CN109991339A - 一种测定微量植物样品中内源激素的样品预处理方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定微量植物样品中内源激素的样品预处理方法。所述样品预处理方法包括如下步骤:在超声波辐射下,采用破壁酶提取植物样品中内源激素,植物样品为新鲜或干燥的植物组织、器官或它们的切片;破壁酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和离析酶中的至少一种,内源激素为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸及其衍生物和水杨酸及其衍生物中至少一种。本发明具有如下优点:1、利用超声辅助酶解原理,不粉碎或研磨植物样品而直接提取内源激素,提取条件温和、操作简单、快速;2、提取剂为水溶液,避免使用有机溶剂,比较环保;3、结合化学衍生及高效的色谱分离,可显著提高检测灵敏度,将植物样品用量降低到毫克甚至亚毫克级别。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定微量植物样品中内源激素的样品预处理方法,属于分析化学领域。
背景技术
植物内源激素调控着植物生命活动的整个过程,准确定量测定植物内源激素是了解其在植物体内代谢途径和运输过程的重要前提,也是认知、调控植物生长发育的关键。为了更好阐释植物内源激素如何调控这些生理过程,必须精准确定其在植物体内的时-空分布,因此测定微量植物样品(质量在毫克甚至亚毫克级别)中内源激素的种类和含量至关重要。
植物内源激素的含量极低,且基质十分复杂,往往不能直接进行定量测定,必须先进行一系列的样品预处理。常规的植物样品预处理方法是在粉碎、研磨植物样品后,经过数小时甚至过夜的有机溶剂萃提和反萃取净化。其步骤繁多,过程冗长,容易出现样品转移损失。此外,粉碎、研磨不仅需要较大的样品量,还会导致样品的蹦跳溅射损失。因此,这类方法很难用于毫克及以下级别植物样品的预处理中,迫切需要发展一种高效、快速和能有效减少损失的植物样品预处理新方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定微量(毫克及亚毫克)植物样品中内源激素的样品预处理方法,在超声辅助下,直接酶解提取未粉碎或研磨植物样品中的内源激素,其特点是提取条件温和、速度快、适用性广。
本发明所提供的测定微量植物样品中内源激素的样品预处理方法,包括如下步骤:
在超声波辐射下,采用破壁酶提取植物样品中内源激素。
上述的样品预处理方法中,所述植物样品可为新鲜或干燥的植物组织、器官或它们的切片,如拟南芥种子、拟南芥花、麦芽尖、水稻种子及其切片等,可以不进行研磨或粉碎处理,直接进行所述提取。
上述的样品预处理方法中,所述破壁酶可为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和离析酶中的至少一种,即能够溶破植物细胞壁的酶类制剂。
上述的样品预处理方法中,在超声波提取仪或超声波清洗仪中进行所述提取。
上述的样品预处理方法中,所述内源激素为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸及其衍生物和水杨酸及其衍生物中的至少一种。
上述的样品预处理方法中,所述破壁酶的加入量小于所述植物样品质量的15%。
上述的样品预处理方法中,采用水(如采用由浓盐酸稀释成的0.12mol/L的盐酸调节成一定pH的水溶液)溶解所述破壁酶进行所述提取。
上述的样品预处理方法中,所述提取的温度为所述破壁酶的最适温度,时间为内源激素达到提取平衡时所需要的时间。
在上述样品预处理方法的基础上,本发明还提供了一种微量植物样品中内源激素的测定方法,包括如下步骤:
按照上述方法对植物样品进行预处理,得到样品提取液;所述样品提取液经纯化或经纯化、衍生后通过分析仪器采集响应信号,采用内标法对内源激素进行定量。
具体地,可通过液液萃取(如乙酸乙酯)的方式进行纯化;
采用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)进行衍生化处理。
具体地,所述分析仪器可为液相色谱-质谱联用仪、液相色谱-光学检测器联用仪、气相色谱-质谱联用仪、毛细管电泳-质谱联用仪或毛细管电泳-光学检测器联用仪;
其中,所述液相色谱-质谱联用仪优选超高效液相色谱-电喷雾电离源-串联质谱联用仪(UHPLC-ESI-MS/MS);
其中,所述液相色谱-光学检测器联用仪优选超高效液相色谱-光电二极管阵列检测器联用仪(UHPLC-PDA)。
本发明具有如下优点:
1、利用超声辅助酶解原理,不粉碎或研磨植物样品而直接提取内源激素,提取条件温和、操作简单、快速;
2、提取剂为水溶液,避免了使用有机溶剂,比较环保;
3、结合化学衍生及高效的色谱分离,可显著提高检测灵敏度,将植物样品用量降低到毫克甚至亚毫克级别。
