CN103776934A

CN103776934A - 一种苯菌酮残留量的测定方法

Info

Publication number: CN103776934A
Application number: CN201410053103.4A
Authority: CN
Inventors: 崔淑华; 张晓梅; 郭庆龙; 王兴华; 秦良勇; 刘润珠
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-02-17
Filing date: 2014-02-17
Publication date: 2014-05-07

Abstract

本发明公开了一种苯菌酮残留量的测定方法，用乙腈或1%乙酸乙腈均质提取样品中残留的苯菌酮，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷键合相（C₁₈）基质分散净化后，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用空白基质溶液稀释标准建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为80.2%～94.9%，平均相对标准偏差（RSD）为4.0%～6.8%，检出限低于0.10μg/kg，具有操作简便、快速、灵敏度高、重复性好、定性定量准确的优点。能满足欧盟、美国、韩国、日本等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种苯菌酮残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种苯菌酮残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量测定蔬菜、水果和小麦等谷类作物中残留的苯菌酮含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

白粉病俗称白毛病，是一种广泛发生的世界性病害，病原菌主要通过气流传播，具有潜育期段、再侵染频繁、流行性强、抗性发展快等特点，对我国蔬菜（如茄子、西红柿等）、水果（如葡萄、柑橘等）和粮谷作物（如小麦、大麦等）为害严重，每年对蔬菜、水果和谷类作物等农业生产造成重大的经济损失。

在白粉病综合治理体系中通常使用抗病品种和高效药剂。白粉病病原菌对人类的挑战就是其具有很强的发展危险的抗药基因型的能力，而使原有防治措施无效。白粉病有很多特性可以快速适应环境，如世代期短，潜在的性重组，可以在空中传播等。因此，寻找新型有效的杀菌剂来对抗白粉病具有重要意义。

苯菌酮（metrafenone，CAS220899-03-6），化学名称为（3-溴-6-甲氧基-2-甲基苯基）-（2,3,4-三甲氧基-6-甲基苯基）甲酮，是由巴斯夫公司开发的一种新颖的二苯酮类新型杀菌剂，是植物化学保护领域中一种全新的活性成分，商品名称为Flexity，结构式为：

苯菌酮从2003年开始在英国、荷兰等多个国家获得登记，对各类白粉病有保护、治疗、铲除和抑制产孢的作用，与目前已知的商品化杀菌剂的作用机制不同。苯菌酮的作用机制是干扰菌丝发育，干扰极性生长和细胞极性的建立和维持过程，影响调节细胞骨架肌动蛋白合成的通路。低质量浓度的苯菌酮即可强烈抑制病原菌孢子萌发。

随着苯菌酮的登记、推广和使用，作为我国蔬菜、水果及其他农产品主要出口市场的欧盟、韩国和日本等均对其制定了残留限量标准。欧盟规定苯菌酮在大多数水果、蔬菜和谷类作物中的最大允许残留量（MRL）为0.05mg/kg；美国规定苯菌酮在很多水果、蔬菜和谷类作物中的最大允许残留量（MRL）为0.04～2.5mg/kg；韩国除规定苯菌酮在桃、李、杏、樱桃中MRL为0.3mg/kg，在蓝莓、葡萄干中MRL为1.0mg/kg，在玉米、黑麦、小麦、核桃等坚果、马铃薯、姜中MRL为0.05mg/kg；日本规定苯菌酮最大允许残留限量（MRL）分别为黑麦（3.0mg/kg）、茄子（3.0mg/kg）、姜（3.0mg/L）、小麦（0.2mg/kg），其余均实行0.01mg/L的“一律标准”。

迄今为止，未见国内外有关于食品中苯菌酮残留量检测方法的报道，因此建立简便、快速、能准确定性和定量分析蔬菜、水果和小麦等谷类作物中苯菌酮残留量检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔬菜、水果和谷类作物中苯菌酮残留量的测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种苯菌酮残留量的测定方法，包括如下步骤：

（1）提取

称取粉碎样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质或振荡超声提取后，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠，剧烈涡旋1min后离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22μm有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在0.5～100μg/L范围内，配制至少5个浓度的苯菌酮系列浓度标准工作液。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中苯菌酮的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中苯菌酮含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中苯菌酮残留量。若上机溶液中苯菌酮残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液稀释至线性范围之内。

步骤（1）中样品若为脱水果蔬，需降低称样量，脱水果蔬和谷类作物提取前均须加适量水充分浸润。

步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水。

步骤（1）中样品若为谷类作物，提取后需将提取液置于-18℃冰箱中冷冻20min以上，离心后分取1.5～2mL提取液于2.0mL离心管中，以不低于12000r/min的速度冷冻离心10min。

步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。

步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈，流速0.2-0.4mL/min，进样量5μL。

步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱程序为：

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	60-80	20-40
2	1.0	2-8	92-98
				3	5.0	2-8	92-98
4	5.1	60-80	20-40
				5	11.0	60-80	20-40

A和B的%是体积比例。

步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱（ESI）检测，电喷雾电压为+3500至+4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，苯菌酮的母离子为408.9～409.3，子离子分别为208.7～209.1和226.6～227.0。

步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当的空白基质标准溶液的离子相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜、水果和小麦中苯菌酮定性确证和定量检测，平均回收率为80.2%～94.9%，平均相对标准偏差（RSD）为4.0%～6.8%，检出限低于0.10μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足韩国、日本、欧盟等国家对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为浓度为5.0ng/mL的苯菌酮多反应监测色谱图。

