CN103412077A

CN103412077A - 一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法

Info

Publication number: CN103412077A
Application number: CN2013102932805A
Authority: CN
Inventors: 崔淑华; 郭庆龙; 范昆; 王松; 辛学谦; 王建华; 王境堂
Original assignee: 崔淑华
Current assignee: Qingdao Harrens QAU Inspection Testing Co Ltd
Priority date: 2013-07-14
Filing date: 2013-07-14
Publication date: 2013-11-27
Anticipated expiration: 2033-07-14
Also published as: CN103412077B

Abstract

本发明公开了一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，用乙腈或1%乙酸乙腈均质提取样品中残留的吲唑磺菌胺，提取液经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）和十八烷基硅烷键合相（C₁₈）基质分散净化后，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测，采用空白基质溶液稀释标准建立校正的标准曲线，外标法定量。本方法平均回收率为84.2%～91.4%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～6.6%，检出限为1.53μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足欧盟、美国、韩国、日本和台湾等国家对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，更具体地说是采用高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定性定量测定蔬菜和水果及其制品中残留的吲唑磺菌胺含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

近年来，我国农产品出口增长迅速，已成为我国对外贸易的重要组成部分。其中，蔬菜出口量已跃居世界第一，水果生产和出口也位居世界前列。但随着蔬菜和水果种植面积的不断扩大和复种指数的提高，病虫害的发生和危害程度也逐年加重。卵菌纲真菌是一种重要的植物病原菌，包括腐霉菌、疫霉菌、霜霉菌、白锈菌等致病菌，可引发植物猝倒病，瓜果腐烂病，马铃薯、番茄晚疫病，葡萄、瓜类霜霉病及十字花科白锈病等多种病害。卵菌纲真菌对寄主植物的破坏性强，危害性大，由它引起的植物病害大多难以控制。目前，喷施化学农药是控制卵菌病害的最主要手段，但卵菌纲真菌已对甲霜灵、苯霜灵、乙磷铝、霜霉威、霜脲氰等常规防治药剂产生了很严重的抗药性，应用受到了很大的限制。

吲唑磺菌胺（Amisulborum）是日本日产化学公司创制的新型杀菌剂，化学名称为3-（3-溴-6-氟-2-甲基吲哚-1-基磺酰）-N,N-二甲基-1,2,4-三唑-1-磺酰胺，属三唑磺酰胺类杀菌剂。纯品为固体物，熔点128.0～130.0℃，蒸气压1.8×10^-8Pa（25℃）。水中溶解度0.11 mg/L（20℃）。该杀菌剂结构新颖独特，具有独特的作用方式，与甲霜灵及其它杀菌剂无交互抗性，而且具有很好的持效活性，耐雨水冲淋，对作物安全，对人、野生动物和环境安全，是应用前景很好的卵菌纲杀菌剂。

随着吲唑磺菌胺的登记、推广和使用，作为我国蔬菜和水果主要出口市场的日本、美国、欧盟和韩国等国家均对其制定了残留限量标准，规定其在多种蔬菜和水果中的最大允许残留量为0.01～3 mg/kg，但目前国内外未见对吲唑磺菌胺残留检测方法的报道。因此，建立蔬菜和水果及其制品中吲唑磺菌胺残留量的检测方法具有很重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种蔬菜和水果及其制品中吲唑磺菌胺残留量的测定方法。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，包括如下步骤：

（1）提取

称取果蔬样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1 min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠和水，振荡离心。

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22 μm 有机相滤膜。

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在2～100 μg/L范围内，配制至少三个浓度的吲唑磺菌胺系列浓度标准工作液。

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将步骤（3）中的各浓度梯度的标准工作液进行LC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤（2）中净化后的样品液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中吲唑磺菌胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中吲唑磺菌胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中吲唑磺菌胺残留量。

步骤（1）中果蔬样品若为脱水样品，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时需加入乙酸钠盐析。

步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为100 mg、50 mg和25 mg。

步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈，流速0.2-0.4 mL/min，进样量10 μL。

步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

A和B的%是体积比例。

步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈，柱温为30℃。

步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500V，雾化气压力为275.9 kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10.0 L/min。

步骤4中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，吲唑磺菌胺的母离子467.3～467.7，子离子分别为228.5～228.9和107.4～107.9。

步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当空白基质标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合HPLC-MS/MS应用于蔬菜和水果及其制品中吲唑磺菌胺定性确证和定量检测，平均回收率为84.2%～91.4%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～6.6%，检出限为1.53 μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足欧盟、美国、韩国、日本和台湾对相应产品安全检测的技术要求，将为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为以调味酱为基质，浓度为50.0 ng/mL的吲唑磺菌胺多反应监测色谱图。

图2为调味酱空白样品的多反应监测色谱图。

图3为以调味酱为基质配制的吲唑磺菌胺标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18 Basic均质器（IKA，Germany）；5810R离心机（Eppendorf，Germany）；MS3基本型旋涡混合器（IKA，Germany）；1200快速高效液相色谱-6430三重四极杆质谱仪（Agilent，USA）；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）吸附剂（40～60 μm）、十八烷基硅烷键合相（C₁₈）净化剂（40～60 μm）均购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂：乙腈（HPLC级，Merke，Germany）；乙酸铵（HPLC级，CNW，Germany）；无水硫酸镁和氯化钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度为99.7%，购自Sigma公司。

