CN111879869B - 一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 - Google Patents
一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN111879869B CN111879869B CN202010678657.9A CN202010678657A CN111879869B CN 111879869 B CN111879869 B CN 111879869B CN 202010678657 A CN202010678657 A CN 202010678657A CN 111879869 B CN111879869 B CN 111879869B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gibberellin
- solution
- sample
- derivatization
- reagent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 title claims abstract description 46
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 title claims abstract description 46
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 40
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 57
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 41
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims abstract description 37
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 28
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 claims abstract description 17
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 claims abstract description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 45
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 26
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 22
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 11
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 10
- NNZGNZHUGJAKKT-UHFFFAOYSA-M 3-bromopropyl(trimethyl)azanium;bromide Chemical group [Br-].C[N+](C)(C)CCCBr NNZGNZHUGJAKKT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 238000007664 blowing Methods 0.000 claims description 9
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 9
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 9
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical class C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical group OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 claims description 6
- PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N acetic acid;hydrate Chemical compound O.CC(O)=O PQLVXDKIJBQVDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000007921 spray Substances 0.000 claims description 5
- RQBBFKINEJYDOB-UHFFFAOYSA-N acetic acid;acetonitrile Chemical group CC#N.CC(O)=O RQBBFKINEJYDOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000000227 grinding Methods 0.000 claims description 4
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 101100121112 Oryza sativa subsp. indica 20ox2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101100121113 Oryza sativa subsp. japonica GA20OX2 gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000009795 derivation Methods 0.000 claims description 3
