FR2973112A1 - Procede de detection et de quantification d'une molecule cible dans un echantillon - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne un procédé d'identification et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) déposer l'échantillon à analyser sur un support ; b) analyser l'échantillon par spectrométrie de masse, de manière à obtenir le spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon ; c) pondérer le signal associé au spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon par un coefficient d'extinction (TEC) spécifique de la molécule cible et de l'échantillon ; d) utiliser le signal pondéré de la molécule cible pour déterminer la quantité de molécule cible dans l'échantillon.
Description
PROCEDE DE DETECTION ET DE QUANTIFICATION D'UNE MOLECULE CIBLE DANS UN ECHANTILLON
Domaine de l'invention L'invention concerne un procédé de détection et de quantification d'au moins une molécule cible dans un échantillon par spectrométrie de masse. Plus particulièrement, l'invention fournit un procédé permettant la détection et la quantification d'une molécule cible directement à la surface d'un échantillon, en utilisant l'imagerie par spectrométrie de masse, et notamment l'imagerie MALDI. D'une manière générale, l'invention trouve des applications dans tout domaine où la quantification d'une molécule dans un échantillon est utile/nécessaire. L'invention trouve par exemple des applications dans le domaine pharmaceutique pour étudier la distribution et la pharmacocinétique d'un médicament dans différents tissus biologiques. L'invention trouve également des applications dans le domaine de l'agrochimie, notamment pour évaluer la toxicité et la dégradation d'une molécule telle qu'un herbicide dans des plantes et/ou dans l'environnement (sol, nappes phréatiques environnantes etc.).
Etat de la technique La spectrométrie de masse est une technique largement connue et utilisée en analyse chimique et biochimique, pour détecter et identifier des molécules d'intérêt dans un échantillon. Depuis quelques années, l'imagerie moléculaire par spectrométrie de masse, telle que l'imagerie MALDI, s'est développée, permettant de visualiser la distribution de molécules d'intérêt directement sur des coupes de tissus biologiques. L'imagerie MALDI, de par sa très grande sensibilité, permet de visualiser simultanément la distribution d'un très grand nombre de molécules différentes directement à la surface d'un échantillon. Dans le domaine pharmaceutique, cette technologie permet par exemple de comparer la distribution d'une molécule dans différents organes à différents temps de traitement. Cependant, dans le cas où une quantification de la molécule ainsi détectée à l'instant t est souhaitée, il est nécessaire de coupler cette technique d'imagerie à une analyse chimique quantitative, par une méthode classique ou instrumentale. Cette seconde étape de quantification est source d'erreurs de manipulation et d'interprétation.
De plus, elle ne permet pas une corrélation directe entre la présence de la molécule d'intérêt et sa distribution quantitative dans l'échantillon.
Exposé de l'invention L'invention propose un procédé utilisant d'une manière générale la spectrométrie de masse pour, lors d'une même analyse, détecter et quantifier une molécule cible dans un échantillon. Préférentiellement, le procédé selon l'invention utilise l'imagerie par spectrométrie de masse, qui permet une acquisition automatisée d'un signal lié au spectre de masse de la molécule, directement sur l'échantillon, afin de reconstruire des images de la distribution et de la quantité de ladite molécule cible dans l'échantillon.
Pour cela, selon l'invention, on définit et on intègre dans le procédé un coefficient dit d'extinction (TEC) de la molécule cible, qui est propre à chaque molécule cible dans un échantillon donné. En effet, une molécule donnée à une concentration donnée n' émet pas un signal de même intensité selon l'échantillon dans lequel elle est détectée. De même, deux molécules différentes à une concentration identique dans un échantillon donné présentent une intensité de signal différente. Le calcul et l'intégration du TEC permettent d'appréhender et de prendre en compte les variations de l'intensité du signal associé au spectre de masse de la molécule cible dans l'échantillon à analyser. On peut ensuite utiliser le TEC pour normaliser le signal obtenu pour ladite molécule, afin qu'il soit représentatif de sa concentration, indépendamment de la nature de l'échantillon et de sa localisation dans ledit échantillon. Une quantification directe de la molécule à partir des résultats de spectrométrie de masse obtenus pour la molécule cible dans l'échantillon analysé est ainsi rendue possible.
L'invention a donc pour objet un procédé d'identification et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) déposer l'échantillon à analyser sur un support ; b) analyser l'échantillon par spectrométrie de masse, de manière à obtenir le 30 spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon ; c) pondérer un signal associé au spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon par un coefficient d'extinction (TEC) spécifique de la molécule cible et de l'échantillon ; et d) utiliser le signal pondéré de la molécule cible pour déterminer la quantité de 35 molécule cible dans l'échantillon.
Le procédé selon l'invention peut s'appliquer à tout type d'échantillon pouvant être analysé par un spectromètre de masse, qu'il soit organique ou inorganique, liquide ou solide. Il est également applicable à tout type de support (lame, plaque, membrane, etc.). Le procédé est ainsi particulièrement adapté à l'analyse de tissus biologiques.
Dans ce cas, des coupes de tissu sont effectuées, typiquement de l'ordre de quelques micromètres d'épaisseur, et sont déposées sur un support, tel qu'une lame, permettant leur introduction au sein du spectromètre de masse. Le procédé selon l'invention peut également être utilisé pour l'analyse de tous liquides biologiques, tels que sang, plasma, sérum, salive, liquide céphalo-rachidien, urine, etc. Le procédé selon l'invention peut également être utilisé pour l'analyse d'échantillon environnementaux, tels que des échantillons de terre, d'eau, de végétaux, etc.
