CN110261511A - 一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法 - Google Patents

一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，采用酸化甲醇快速提取黄瓜中宁南霉素，PSA去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质，用正己烷净化脂类物质，再采用液相色谱串联质谱检测进行测定。反应迅速，缩短检测时间。且减少了有机试剂的使用，对环境更友好。与其他检测方法相比，本方法筛选采用新的检测离子对，离子比例合理，响应更灵敏，结果准确度更高，重现性更好，更能满足实验室相关规定的要求。

Description

一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法
技术领域
本发明属于农药残留测定领域，涉及一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法。
背景技术
宁南霉素是中国科学院成都生物研究所历经七五、八五、九五国家科技攻关并研制成功的专利技术产品，这种菌是在四川省宁南县土壤分离而得，为首次发现的胞嘧啶核苷肽型新抗生素，故将其发酵产物命名为宁南霉素。宁南霉素属于胞嘧啶核苷肽类农用抗生素，是一种低毒、低残留、无“三致”和蓄积问题，不污染环境的新农药。另外，由于宁南霉素采用纯天然粮食为原料，经多重发酵所得，所以富含多种氨基酸和微量元素，对植物有调节生长的功能，明显提高农产品品质。由于宁南霉素产品专利于2013年到期，预计今后生产厂家会越来越多，其产能会有显著提升，但是应用开发滞后严重，所以竞争压力会突然增大。
国家标准《GB 2763-2016食品中农药最大残留限量》制定了食品中宁南霉素的管控限值，但未提供相应的检测方法。本发明提供了黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，为准确的测量宁南霉素在其他农产品残留量提供一些思路。
发明内容
为食品中宁南霉素的检测问题，本发明提出一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，步骤简便，缩短检验时间，结果重现性好。
本发明提出一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
A、提取：称取10g样品于试管中，加入20mL pH＝4.5的酸化甲醇，震荡提取15min，8000r/min离心10min，取上层清夜10mL于另一试管，在40℃用氮气吹至近干，准确加入1.00mL0.2％甲酸水进行复溶得到提取液，待净化；
B、净化：将复溶后的提取液转移至另一干净离心管中，加入1mL正己烷和100mgPSA(N-丙基乙二胺固相吸附剂)，涡旋混匀1min，将离心管用5000r/min离心5min，弃去上层液体，取下层液体过0.22um滤膜，得到待测样品溶液；
C、标准曲线配制：准确吸取100μL浓度为1000mg/L的宁南霉素标准工作液用甲醇定容至1mL，逐步稀释，用流动相稀释至以下浓度曲线点：0.025mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L，1mg/L，得到系列浓度的宁南霉素标准工作液；
D、将步骤B制得的待测样品溶液与步骤C制得的系列浓度的宁南霉素标准工作液注入液相色谱仪，且经串联质谱仪进行检测；
E、设置液相色谱仪的测试条件为：
流动相为水相：有机相＝0.2％甲酸+2mmol乙酸铵：甲醇；
流速为0.2mL/min；色谱柱为C18色谱柱；柱温为30℃，进样量为5μL；
F、设置质谱仪的测试条件为：
离子源为ESI，正离子模式；扫描模式为多反应监测MRM；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；干燥气温度为250℃；干燥气流速为10L/min；雾化器压力为45psi；毛细管电压为4000V；电子倍增器EMV的电压为200V。
作为本发明的优选方案，所述酸化甲醇为通过加入乙酸调节pH进行酸化。
作为本发明的优选方案，步骤E中液相色谱仪的梯度洗脱程序为：0～0.5min，90％水相，10％有机相；0.5～0.6min，水相降至10％，有机相升至90％；0.6～3.9min，10％水相，90％有机相；3.9～4.0min，水相升至90％，有机相降至10％；4.0～6.0min，90％水相，10％有机相。
作为本发明的优选方案，步骤E中所述C18色谱柱为ZORBAX-C18，规格为1.8um，2.1*50mm。
作为本发明的优选方案，步骤F中设定宁南霉素的监测离子对参数：母离子为444.2，子离子为333.2/315.2；驻留时间为200ms；去簇电压为131eV；碰撞能9/13；保留时间1.71。
本发明的有益效果：
1、本发明针对宁南霉素相对不稳定的特点，采用有机试剂快速提取，PSA去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质,用正己烷净化脂类物质，再采用液相色谱串联质谱检测，反应迅速，缩短检测时间。
2、减少了有机试剂的使用，对环境更友好。
3、与其他检测方法相比，本方法筛选采用新的检测离子对，离子比例合理，响应更灵敏，结果准确度更高，重现性更好，更能满足实验室相关规定的要求。
附图说明
图1为宁南霉素标准工作液的色谱图。
图2为宁南霉素标准工作液提取离子流图。
图3为宁南霉素标准工作液的二级质谱图。
具体实施方式
如下结合附图，对本申请方案作进一步描述：
一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，包括以下步骤：
A、提取：称取10g黄瓜样品于试管中，加入20mL pH＝4.5的酸化甲醇，震荡提取15min，8000r/min离心10min，取上层清夜10mL于另一试管，在40℃用氮气吹至近干，准确加入1.00mL0.2％甲酸水进行复溶得到提取液，待净化；
B、净化：将复溶后的提取液转移至另一干净离心管中，加入1mL正己烷和100mgPSA(N-丙基乙二胺固相吸附剂)，涡旋混匀1min，将离心管用5000r/min离心5min，弃去上层液体，取下层液体过0.22um滤膜，得到待测样品溶液；
C、标准曲线配制：准确吸取100μL浓度为1000mg/L的宁南霉素标准工作液用甲醇定容至1mL，逐步稀释，用流动相稀释至以下浓度曲线点：0.025mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L，1mg/L，得到系列浓度的宁南霉素标准工作液；
D、将步骤B制得的待测样品溶液与步骤C制得的系列浓度的宁南霉素标准工作液分别注入液相色谱仪，且经串联质谱仪进行检测；
E、设置液相色谱仪的测试条件为：
流动相为水相：有机相＝0.2％甲酸+2mmol乙酸铵：甲醇；
流速为0.2mL/min；
色谱柱为C18色谱柱ZORBAX-C18，规格为1.8um，2.1*50mm；
柱温为30℃，
进样量为5μL。
梯度洗脱程序如下表1进行：
表1梯度洗脱程序
F、设置质谱仪的测试条件为：
离子源为ESI，正离子模式；扫描模式为多反应监测MRM；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；干燥气温度为250℃；干燥气流速为10L/min；雾化器压力为45psi；毛细管电压为4000V；电子倍增器EMV的电压为200V。
宁南霉素的监测离子对参数如下表2
表2宁南霉素的监测离子对参数
注：“*”表示定量子离子。
G、色谱测定与确证
根据黄瓜样品中宁南霉素的含量情况，选择浓度相近的标准工作液进行色谱分析，以峰面积进行外标曲线定量。标准工作液的色谱图参见图1、提取离子流图参见图2。
H、按照上述条件测定待测样品和标准工作液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准工作液的时间偏差在±2.5％之内；定性离子对的相对丰度与相当浓度的标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断样品中存在相应的被测物。标准工作液的二级质谱图参见图3。
表3定性时相对离子丰度最大容许误差
相对丰度(基峰) >50％ >20％至50％ >10％至20％ ≤10％
允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％
I、空白实验
空白溶液除不加样品外，均按上述测定步骤进行。
J、结果计算
按色谱数据处理软件中的外标曲线定量或按式(1)计算样品中宁南霉素的残留量：
式中：
X——样品中目标化合物的残留量，单位为mg/kg；
A——样液中目标化合物的峰面积；
V——最终定容体积，单位为mL；
As——标准工作液中目标化合物的峰面积；
C——标准工作液中目标化合物的浓度，单位为ug/mL；
M——称样量，单位为g。
注：计算结果须扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示。
K、定量限
本方法中宁南霉素在黄瓜中的定量限为0.01mg/kg。满足了实验室相关规定的要求。
L、回收率
宁南霉素在黄瓜中不同添加浓度加标试验中的回收率参见表4。
表4：黄瓜中不同添加浓度加标试验中的回收率
本方案针对宁南霉素相对不稳定的特点，采用有机试剂快速提取，PSA去除样品基质中的有机酸、色素和糖类杂质,用正己烷净化脂类物质，再采用液相色谱串联质谱检测，反应迅速，缩短检测时间。且减少了有机试剂的使用，对环境更友好。与其他检测方法相比，本方法筛选采用新的检测离子对，离子比例合理，响应更灵敏，结果准确度更高，重现性更好，更能满足实验室相关规定的要求。
上述优选实施方式应视为本申请方案实施方式的举例说明，凡与本申请方案雷同、近似或以此为基础作出的技术推演、替换、改进等，均应视为本专利的保护范围。