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 229930195732 phytohormone Natural products 0.000 abstract description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 241000209094 Oryza Species 0.000 description 7
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 240000004507 Abelmoschus esculentus Species 0.000 description 2
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 2
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000088415 Raphanus sativus Species 0.000 description 2
- 235000006140 Raphanus sativus var sativus Nutrition 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 2
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000174556 Phaseolus adenanthus Species 0.000 description 1
- 235000018641 Phaseolus adenanthus Nutrition 0.000 description 1
- 235000005712 Pisum elatius Nutrition 0.000 description 1
- 241000219873 Vicia Species 0.000 description 1
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- DUEPRVBVGDRKAG-UHFFFAOYSA-N carbofuran Chemical compound CNC(=O)OC1=CC=CC2=C1OC(C)(C)C2 DUEPRVBVGDRKAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229930004069 diterpene Natural products 0.000 description 1
- -1 diterpene acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 1
- 230000005078 fruit development Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- UDGSVBYJWHOHNN-UHFFFAOYSA-N n',n'-diethylethane-1,2-diamine Chemical compound CCN(CC)CCN UDGSVBYJWHOHNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000007226 seed germination Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N sodium ethoxide Chemical compound [Na+].CC[O-] QDRKDTQENPPHOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
- G01N30/8679—Target compound analysis, i.e. whereby a limited number of peaks is analysed
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N2030/042—Standards
- G01N2030/045—Standards internal
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/067—Preparation by reaction, e.g. derivatising the sample
Landscapes
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明涉及植物激素测定技术领域，具体涉及一种LC‑MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，包括以下步骤：样品经过液氮处理后，加入同位素内标液和提取液，得到样本提取液，向样本提取液中加入活化试剂和衍生化试剂进行衍生，衍生结束后复溶，制备待测液；然后在特定的色谱条件和质谱条件下采用LC‑MS检测分析，检测方法简单、高效、准确，可在15min内实现11种赤霉素化合物的测定。
Description
技术领域
本发明涉及植物激素测定技术领域，具体涉及一种LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法。
背景技术
赤霉素(gibberellins，GAs)是一类非常重要的植物激素，在植物体内广泛存在，对种子萌发、叶片伸展、茎和根的伸长、花和果实的发育等方面均起到了重要的调控作用。近年来，关于赤霉素的生理学研究受到广泛关注。但是，一方面，赤霉素作为一种内源性激素，在植物体内含量极低，且在不同器官中含量波动较大，使得多种赤霉素的同时定量检测受到限制；另一方面，现发现的赤霉素均为二萜酸，具有相似的化学结构，均含有四个环，仅环上双键和羟基位置和数量不同，如果将赤霉素提取液直接进行LC-MS检测，其离子化效率低，导致其在质谱上的响应信号低，这就会导致许多低含量的赤霉素检测不到。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种简单、高效、准确的赤霉素检测方法，该检测方法可在15min内实现11种赤霉素化合物的测定。