附图说明
图1是基于本发明方法定量测定植物样品中多种内源激素的流程图。
图2是本发明实施例3中测到的6种内源性赤霉素(GAs)及其氘代内标([2H2]GAs)的离子流图,其中,峰1为GA8,峰2为GA29,峰3为GA20,峰4为GA4,峰5为GA19,峰6为GA53,黑色代表内源性GAs(右侧峰),而紫红色代表[2H2]GAs(左侧峰)。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1、测定一朵拟南芥花中九种内源性GAs的含量
流程图如图1所示。
1)准确称量三朵拟南芥花,质量在0.65~0.83mg之间,分别转移至三个离心管中,加入九种5fmol的[2H2]GAs(包括[2H2]GA4、[2H2]GA8、[2H2]GA9、[2H2]GA12、[2H2]GA19、[2H2]GA24、[2H2]GA29、[2H2]GA34和[2H2]GA51);
2)称取一定量纤维素酶R-10固体粉末,溶解在pH为4.5的水(用浓盐酸稀释成的0.12mol/L的盐酸调节)中;
3)向盛有拟南芥花和[2H2]GAs的离心管中加入上述纤维素酶溶液(加入量为拟南芥花质量的5%),后将这些离心管置于超声波清洗仪中提取40min,温度为40℃。提取结束后,离心,收集上清液,植物样品残渣用pH为4.5的水洗涤两次,合并三次上清液,即得样品提取液;
4)将上述样品提取液的pH调到2.5,再用三倍体积的乙酸乙酯萃取三次,合并三次乙酸乙酯相,置于氮气流下吹干。得到干燥的纯化样品后,加入50μL 20mmol/L EDC的乙醇溶液,40℃下衍生300min。反应结束后,通过冷冻干燥除去溶剂,再用50μL超纯水重溶,最后用UHPLC-ESI-MS/MS检测分析(UHPLC分离条件为:色谱柱:采用XR-ODS超高压柱,柱的规格为:75mm×2.0mm I.D.,1.6μm;柱温设为40℃;进样体积为10μL;流动相为:A相,含0.1%甲酸的水;B相,含0.1%甲酸的乙腈;流速为0.3mL/min;梯度洗脱程序为:梯度洗脱程序为:0~1min,1~4%B;1~2min,4%~6%B;2~5min,6%~9%B;5~9min,9%~12%B;9~21min,12%~34%B;21~25min,34%~50%B;25~27min,100%B;27~31min,100~1%B。MS/MS检测条件为:离子源:电喷雾电离源(ESI),正离子扫描,多反应监测(MRM)模式;除溶剂管温度:300℃、加热块温度:400℃、接口温度:300℃;雾化气流速:3L/min、干燥气流速:15L/min、加热气流速:10L/min、碰撞气压力:230kPa);
5)配制上述九种GAs的系列标准样品溶液(0、5、10、50、100、500、1000、2500和5000pmol/L),分别加入九种[2H2]GAs,固定浓度在250pmol/L。经EDC衍生后,通过UHPLC-ESI-MS/MS检测分析,以GA衍生物峰面积与[2H2]GA衍生物峰面积的比值为纵坐标,以GA浓度与[2H2]GA浓度的比值为横坐标,绘制标准曲线。所得九种GAs的标准工作曲线如表1所示;
表1九种GAs的标准工作曲线
6)根据实际样品中九种分析物的峰面积与上述绘制的标准工作曲线,计算拟南芥花中九种内源性GAs的含量,结果如表2所示。
表2一朵拟南芥花中九种内源性GAs的含量
实施例2、测定3mm长麦芽尖中内源性吲哚乙酸(IAA)、肉桂酸(CA)的含量
流程图如图1所示。
1)准确称量五个3mm长的麦芽尖,质量在1.02~1.25mg之间,分别转移至五个离心管中,加入100fmol的IAA及CA的氘代内标([2H5]IAA和[2H7]CA);
2)称取一定量纤维素酶R-10固体粉末,溶解在pH为4.7的水中(用浓盐酸稀释成的0.12mol/L的盐酸调节);
3)向盛有麦芽尖和氘代内标的离心管中加入上述纤维素酶溶液(加入量为麦芽尖质量的6%),然后将这些离心管置于超声波清洗仪中提取10min,温度为50℃。提取结束后,离心,收集上清液;植物样品残渣用pH为4.7的水洗涤两次,合并三次上清液,即得样品提取液;
4)将上述样品提取液用0.12mol/L的盐酸调节pH为3.0,再用三倍体积的乙酸乙酯萃取三次,合并三次乙酸乙酯相,并置于氮气流下吹干。得纯化后的样品后,再加入50μL20mM EDC的乙醇溶液,进行衍生,反应条件为35℃,90min。反应结束后,离心(8000rpm,3min),通过真空冷冻干燥除去乙醇溶剂,再用50μL超纯水重溶,最后用UHPLC-ESI-MS/MS检测分析(条件同实施例1);
5)配制一系列IAA和CA的标准样品溶液(0、10、50、100、500、1000、2000、5000和7500pmol/L),通过UHPLC-ESI-MS/MS检测分析(条件同实施例1)。分别以IAA和CA的峰面积为纵坐标,以IAA和CA浓度为横坐标,绘制标准曲线;所得IAA和CA的标准工作曲线如表3所示;