Claims (5)

1.一种黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、提取：称取10g样品于试管中，加入20mL pH＝4.5的酸化甲醇，震荡提取15min，8000r/min离心10min，取上层清夜10mL于另一试管，在40℃用氮气吹至近干，准确加入1.00mL0.2％甲酸水进行复溶得到提取液，待净化；
B、净化：将复溶后的提取液转移至另一干净离心管中，加入1mL正己烷和100mgPSA，涡旋混匀1min，将离心管用5000r/min离心5min，弃去上层液体，取下层液体过0.22um滤膜，得到待测样品溶液；
C、标准曲线配制：准确吸取100μL浓度为1000mg/L的宁南霉素标准工作液用甲醇定容至1mL，逐步稀释，用流动相稀释至以下浓度曲线点：0.025mg/L，0.05mg/L，0.1mg/L，0.2mg/L，0.4mg/L，0.6mg/L，0.8mg/L，1mg/L，得到系列浓度的宁南霉素标准工作液；
D、将步骤B制得的待测样品溶液与步骤C制得的系列浓度的宁南霉素标准工作液注入液相色谱仪，且经串联质谱仪进行检测；
E、设置液相色谱仪的测试条件为：
流动相为水相：有机相＝0.2％甲酸+2mmol乙酸铵：甲醇；
流速为0.2mL/min；色谱柱为C18色谱柱；柱温为30℃，进样量为5μL；
F、设置质谱仪的测试条件为：
离子源为ESI，正离子模式；扫描模式为多反应监测MRM；鞘气温度为350℃；鞘气流速为11L/min；干燥气温度为250℃；干燥气流速为10L/min；雾化器压力为45psi；毛细管电压为4000V；电子倍增器EMV的电压为200V。
2.根据权利要求1所述的黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，所述酸化甲醇为通过加入乙酸调节pH进行酸化。
3.根据权利要求1所述的黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤E中液相色谱仪的梯度洗脱程序为：0～0.5min，90％水相，10％有机相；0.5～0.6min，水相降至10％，有机相升至90％；0.6～3.9min，10％水相，90％有机相；3.9～4.0min，水相升至90％，有机相降至10％；4.0～6.0min，90％水相，10％有机相。
4.根据权利要求1所述的黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤E中所述C18色谱柱为ZORBAX-C18，规格为1.8um，2.1*50mm。
5.根据权利要求1所述的黄瓜中宁南霉素残留量的液相色谱串联质谱检测方法，其特征在于，步骤F中设定宁南霉素的监测离子对参数：母离子为444.2，子离子为333.2/315.2；驻留时间为200ms；去簇电压为131eV；碰撞能9/13；保留时间1.71。
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