本发明通过以下技术方案来实现上述技术目的：
一种LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：称取液氮研磨得到的植物样本粉末，加入赤霉素的同位素内标液，然后加入提取液提取，得到样本提取液；向样本提取液中加入活化试剂与衍生化试剂进行衍生；衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；
S2，配制一系列不同浓度的赤霉素混标溶液，并加入赤霉素同位素的内标、活化试剂和衍生试剂进行衍生，衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；
S3，高效液相色谱-质谱分析：将步骤S1和S2中的待测液进行上机检测分析；
其中，
高效液相色谱条件：流动相A为含有体积百分比为0.01～5％的乙酸的乙酸-水溶液，流动相B为含有体积百分比为0.01％～5％的乙酸的乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脱方式；
质谱条件：正离子模式和MRM模式；
S4，根据步骤S2中混标的检测结果得到各标品的线性回归方程，将步骤S1中样品的检测结果代入到线性回归方程中计算得到样本中各赤霉素的含量；
步骤S1和S2中所述活化试剂为碱催化剂，所述衍生化试剂为带有季铵基团与卤元素的化学试剂；步骤S1中所用活化试剂与提取液的体积比为(0.5～5)：100；步骤S1中所用衍生化试剂与提取液的体积比为(0.5～5)：100。
在本发明的一种实施方式中，所述活化试剂为三乙醇胺，所述衍生化试剂为3-溴丙基三甲基溴化铵。
在本发明的一种实施方式中，所述提取液为含有体积百分比70～100％乙腈的乙腈液，每50mg植物样本粉末添加500～800μL提取液。
在本发明的一种实施方式中，衍生化反应的条件为60～95℃振荡30～90min。
在本发明的一种实施方式中，所述复溶溶液中含有1～5％甲酸、10～2-％乙腈。
在本发明的一种实施方式中，高效液相色谱的洗脱程序为：0min，A：75％～95％；6min，A：50％～70％；8min，A：50％～20％；10min，A：20～5％，12min，A：75％～95％。
其中，高效液相色谱的洗脱程序为：0min，A：95％；6min，A：50％；8min，A：20％；10min，A：20％，12min，A：95％。
在本发明的一种实施方式中，质谱条件为：采用ESI源，离子喷雾电压：4000-5500eV，离子源温度：400-550℃，去簇电压:20-100eV，碰撞电压:20-100eV。
再本发明的一种实施方式中，所述质谱中离子对信息为：
| Q1 | Q3 | DP | CE | |
| GA1 | 448.3 | 389.2 | 80 | 45 |
| GA15 | 430.1 | 371.1 | 80 | 45 |
| GA20 | 432.4 | 373.2 | 80 | 45 |
| GA29 | 448 | 389 | 80 | 45 |
| GA3 | 446.3 | 387.2 | 80 | 45 |
| GA4 | 432.4 | 373.3 | 80 | 45 |
| GA5 | 430.1 | 371.1 | 80 | 45 |
| GA51 | 432.1 | 373.1 | 80 | 45 |
| GA6 | 446 | 387 | 80 | 45 |
| GA7 | 430.3 | 371.3 | 80 | 45 |
| GA9 | 416 | 357.3 | 80 | 45 |
本发明具有以下有益技术效果：
(1)利用简单常见的提取溶液进行提取，适用于各种植物样本的提取；
(2)利用衍生化试剂进行衍生化处理，能够显著提高赤霉素检测的灵敏度，检测限为0.005ng/mL，且所用的衍生化试剂廉价、易得，成本低；
(3)可在15min内实现11种赤霉素化合物的测定，快速简单、耗费低，适用性强，可以用于不同植物样本中GAs的分析。
附图说明
图1为实施例1中浓度为0ng/mL的空白图谱；
图2为实施例1中浓度为0.1ng/mL的标准品的分离图谱；
图3为实施例1中水稻茎的检测图谱；
图4为实施例1中水稻幼芽的检测图谱；
图5为实施例1中水稻种子的检测图谱；
图6为实施例1中拟南芥幼苗的检测图谱；
图7为实施例1中秋葵幼苗的检测图谱；
图8为实施例1中四季豆种子的检测图谱；
图9为实施例1中野豌豆种子的检测图谱；
图10为实施例1中萝卜根的检测图谱。
具体实施方式
以下结合具体实施方式对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语均属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
所用仪器和试剂
仪器：液质联用仪AB SCIEX QTRAP6500+
试剂：甲酸，色谱纯(Sigma)；甲醇，色谱纯(Merck)；乙腈，色谱纯(Merck)；赤霉素同位素购自捷克Olechemim公司。
一种LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，包括以下步骤：
S1，样品预处理：称取液氮研磨后得到的植物样本粉末，加入赤霉素的同位素内标液，然后加入提取液提取，得到样本提取液；向样本提取液中加入活化试剂与衍生化试剂进行衍生；衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；
本步骤中，植物样本粉末的称取应在低温条件下进行称取且需快速操作，减少外界温度对样本的影响；提取采用震荡提取的方式，提取时间一般控制在15min左右，时间过短则会导致提取不充分、检测结果偏低，影响检测结果的准确性，为了保证提取充分，可以采用重复多次提取的方式进行提取；添加的同位素内标为GA1-d2、GA15-d2、GA20-d2、GA29-d2、GA4-d2、GA5-d2、GA6-d2、GA9-d2，上述同位素内标均购自捷克Olechemim公司,上述同位素内标的终浓度为0.1μg/L；提取结束后，向提取液中同时加入活化试剂和衍生化试剂进行衍生处理，此处所述的“衍生化”是指一种利用化学变换把化合物转化为类似化学结构的物质，样品的衍生化的作用主要是把难于分析的物质转化为与其化学结构相似但易于分析的物质，便于量化和分析。