表3 IAA和CA的标准工作曲线
6)根据实际样品中IAA和CA的峰面积与上述绘制的标准工作曲线,计算麦芽尖中内源性IAA和CA的含量,结果如表4所示。
表4 3mm长麦芽尖中内源性IAA和CA的含量
由于IAA和CA本身具有紫外吸收,因此纯化后,可不经过EDC衍生,直接借助UHPLC-PDA检测(UHPLC分离条件同实施例1,PDA检测波长为200-350nm),检测结果与上述无实质性差异。
实施例3、测定一粒水稻种子中六种内源性GAs的含量
流程图如图1所示。
1)准确称量五粒水稻种子,质量在25.3~25.9mg之间,分别转移至五个离心管中,加入15fmol的六种[2H2]GAs(包括[2H2]GA4、[2H2]GA8、[2H2]GA19、[2H2]GA20、[2H2]GA29和[2H2]GA53);
2)称取一定量纤维素酶R-10固体粉末,溶解在pH为5.0的水中(用浓盐酸稀释成的0.12mol/L的盐酸调节);
3)向盛有水稻种子和[2H2]GAs的离心管中加入上述纤维素酶溶液(加入量为水稻种子质量的5%),然后将这些离心管置于超声波清洗仪中提取50min,温度为40℃。提取结束后,离心,收集上清液,植物样品残渣用pH为5.0的水洗涤两次,合并三次上清液,得到样品提取液;
4)将上述样品提取液用0.12mol/L的盐酸调节pH为2.7,再用三倍体积的乙酸乙酯萃取三次,合并三次乙酸乙酯相,并置于氮气流下吹干。得纯化后的样品后,再加入50μL20mmol/L EDC的乙醇溶液,在40℃下衍生反应300min。反应结束后,通过冷冻干燥除去乙醇溶剂,再用50μL超纯水重溶,最后通过UHPLC-ESI-MS/MS检测分析(条件同实施例1);
5)配制一系列上述六种GAs的标准样品溶液(0、5、10、50、100、500、1000、2500和5000pmol/L)并分别加入固定浓度的六种[2H2]GAs(500pmol/L)。经EDC衍生后,通过UHPLC-ESI-MS/MS检测分析(条件同实施例1)。以GA衍生物峰面积与[2H2]GA衍生物峰面积的比值为纵坐标,以GA浓度与[2H2]GA浓度的比值为横坐标,绘制标准曲线。所得六种GAs的标准工作曲线如表5所示;
表5六种GAs的标准工作曲线
6)根据实际样品中六种分析物的峰面积与上述绘制的标准工作曲线,计算水稻种子中六种内源性GAs的含量,结果如表6所示。
表6一粒水稻种子中六种内源性GAs的含量
综上所述,本发明所提供的方法,不经研磨或粉碎植物样品,而利用超声辅助酶解原理直接从植物样品中提取内源激素,提取物经纯化(或进一步衍生后),结合UHPLC-ESI-MS/MS或UHPLC-PDA分析技术,可测定质量在亚毫克到毫克级别的新鲜或干燥植物样品中多种内源激素,提取条件温和,操作简单并且适用范围广。
Claims (9)
1.一种测定微量植物样品中内源激素的样品预处理方法,包括如下步骤:
在超声波辐射下,采用破壁酶提取植物样品中内源激素。
2.根据权利要求1所述的样品预处理方法,其特征在于:所述植物样品为新鲜或干燥的植物组织、器官或它们的切片。
3.根据权利要求1或2所述的样品预处理方法,其特征在于:所述破壁酶为纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶和离析酶中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的样品预处理方法,其特征在于:在超声波提取仪或超声波清洗仪中进行所述提取。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的样品预处理方法,其特征在于:所述内源激素为生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸及其衍生物和水杨酸及其衍生物中的至少一种。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的样品预处理方法,其特征在于:所述破壁酶的加入量小于所述植物样品质量的15%。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的样品预处理方法,其特征在于:采用水溶解所述破壁酶进行所述提取。
8.一种微量植物样品中内源激素的测定方法,包括如下步骤:
按照权利要求1-7中任一项所述方法对植物样品进行预处理,得到样品提取液;所述样品提取液经纯化或经纯化、衍生后通过分析仪器采集响应信号,采用内标法对内源激素进行定量。
9.根据权利要求8所述的测定方法,其特征在于:所述分析仪器为液相色谱-质谱联用仪、液相色谱-光学检测器联用仪、气相色谱-质谱联用仪、毛细管电泳-质谱联用仪或毛细管电泳-光学检测器联用仪。
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