CN112229928B - 一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法 - Google Patents

一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及化学分析定量检测技术领域,具体涉及一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法,包括以下步骤:样品经过液氮研磨,加入特定的提取剂提取,并在特定的色谱条件和质谱条件下采用LC‑MS/MS检测分析。本发明前处理操作简单快速,样品需要量少;可最多同时实现25种、涉及到6大类的植物激素的定量检测,采用同位素内标法,定量结果准确,重现性好;可分别应用于水稻、拟南芥、番茄、小麦等植物样本中植物激素的检测,具有广泛的适用性。

Description

一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法
技术领域
本发明涉及化学分析定量检测技术领域,具体涉及一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法。
背景技术
植物激素(Plant hormones,PHs)是一类对调节植物的生长和发育有着显著作用的微量有机化合物,为了研究植物激素的作用机理,需对植物体内激素组成及其含量进行测定。
目前,已报道的检测方法通常处理复杂,且通常只能检测一类植物激素或只应用于某一物种。因此,开发一种具有广泛适用性,且能同时对多种植物激素进行定量的方法至关重要。
发明内容
针对上述问题,本发明的目的在于提供一种能够同时定量植物样本中多种植物激素的方法,该方法简单,快速,适用性广。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
本发明提供了一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法,包括以下步骤:
S1,取液氮下研磨得到的植物样本粉末,加入同位素内标的混合液和提取溶剂,混匀,离心,得到提取液,将得到的提取液浓缩后再用复溶剂复溶,得到待检测液,所述提取溶剂为甲醇、水、甲酸按照体积比为(12-15):(4-6):1制备得到混合液;
S2,分别配制预检测物质的一系列浓度梯度的植物激素标准溶液,所述标准溶液中均含有内标物;
S3,将步骤S2中制备得到的标准溶液在LC-MS/MS多反应监测模式下进行测定,以测得的目标物与其对应内标的峰面积比为纵坐标,以相应的浓度比为横坐标,绘制标准曲线;
S4,采用与步骤S3相同的方法检测步骤S1中得到的待检测液;
S5,将步骤S4中得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3中得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定植物激素的种类,根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线,即可得待测样品中各植物激素的含量;
其中,所述植物激素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-甲酸、异戊烯腺嘌呤、反式玉米素、顺式玉米素、二氢玉米素、茉莉酸甲酯、茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸-异亮氨酸、水杨酸、脱落酸、赤霉素1、赤霉素3、赤霉素4、赤霉素7、赤霉素9、赤霉素15、赤霉素19、赤霉素20、赤霉素24、赤霉素53。
其中,步骤S3中液相色谱的条件为:
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱;
流动相:流动相A为含有体积比为0.04%乙酸的超纯水溶液,流动相B为含有体积比为0.04%的乙酸的乙腈溶液;流速为0.35mL/min;柱温为40℃;进样量为2μL;
梯度洗脱程序为:
Figure BDA0002714161720000021
Figure BDA0002714161720000031
其中,步骤S3中质谱条件为:采用ESI源,温度为550℃,正离子模式下质谱电压为5500V,负离子模式下质谱电压为-4500V,气帘气为35psi。
其中,步骤S1中提取溶剂为甲醇、水、甲酸按照体积比为14:5:1制备得到的混合液。
其中,所述同位素内标为脱落酸[2H6]ABA、吲哚-3-乙酸[2H2]IAA、反式玉米素[2H5]tZ、水杨酸[2H4]SA、茉莉酸[2H5]JA和赤霉素A4[2H2]GA4。
其中,步骤S1中50mg植物样本粉末添加(0.8-1.2)mL提取溶剂。
其中,步骤S1中复溶剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液。
优选地,复溶所用的有机溶剂-水溶液中还含有2-氯-苯丙氨酸。