S2，配制一系列不同浓度的赤霉素混标溶液，并加入赤霉素同位素的内标、活化试剂和衍生试剂进行衍生，衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；本步骤中混标的衍生处理和样本的处理方式相同；
S3，高效液相色谱-质谱分析：将步骤1)和步骤2)中的待测液进行上机检测分析：
其中，
高效液相色谱条件：流动相A为含有体积百分比为0.01～5％的乙酸的乙酸-水溶液，流动相B为含有体积百分比为0.01％～5％的乙酸的乙酸-乙腈溶液，采用梯度洗脱方式；
质谱条件：正离子模式和MRM模式；
本步骤中，高效液相色谱条件中所用的流动相A为含有体积百分比为0.01～5％的乙酸的乙酸-水溶液，流动相B为含有体积百分比为0.01％～5％的乙酸的乙酸-乙腈溶液，其中流动相A和流动相B中乙酸的优选质量百分比为0.04％，流动相中乙酸含量的高低会对物质峰型和响应有影响，其中流动相A中乙酸含量的优选范围是0.01～5％，流动相B中乙酸含量的优选范围是0.01～5％。
S4，根据步骤S2中混标的检测结果得到各标品的线性回归方程，将步骤S1中样品的检测结果代入到线性回归方程中计算得到样本中各赤霉素的含量；
本发明中，步骤S1和步骤S2中所用的活化试剂为碱催化剂，如三乙醇胺、氨水、乙醇钠、吡啶等，所用的衍生化试剂为带有季铵基团与卤元素的化学试剂，如3-溴丙基三甲基溴化铵(购自百灵威)、N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺、N,N-二乙基乙二胺、碘化4-二羟硼基-N,N,N-三甲基苯铵等。申请人经过多次实验比较后得出，当活化试剂选用三乙醇胺(TEA)、衍生化试剂选用3-溴丙基三甲基溴化铵时，各物质的分离效果最佳。
本发明中，所述的提取液为含有70-100％乙腈的乙腈液，在实际操作时，50mg植物样本粉末通常添加500～800μL提取液进行提取操作，为了提取的更充分，可以进行多次重复提取，合并提取液。
本发明中，所用的活化试剂与提取液的体积比(0.5～5)：100。所用的衍生化试剂与提取液的体积比为(0.5～5)：100。其中，当活化试剂、衍生化试剂与提取液的体积比均为(1～2)：100时，最终图谱中各物质的分离效果最佳。需要注意的是：此处所指的提取液的体积是指提取时所用的所有提取液的体积用量，如提取两次，此处所指体积为两次提取所用提取液的总体积。
本发明中，衍生化反应的条件为60～95℃振荡30～90min，优选地为90℃震荡60min，衍生化反应温度过高时，某些物质会变质分解，衍生化反应温度过低时，某些物质会在一定时间内反应不完全，衍生化反应的时间也要合适，当时间过久，某些衍生产物会变质。
本发明中，所用的复溶溶液为含有0.01～0.5％甲酸的乙腈水溶液，其中，优选地，乙腈含量为5～50％，甲酸含量为0.01～0.5％，更优选地，乙腈含量15％，甲酸含量0.1％。
本发明中，高效液相色谱的梯度洗脱程序为：0min，流动相A为75％～95％；6min，流动相A为50％～70％；8min，流动相A为50％～20％；10min，流动相A为20～5％，12min，流动相A为75％～95％，其中，当洗脱程序为0min，流动相A为95％；6min，流动相A为50％；8min，流动相A为20％；10min，流动相A为20％，12min，流动相A为95％时，各物质的分离效果最佳。
本发明中，质谱条件为采用ESI源，正离子MRM模式，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)：4000-5500eV，离子源温度(IonSprayTemperature):400-550℃，去簇电压(DP)DP:20-100eV，碰撞能量(CE):20-100eV，其中优选地为：离子喷雾电压(IonSprayVoltage)：5000eV，离子源温度(IonSprayTemperature):500℃，去簇电压(DP)DP:80eV，碰撞电压(CE):45eV。
本发明中，质谱中离子对信息为：
实施例1
分别取水稻茎、水稻幼芽、水稻种子、拟南芥幼苗、秋葵幼苗、四季豆种子、野豌豆种子、萝卜根适量在液氮下研磨成粉末，按照下述LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法进行检测。
一种LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，包括以下步骤：
样品预处理：在低温条件下，快速准确称取50mg植物样本粉末，迅速加入500μL90％乙腈水，再加入10μL浓度为1μg/L的赤霉素同位素内标液，震荡提取30min，4℃，12000rpm离心10min。移取上清液，残渣重复提取一次，合并上清液，即为样本提取液。将样本提取液与10μLTEA活化试剂与20μL 3-溴丙基三甲基溴化铵衍生试剂混合，90℃振荡1h进行衍生化反应。反应结束后，氮气流吹干，使用100μL乙腈/水/甲酸(体积比150/850/0.1)的溶液复溶，制得待测液。
将赤霉素混标配制0、1、2、5、10、20、100、200、500、1000、2000、5000、10000ng/L一系列浓度，分别取100μL不同浓度的混标，加入10μL浓度为1μg/L的赤霉素同位素内标液，再加入10μL TEA与20μL 3-溴丙基三甲基溴化铵混合，90℃振荡1h进行衍生化反应。反应结束后，氮气流吹干，使用100μL乙腈/水/甲酸(体积比150/850/0.1)的溶液复溶，制得待测液；0ng/L的点不含内标，是用来确定无干扰离子的。空白的图谱如图1所示，100ng/L(也即0.1ng/mL)的图谱如图2所示。
高效液相色谱-质谱分析：将上述待测液进行上机检测分析，参数如下：高效液相色谱：
色谱柱：ACQUITY HSS T3柱；流动相A：含有体积百分比为0.05％的乙酸的乙酸-水溶液；流动相B为含有体积百分比为0.05％的乙酸的乙腈溶液；采用梯度洗脱方式；进样量：5μL，流速：0.35mL/min；柱温为：40℃；梯度洗脱程序如下表1：
表1梯度洗脱程序