图2为茄子空白样品的多反应监测色谱图。

图3为小麦空白样品的多反应监测色谱图。

图4为以面粉为基质配制的苯菌酮标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器（IKA，Germany）；CR21GⅢ离心机（日立，Japan）；MS3基本型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附剂（40～60μm）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）净化剂（40～60μm）均购于美国安捷伦科技有限公司。

试剂：乙腈（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度≥99.5%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

实施例1：茄子中苯菌酮残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的茄子10.0g于50mL离心管中，准确加入20mL乙腈，均质提取1min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取1mL乙腈提取液转移至装有150mg无水硫酸镁、50mg C₁₈和25mg PSA的离心管中，涡旋1min，7000r/min离心5min。取上清液过0.22μm滤膜后，待测定。

（2）标准工作溶液的配制

准确称取25±0.1mg标准品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0μg/mL标准中间液；称取10g茄子空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成0.5、1、2、5、10、20、50、100ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行苯菌酮含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中苯菌酮的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中苯菌酮含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中苯菌酮残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，Eclipse plus C₁₈，2.1mm×100mm，粒径3.5μm；

流动相：（A）水（含5mmol/L乙酸铵）；（B）乙腈；

流速：0.3mL/min；

进样量：5μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

序号	时间（min）	A（%）	B（%）
				1	0	70	30
2	1.0	5	95
				3	5.0	5	95
4	5.1	70	30
				5	11.0	70	30

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；

电喷雾电压：+4000V；

雾化气压力：275.9kPa；

干燥气：氮气，350℃，流速为10.0L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：

对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3实施例1中茄子空白基质中苯菌酮的标准曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				苯菌酮Metrafenone	5.14	Y=2614.9X-769.34	0.9999

加标回收率和重复性：

在不含苯菌酮的茄子中加入10、20、50和3000μg/kg4个浓度水平的苯菌酮标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。3000μg/kg添加浓度的样品待测液用乙腈稀释20倍后再用LC-MS/MS测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在4个加标水平上，苯菌酮的平均回收率为84.6%～94.9%，平均相对标准偏差（RSD）为4.1%～5.8%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4实施例1中苯菌酮的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的苯菌酮基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（茄子的浓缩倍数为0.5倍）计算检出限，苯菌酮的检出限为0.058μg/kg。

实施例2：小麦中苯菌酮残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的小麦（研磨成面粉）5.0g于50mL离心管中，加入10mL水复苏30min后，准确加入20mL1%乙酸乙腈，振荡提取30min，超声提取3min，加入3g无水硫酸镁、2g乙酸钠和2mL水，涡旋1min后，将离心管置于-18℃冰箱中冷冻30min，以7000r/min冷冻离心5min后，分取1.5～2mL提取液于2.0mL离心管中，以不低于12000r/min的速度冷冻离心10min。离心后，取2mL乙腈提取液转移至装有300mg无水硫酸镁、100mg C₁₈和50mg PSA的离心管中，涡旋1min，7000r/min离心5min，过0.22μm滤膜于棕色进样小瓶，待LC-MS/MS测定。

（2）标准工作溶液的配制

称取5g小麦（研磨成面粉）空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，过膜后用其稀释配制0.5、1、2、5、10、20、50、100ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

操作步骤、色谱和质谱条件与上述茄子样品中苯菌酮的测定一致。

定性鉴定：

同上述茄子样品中苯菌酮的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为

Y=2429.1X-673.47，相关系数为0.9999。

加标回收率和重复性：

在不含苯菌酮的小麦（研磨成面粉）中加入10、20、50和3000μg/kg4个浓度水平的苯菌酮标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，3000μg/kg添加浓度的样品待测液用1%乙酸乙腈稀释20倍后再用LC-MS/MS测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表5。由表5可以看出，在4个加标水平上，苯菌酮的平均回收率为80.2%～85.6%，平均相对标准偏差（RSD）为4.0%～6.8%，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表5实施例2中苯菌酮的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的苯菌酮基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（小麦的浓缩倍数为0.25倍）计算检出限，苯菌酮的检出限为0.10μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取

（2）净化

（3）标准工作溶液的配制

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中苯菌酮的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中苯菌酮含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中苯菌酮残留量；若上机溶液中苯菌酮残留量超过线性范围上限，需用提取溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

2.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中样品若为脱水果蔬，需降低称样量，脱水果蔬和谷类作物提取前均须加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时加入乙酸钠盐析；含水量较少的样品盐析时需加入一定量的水；样品若为谷类作物，提取后需将提取液置于-18℃冰箱中冷冻20min以上，离心后分取1.5～2mL提取液于2.0mL离心管中，以不低于12000r/min的速度冷冻离心10min。

4.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为150mg、50mg和25mg。

5.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈。

6.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

序号时间（min） A（%） B（%） 1 0 60-80 20-40 2 1.0 2-8 92-98 3 5.0 2-8 92-98 4 5.1 60-80 20-40 5 11.0 60-80 20-40

7.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈。

8.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500至+4500V，雾化气压力为275.9kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350℃，干燥气流速为10.0L/min。

9.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，苯菌酮的母离子为408.9～409.3，子离子分别为208.7～209.1和226.6～227.0。

10.根据权利要求1所述的一种苯菌酮残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中检测样液和基质标准工作溶液时，若样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。