具体地,2-氯-苯丙氨酸的含量为1μg/mL。
其中,步骤S3中质谱内标法采用的被检测离子条件如下:
Figure BDA0002714161720000032
Figure BDA0002714161720000041
本发明具有以下有益技术效果:
(1)样品经过液氮研磨成粉末后,仅需经过添加提取溶剂、离心、复溶、浓缩即可用于检测,前处理操作简单快速,样品需要量少。
(2)可最多同时实现25种、涉及到6大类的植物激素的定量检测,包括生长素(Auxin)、细胞分裂素(Cytokinins,CKs)、脱落酸(Abscisic acid,ABA)、茉莉酸(Jasmonates,JAs)、水杨酸(Salicylic acid,SA)、赤霉素(Gibberellin acid,GAs),采用同位素内标法,定量结果准确,重现性好。
(3)加入2-氯-苯丙氨酸,作为复溶过程及检测过程的质控指标之一,可以监测复溶过程和检测过程仪器的稳定性。
(4)将此方法分别应用于水稻、拟南芥、番茄、小麦等植物样本中植物激素的检测,检测重复性结果均为良好。
附图说明
图1为实施例1中水稻样品的检测图谱;
图2为实施例2中拟南芥样品的检测图谱;
图3为实施例1和对比例1、对比例2中水稻样品中的检测结果对比图。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。
本实施方式提供一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法,包括以下步骤:
S1,取液氮下研磨得到的植物样本粉末,加入同位素内标的混合液和提取溶剂,混匀,离心,得到提取液,将得到的提取液浓缩后再用有机溶剂-水溶液复溶,得到待检测液。其中,提取溶剂为甲醇、水、甲酸按照体积比为(12-15):(4-6):1制备得到混合液。
本步骤中,所添加的同位素内标的混合液为含有脱落酸[2H6]ABA、吲哚-3-乙酸[2H2]IAA、反式玉米素[2H5]tZ、水杨酸[2H4]SA、茉莉酸[2H5]JA和赤霉素A4[2H2]GA4六种同位素内标的混合液,其中各内标含量均为1ng,所用的提取溶剂为甲醇-水-甲酸按照体积比(12-15):(4-6):1制备得到的混合液。其中优选地,甲醇:水:甲酸的体积比为14:5:1,当更换提取溶剂或者改变提取溶剂的比例时,各物质的提取会出现提取量偏低或者提取结果不稳定的现象。
S2,分别配制预检测物质的一系列浓度梯度的植物激素标准溶液,标准溶液中均含有1ng的内标物,且标准溶液中对应的物质的质量浓度在1~500ng/mL之间。
S3,将步骤S2中制备得到的标准溶液在LC-MS/MS多反应监测模式下进行测定,以测得的目标物与其对应的内标的峰面积比为纵坐标,以相应的浓度比为横坐标,绘制标准曲线;
S4,采用与步骤S3相同的方式检测步骤S1中得到的待检测液;
S5,将步骤S4中得到的待测样品多反应检测色谱图与步骤S3中得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定植物激素的种类,根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线,可得待测样品中各植物激素的含量;
其中,所述植物激素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-甲酸、异戊烯腺嘌呤、反式玉米素、顺式玉米素、二氢玉米素、茉莉酸甲酯、茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸-异亮氨酸、水杨酸、脱落酸、赤霉素1、赤霉素3、赤霉素4、赤霉素7、赤霉素9、赤霉素15、赤霉素19、赤霉素20、赤霉素24、赤霉素53。
本发明中,步骤S3中液相色谱的条件为:
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱;
流动相:流动相A为含有体积比为0.04%乙酸的超纯水溶液,流动相B为含有体积比为0.04%的乙酸的乙腈溶液;流速为0.35mL/min;柱温为40℃;进样量为2μL;
梯度洗脱程序为:
Figure BDA0002714161720000061
Figure BDA0002714161720000071
本发明中,步骤S3中质谱条件为:采用ESI源,温度为550℃,正离子模式下质谱电压为5500V,负离子模式下质谱电压为-4500V,气帘气为35psi。
本发明中,步骤S1中50mg植物样本粉末添加(0.8-1.2)mL提取溶剂。
本发明中,步骤S1中复溶所用的有机溶剂-水溶液为任意比例的甲醇-水或乙腈-水溶液。
优选地,复溶所用的有机溶剂-水溶液中还含有2-氯-苯丙氨酸。
具体地,2-氯-苯丙氨酸的含量为1μg/mL。
本发明中,步骤S3中质谱内标法采用的被检测离子条件如下:
Figure BDA0002714161720000072
Figure BDA0002714161720000081
实施例1