| 时间/min | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95％ | 5％ |
| 6 | 50％ | 50％ |
| 8 | 20％ | 80％ |
| 10 | 20％ | 80％ |
| 12 | 95％ | 5％ |
质谱条件：采用ESI离子源，正离子MRM模式，离子喷雾电压(IonSprayVoltage)5000eV，离子源温度(IonSprayTemperature)500℃，气帘气压：35psi，
离子对信息如下表2所示：
表2离子对信息
对得到的色谱图中每个物质的峰面积进行积分，除以与之对应的内标的峰面积，将所得峰面积比值代入标准曲线(如表3)中，计算出浓度，再根据所用的植物样本质量，计算出赤霉素在每克鲜重植物中的含量，单位ng/g鲜重(如表4)，各原料的检测图谱如图3-10所示:
表3分析物的标准曲线
表4 6种实际样本中赤霉素的含量
实施例2
为了验证本方法的准确度，本方法考察了水稻样本的加标回收率，得出回收率在60％～136％；同时，对本方法的日内与日间精密度进行考察，计算各物质的相对偏差在1％～11％之间，证明本方法可靠。具体数据如表5：
表5 0.1μg/L加标量时的稳定性和准确度
对比例1
实验1：在100μL 0.1μg/L的赤霉素混标中分别加入10μL、50μL的3-溴丙基三甲基溴化铵衍生试剂进行实验，其它实验条件保持一致其和实施例1中处理步骤相同。
实验2：采用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)作为衍生化试剂进行实验。具体操作如下：取100μL 0.1μg/L的赤霉素混标，氮气吹干后，加入100μL20mmol/L的EDC试剂，35℃、1000rpm条件下反应90min。反应结束后，12000rpm离心，取上清液上机。
实验1和实验2得出积分结果如下表6所示：
表6不同衍生化试剂对实验结果的影响
通过表6中EDC作为衍生化试剂与3-溴丙基三甲基溴化铵作为衍生化试剂相比得到的积分结果可知，采用EDC作为衍生化试剂得到的结果明显降低。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.一种LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，其特征在于，检测的赤霉素的种类为GA1、GA15、GA20、GA29、GA3、GA34、GA4、GA5、GA51、GA6、GA7、GA9，具体包括以下步骤：
S1，样品预处理：称取液氮研磨得到的植物样本粉末，加入赤霉素的同位素内标液，然后加入提取液提取，得到样本提取液；向样本提取液中加入活化试剂与衍生化试剂进行衍生；衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；所述提取液为含有体积百分比70～100％乙腈的乙腈液；
S2，配制一系列不同浓度的赤霉素混标溶液，并加入赤霉素同位素的内标、活化试剂和衍生试剂进行衍生，衍生结束，经氮吹或冻干后用复溶溶液进行复溶，配制成待测液；步骤S1和S2中所述活化试剂为三乙醇胺，所述衍生化试剂为3-溴丙基三甲基溴化铵；步骤S1中所用三乙醇胺与提取液的体积比为(0.5～5)：100；步骤S1中所用3-溴丙基三甲基溴化铵与提取液的体积比为(0.5～5)：100；衍生化反应的条件为60～95℃振荡30～90min；所述复溶溶液中含有1～5％甲酸、10～20％乙腈；
S3，高效液相色谱-质谱分析：将步骤S1和S2中的待测液进行上机检测分析；
其中，色谱柱为ACQUITY HSS T3柱，高效液相色谱条件：流动相A为含有体积百分比为0.01～5％的乙酸的乙酸-水溶液，流动相B为含有体积百分比为0.01％～5％的乙酸的乙酸乙腈溶液，采用梯度洗脱方式，柱温为：40℃，高效液相色谱的洗脱程序为：0min，A：95％；6min，A：50％；8min，A：20％；10min，A：20％，12min，A：95％；
质谱条件：正离子模式和MRM模式，质谱条件为：采用ESI源，离子喷雾电压：4000-5500eV，离子源温度：400-550℃，去簇电压:20-100eV，碰撞电压:20-100eV；所述质谱中离子对信息为：
；
S4，根据步骤S2中混标的检测结果得到各标品的线性回归方程，将步骤S1中样品的检测结果代入到线性回归方程中计算得到样本中各赤霉素的含量。
2.根据权利要求1所述的LC-MS法测定植物样本中微量赤霉素的方法，其特征在于，每50mg植物样本粉末添加500～800μL提取液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010678657.9A CN111879869B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202010678657.9A CN111879869B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN111879869A CN111879869A (zh) | 2020-11-03 |
| CN111879869B true CN111879869B (zh) | 2023-04-14 |
Family
ID=73150805
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202010678657.9A Active CN111879869B (zh) | 2020-07-15 | 2020-07-15 | 一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN111879869B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112666283B (zh) * | 2020-12-11 | 2021-12-14 | 上海鹿明生物科技有限公司 | 一种植物激素定量检测试剂盒及其检测方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106706826A (zh) * | 2015-11-18 | 2017-05-24 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种毫克级植物中植物激素的分析方法 |