实施例1：调味酱中吲唑磺菌胺残留量的检测

（1）样品前处理

称取经充分混匀的调味酱10.0 g于50 mL离心管中，准确加入20 mL乙腈，均质提取1 min，加入3 g无水硫酸镁和2 g氯化钠，5000 r/min离心5 min。离心后，取2 mL乙腈提取液转移至装有200 mg无水硫酸镁、100 mg C₁₈和50 mg PSA的离心管中，涡旋1 min，5000 r/min离心3 min。取上清液过0.22 μm滤膜后，待测定。

（2）标准工作溶液的配制

准确称取25±0.1 mg标准品于25 mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0 μg/mL标准储备液；移取1.0 mL标准储备液置于100 mL容量瓶中，用乙腈定容得到10.0 μg/mL标准中间液；称取10 g调味酱空白样品，通过上述前处理步骤制备空白基质溶液，将标准中间液用空白基质溶液稀释配制成10、20、50、100、200、500、1000 ng/mL系列标准工作溶液，将标准工作液进LC-MS/MS分析，以所得峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线。

（3）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入LC-MS/MS，以外标法进行吲唑磺菌胺含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准曲线；在相同条件下将样品提取液注入LC-MS/MS进行测定，测得样品液中吲唑磺菌胺的色谱峰面积，代入标准曲线，得到样品液中吲唑磺菌胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中吲唑磺菌胺残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：Agilent，Eclipse plus C₁₈，2.1 mm×100 mm，粒径1.8 μm；

流动相：（A）水（含5 mmol/L乙酸铵）；（B）乙腈；

流速：0.3 mL/min；

进样量：10 μL；

柱温：30℃；

梯度洗脱程序如表1。

表1：实施例1的梯度洗脱程序

其中，质谱参数为：

扫描方式：多反应离子监测（MRM）扫描；

电喷雾电压：+3500V；

雾化气压力：275.9 kPa；

干燥气：氮气，350 ℃，流速为10.0 L/min；

MRM检测参数见表2。

表2：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：对于农药的母离子和子离子对，在相同的条件下，如果试样中的离子色谱峰与空白基质标准工作溶液一致（变化范围在±2.5%之内）；样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表3。

表3调味酱空白基质中吲唑磺菌胺的标准曲线

名称	保留时间（min）	回归方程	相关系数
				吲唑磺菌胺	3.79	Y=109.59X+42.138	0.9995

加标回收率和重复性：

在不含吲唑磺菌胺的调味酱中加入3个浓度水平的吲唑磺菌胺标准溶液，然后分别进行前处理待农药添加30 min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，吲唑磺菌胺的平均回收率为84.2%～91.4%，平均相对标准偏差（RSD）为3.7%～6.6%，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表4吲唑磺菌胺的回收率和重复性（n=6）

检出限：

将不同浓度的吲唑磺菌胺基质标准工作溶液注入LC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数（调味酱的浓缩倍数为0.5倍）计算检出限，吲唑磺菌胺的检出限为1.53 μg/kg。

实际样品测定：

使用该检测方法对出口韩国的冷冻辣椒、辣椒酱、调味酱、青椒丁、市售黄瓜、葡萄等100多个样品进行了检测，均未检出吲唑磺菌胺残留。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）提取

称取果蔬样品于具塞离心管中，加入乙腈或1%乙酸乙腈均质提取1 min，加入无水硫酸镁、氯化钠或乙酸钠和水，振荡离心；

（2）净化

移取样品提取液上清液于离心管中，加入基质分散固相萃取剂，涡旋振荡，离心，吸取上清液过0.22 μm 有机相滤膜；

（3）标准工作溶液的配制

将空白样品按上述步骤（1）、（2）处理，用该空白样品基质溶液在2～100 μg/L范围内，配制至少三个浓度的吲唑磺菌胺系列浓度标准工作液；

（4）液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定

2.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中果蔬样品若为脱水样品，需降低称样量，并加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（1）中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用1%乙酸乙腈提取时需加入乙酸钠盐析。

4.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（2）中基质分散固相萃取剂由无水硫酸镁、C₁₈和PSA组成，每体积提取液中无水硫酸镁、C₁₈和PSA加入量分别为100 mg、50 mg和25 mg。

5.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的流动相为A：含5 mmol/L乙酸铵的水溶液，流动相B：乙腈。

6.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱使用梯度洗脱的方法，梯度洗脱的程序为：

Figure 2013102932805100001DEST_PATH_IMAGE002

根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中液相色谱的色谱柱填料为C₁₈。

7.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用电喷雾质谱检测，电喷雾电压为+3500V，雾化气压力为275.9 kPa，干燥气为氮气，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10.0 L/min。

8.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中质谱检测使用多反应监测（MRM）扫描模式，吲唑磺菌胺的母离子为467.3～467.7，子离子分别为228.5～228.9和107.4～107.9。

9.根据权利要求1所述的一种吲唑磺菌胺残留量的测定方法，其特征在于，步骤（4）中检测所述滤液中农药的母离子和子离子对，若其离子色谱峰保留时间与标准工作溶液一致；且滤液（样品）中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度相当空白基质标准溶液的相对丰度偏差不超过30%时，则判断该样品中存在该种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。