本实施例提供一种水稻样品中植物激素的定量检测方法,包括以下步骤:
S1,取50mg液氮下研磨得到的水稻叶片粉末,加入0.01mL同位素(脱落酸[2H6]ABA、吲哚-3-乙酸[2H2]IAA、反式玉米素[2H5]tZ、水杨酸[2H4]SA、茉莉酸[2H5]JA和赤霉素A4[2H2]GA4)内标的混合液(各内标含量均为1ng)、1mL甲醇-水-甲酸(体积比14:5:1)混匀,于室温下涡旋15min,4℃、14000rpm离心5min,取上清液。将得到的样品提取液用冷冻浓缩仪进行浓缩,再用含1μg/mL2-氯-苯丙氨酸的80%甲醇-水溶液复溶,过滤后待测。
S2,配制浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、200、500ng/mL的一系列标曲点(内标为脱落酸[2H6]ABA、吲哚-3-乙酸[2H2]IAA、反式玉米素[2H5]tZ、水杨酸[2H4]SA、茉莉酸[2H5]JA和赤霉素A4[2H2]GA4,各内标含量均为1ng);
S3,在LC-MS/MS多反应监测模式下按照上述程序进行测定,按照如下条件进行测定:
所用的检测设备为:AB 6500Q-Trap
液相色谱条件
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱(1.8μm,100mm×2.1mm i.d.);
流动相:流动相A为含有体积百分比为0.04%乙酸的超纯水溶液,流动相B为含有体积百分比为0.04%乙酸的乙腈溶液;流速为0.35mL/min;柱温为40℃;进样量为2μL;梯度洗脱程序如下:
Figure BDA0002714161720000082
Figure BDA0002714161720000091
质谱条件
多反应监测模式,电喷雾离子源(Electrospray Ionization,ESI),温度为550℃,正离子模式下质谱电压为5500V,负离子模式下质谱电压为-4500V,气帘气(Curtain Gas,CUR)为35psi。在Q-Trap 6500+中,每个离子对是根据优化的去簇电压(declusteringpotential,DP)和碰撞能(collision energy,CE)进行扫描检测,离子对信息如下:
表1实施例1中质谱检测时的离子对信息
Figure BDA0002714161720000092
以测得的目标物与其对应内标的峰面积比为纵坐标,以相应的浓度比为横坐标,绘制标准曲线,如下表1所示:
表2 25种植物激素标准曲线
Figure BDA0002714161720000101
S4,采用步骤S3相同的方法检测步骤S1中得到的待检测液,得到的图谱如图1所示;
S5,将步骤S4中得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3中得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定植物激素的种类,将检测到的样品的积分峰面积比值代入标准曲线线性方程,进一步带入计算公式计算,得到样品中各植物激素的浓度(具体可参见下表3所示)
样本中激素的含量(ng/g)=c*V/1000/m
公式中各字母含义:
c:样本中激素积分峰面积比值代入标准曲线得到的浓度值(ng/mL);
V:复溶时所用溶液的体积(μL);
m:称取的样本质量(g)。
为了验证本方法的准确度和精密度,向水稻样品中加入100ng/mL的混合标品(含生长素、细胞分裂素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸、赤霉素等25种植物激素,详见表2),按照上述方法进行前处理和检测,一天进行6次加标重复处理,连续三天得到的加标回收率在70-109%之间,日内日间RSD<20%,证明了本方法的准确度和精密度,具体结果如下表3所示:
表3水稻样品检测方法的准确度和精密度结果
Figure BDA0002714161720000111
实施例2
按照和实施例1同样的方式对拟南芥叶片粉末进行检测,并对其准确度和精密度进行验证,结果如下表4所示:
表4拟南芥样品方法的准确度和精密度结果
Figure BDA0002714161720000121
对比例
分别用甲醇/水/甲酸(15:4:1,v/v/v)、乙腈/水/甲酸(80:19:1,v/v/v)、异丙醇/水/盐酸(2:1:0.002,v/v/v)三种提取剂对水稻叶片样本进行提取,其他按照实施例1的检测方法进行检测,根据检出植物激素的峰面积比较提取效果,结果图3所示,说明甲醇/水/甲酸(15:4:1,v/v/v)的提取效果最佳。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1,取液氮下研磨得到的植物样本粉末,加入同位素内标的混合液和提取溶剂,混匀,离心,得到提取液,将得到的提取液浓缩后再用复溶剂复溶,得到待检测液,所述提取溶剂为甲醇、水、甲酸按照体积比为(12-15):(4-6):1制备得到混合液;