| CN109917054A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-06-21 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种提高农作物样本中赤霉素检测灵敏度的方法 |
-
2020
- 2020-07-15 CN CN202010678657.9A patent/CN111879869B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106706826A (zh) * | 2015-11-18 | 2017-05-24 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种毫克级植物中植物激素的分析方法 |
| CN109917054A (zh) * | 2019-02-22 | 2019-06-21 | 嘉兴迈维代谢生物科技有限公司 | 一种提高农作物样本中赤霉素检测灵敏度的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Spatial Profiling of Gibberellins in a Single Leaf Based on Microscale Matrix Solid-Phase Dispersion and Precolumn Derivatization Coupled with Ultraperformance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry;Ting Deng 等;《Analytical Chemistry Article》;20170807;第89卷;第9537-9543页 * |
| 反相高效液相色谱分析赤霉素GA3含量;朱曙东 等;《药学学报》;19931231;第28卷(第10期);第788-791页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN111879869A (zh) | 2020-11-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Niu et al. | Simultaneous quantitative determination of major plant hormones in pear flowers and fruit by UPLC/ESI-MS/MS | |
| CN106053703B (zh) | 一种同时检测食品中多种植物生长调节剂的方法 | |
| Luo et al. | Sensitive determination of brassinosteroids by solid phase boronate affinity labeling coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| Jiang et al. | Determination of thirteen acidic phytohormones and their analogues in tea (Camellia sinensis) leaves using ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry | |
| CN113030331B (zh) | 一种植物中氯虫苯甲酰胺的检测方法 | |
| CN113376298A (zh) | 一种快速测定大米中4种农药残留量的方法 | |
| CN111879869B (zh) | 一种lc-ms法测定植物样本中微量赤霉素的方法 | |
| CN107356689A (zh) | 一种烟草中12种Amadori化合物的测定方法 | |
| CN109270180A (zh) | 土壤中抗生素的检测方法 | |
| CN113917044B (zh) | 气相色谱-串联质谱定量分析烟叶11种酰胺生物碱方法 | |
| CN106248837B (zh) | 一种谷物中伏马毒素的液相色谱串联质谱检测方法 | |
| CN103123345A (zh) | 一种快速检测土壤中的苯氧乙酸类除草剂的方法 | |
| CN113466356A (zh) | 牛乳中农药残留含量测定的样品前处理及检测方法 | |
| CN109900833B (zh) | 番茄中海藻糖-6-磷酸含量的超高效液相色谱串联质谱检测方法 | |
| CN112986476B (zh) | 一种蔬菜和水果中络氨铜残留量的测定方法 | |
| CN108132309B (zh) | 一种测定铁皮石斛中噻菌铜残留量的分析方法 | |
| CN112229928B (zh) | 一种同时定量植物样本中多种植物激素的方法 | |
| CN103776934A (zh) | 一种苯菌酮残留量的测定方法 | |
| CN106970178B (zh) | 一种基于疏水离子交换固相萃取的卷烟主流烟气中烟草特有n-亚硝胺的提取及测定方法 | |
| CN105606740A (zh) | 一种烟草及烟草制品中马来酰肼残留量的检测方法 | |
| CN112666283A (zh) | 一种植物激素定量检测试剂盒及其检测方法和应用 | |
| CN111965276A (zh) | 一种节瓜中多杀菌素a、多杀菌素d、噻虫胺、噻虫嗪的残留量检测方法 | |
| CN111239295A (zh) | 分散固相萃取结合液相色谱串联质谱检测增产胺的方法 | |
| CN110261511A (zh) | 一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法 | |
| CN110618212B (zh) | 一种同时检测蔬菜中多种植物生长调节剂残留量的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |