康状态进行判别。

17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述方法用于判别水果或鲜花的新鲜程度，或者判别小麦的发芽阶段。

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