S2,分别配制预检测物质的一系列浓度梯度的植物激素标准溶液,所述标准溶液中均含有内标物;
S3,将步骤S2中制备得到的标准溶液在LC-MS/MS多反应监测模式下进行测定,以测得的目标物与其对应内标的峰面积比为纵坐标,以相应的浓度比为横坐标,绘制标准曲线;
S4,采用与步骤S3相同的方法检测步骤S1中得到的待检测液;
S5,将步骤S4中得到的待测样品多反应监测色谱图与步骤S3中得到的标准样品多反应监测色谱图进行比较,根据高效液相色谱-质谱获得的保留时间和特征离子鉴定植物激素的种类,根据待测样品色谱峰面积结合标准曲线,即可得待测样品中各植物激素的含量;
其中,所述植物激素包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-乙酸甲酯、吲哚-3-丁酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-3-甲酸、异戊烯腺嘌呤、反式玉米素、顺式玉米素、二氢玉米素、茉莉酸甲酯、茉莉酸、二氢茉莉酸、茉莉酸-异亮氨酸、水杨酸、脱落酸、赤霉素1、赤霉素3、赤霉素4、赤霉素7、赤霉素9、赤霉素15、赤霉素19、赤霉素20、赤霉素24、赤霉素53;
步骤S3中液相色谱的条件为:
色谱柱:Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱;
流动相:流动相A为含有体积比为0.04%乙酸的超纯水溶液,流动相B为含有体积比为0.04%的乙酸的乙腈溶液;流速为0.35mL/min;柱温为40℃;进样量为2μL;
梯度洗脱程序为:
时间/min 流动相A 流动相B 0 95 5 1 95 5 8 5 95 9 5 95 9.1 95 5 12 95 5
步骤S3中质谱条件为:采用ESI源,温度为550℃,正离子模式下质谱电压为5500V,负离子模式下质谱电压为-4500V,气帘气为35psi。
2.根据权利要求1所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,步骤S1中提取溶剂为甲醇、水、甲酸按照体积比为14:5:1制备得到的混合液。
3.根据权利要求1所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,所述同位素内标为脱落酸[2H6]ABA、吲哚-3-乙酸[2H2]IAA、反式玉米素[2H5]tZ、水杨酸[2H4]SA、茉莉酸[2H5]JA和赤霉素A4[2H2]GA4。
4.根据权利要求1所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,步骤S1中50mg植物样本粉末添加(0.8-1.2)mL提取溶剂。
5.根据权利要求1所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,步骤S1中复溶剂为甲醇水溶液或乙腈水溶液。
6.根据权利要求5所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,所述复溶剂中还含有2-氯-苯丙氨酸。
7.根据权利要求6所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,所述复溶剂中2-氯-苯丙氨酸的含量为1μg/mL。
8.根据权利要求1所述的同时定量植物样本中多种植物激素的方法,其特征在于,步骤S3中质谱内标法采用的被检测离子条件如下:
物质 分子质量 母离子 子离子 吲哚-3-乙酸 175.18 176.1 130.1 吲哚-3-乙酸甲酯 189.21 190.1 130 吲哚-3-丁酸 203.24 204.3 130.2 吲哚-3-甲醛 145.16 146.1 118 吲哚-3-甲酸 161.16 159.8 116.1 异戊烯腺嘌呤 203.24 204.25 136 反式玉米素 219.24 220.2 136.1 顺式玉米素 219.24 220.25 136.1 二氢玉米素 221.26 221.8 136.1 茉莉酸甲酯 224.29 225.2 151.2 茉莉酸 210.27 209.1 58.8 二氢茉莉酸 212.29 211.1 59 茉莉酸-异亮氨酸 323.43 322.401 129.7 水杨酸 138.12 137 93 脱落酸 264.32 263.1 153.1 赤霉素1 348.393 347 259 赤霉素3 346.37 345 239 赤霉素4 332.39 331 212.8 赤霉素7 330.378 329.2 223 赤霉素9 316.39 315.1 270.9 赤霉素15 330.418 329.1 131 赤霉素19 362.417 361.2 273.2 赤霉素20 332.391 331.3 287 赤霉素24 346.417 345.1 257.1 赤霉素53 348.433 347.1 303.1
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