Lors de l'étape a), l'échantillon peut être déposé par toute technique connue en soi, c'est-à-dire manuellement (par exemple au moyen d'une pipette), ou automatiquement, en utilisant un appareil de spotting. L'échantillon peut être dilué ou traité avant dépôt.
L'étape b) d'analyse de la molécule cible peut se faire par toute méthode de spectrométrie de masse, et notamment en utilisant la spectrométrie de masse directe 20 (MS) ou en tandem (MS', MRM, SRM). Les paramètres expérimentaux, comme la gamme de masse et/ou l'intensité laser sont avantageusement fixés de manière à optimiser la détection de la molécule cible en termes d'intensité, de sensibilité et de résolution. On procède alors à l'acquisition des spectres de masse. 25 Pour l'étape c), différentes caractéristiques spectrales peuvent être utilisées comme signal, et notamment l'intensité des pics du spectre de masse, le rapport signal sur bruit (S/N), l'aire du pic, etc. Une étape importante de la méthode réside dans la normalisation du signal 30 mesuré. Pour cela, la caractéristique spectrale choisie comme signal pour la molécule cible dans l'échantillon est pondérée par un coefficient dit d'extinction (TEC) propre à la molécule et à l'échantillon. Cette pondération permet de normaliser le signal et de le rendre dépendant uniquement de la quantité de molécule à l'origine du signal.
35 Le TEC est représentatif de la perte ou du gain d'intensité du signal de la molécule cible suivant la nature de l'échantillon et/ou sa localisation sur l'échantillon, par rapport au signal de ladite molécule sur un support d'analyse, inerte. Le TEC est dépendant de plusieurs facteurs, et notamment de l'origine de l'échantillon (animale, végétale, bactérie, inorganique), du type de surface (tissu, cellule végétale, métaux, etc.), de l'environnement chimique, du traitement chimique ou non de l'échantillon etc. Dans le cas d'un échantillon de tissu biologique, le coefficient d'extinction de la molécule correspond alors au coefficient d'extinction tissulaire.
Avantageusement, on effectue une étude histologique, chimique ou autre, préalable de l'échantillon afin de définir différentes zones d'intérêt et de les implémenter dans le calcul du TEC. En effet, le TEC peut être lié à une zone spécifique d'un échantillon, notamment sur un échantillon présentant une hétérogénéité.
D'une manière générale, le TEC est obtenu par la relation suivante: TEC = Signal de la Molécule cible dans un milieu de référence/Signal de la Molécule cible dans l'échantillon Le signal correspond à la caractéristique spectrale du spectre de masse de la molécule cible choisie, par exemple l'intensité du pic obtenu sur le spectromètre de masse de ladite molécule. Bien entendu, la caractéristique spectrale utilisée pour la molécule dans le milieu de référence et sur l'échantillon doit être la même. 20 Le TEC est calculé en utilisant une même concentration de la molécule cible dans un milieu de référence et sur l'échantillon qui doit être analysé. Il est également possible d'utiliser, à la place de la molécule cible dans un milieu de référence, une molécule différente ayant des propriétés physico-chimiques semblables à celles de la 25 molécule cible.
Pour le calcul du TEC, le milieu de référence correspond avantageusement au support d'analyse seul. Pour cela, par exemple, la molécule est solubilisée dans un milieu adéquat (solvant organique, eau ou autre) avant dépôt sur le support d'analyse. 30 Le dépôt est suivi d'une évaporation du solvant, de sorte qu'on obtient un dépôt sec de la molécule sur ledit support. C'est le signal obtenu pour ladite molécule sur le support d'analyse qui est utilisé ensuite pour le TEC.
La valeur du TEC est généralement une moyenne de plusieurs mesures de la 35 molécule cible dans les mêmes conditions, afin d'obtenir un coefficient fiable.15 Préférentiellement, le coefficient d'extinction (TEC) est calculé une seule fois pour une molécule cible donnée dans un type d'échantillon donné, et est réutilisé pour chaque analyse de ladite molécule cible dans le type d'échantillon donné. Ainsi, une banque de TECs, répertoriant le TEC d'une molécule cible dans plusieurs échantillons différents, peut avantageusement être constituée pour une molécule cible donnée, et utilisée à chaque analyse de ladite molécule dans différents échantillons. En variante, la valeur du TEC peut être déterminée préalablement à chaque analyse.
Lors de l'étape d), on utilise le signal pondéré mesuré dans l'échantillon pour quantifier ladite molécule. En effet, la valeur du signal pondéré ne dépend plus que de la concentration en la molécule. Il est alors possible, par exemple, de déterminer la quantité de molécule cible en se référant à un signal de référence pour la molécule cible.
Par signal de référence pour la molécule cible, on entend un signal représentatif d'une concentration connue, indépendamment de la nature de l'échantillon et de sa position dans l'échantillon. Le signal de référence peut être une valeur moyenne ou médiane (ou une gamme de valeurs moyennes ou médianes) déterminée ou établie auparavant pour une quantité connue d'une molécule donnée. Il peut également s'agir d'une courbe étalon.
En fonction de la méthode choisie et le cas échéant du signal de référence utilisé, il est possible de déterminer la quantité de molécule cible de manière relative ou absolue.
Par exemple, le signal de référence est obtenu en préparant une gamme étalon avec au moins trois concentrations différentes connues de la molécule cible (ou d'une molécule autre présentant des propriétés physico-chimiques semblables à celles de la molécule cible), dans un milieu de référence tel qu'un support d'analyse sur lequel la molécule solubilisée a été déposée. Dans le cas où la molécule est déposée sur un échantillon de tissu, la molécule est avantageusement adsorbée sur ledit tissu après dépôt et évaporation du milieu de solubilisation.
Un standard interne, différent de la molécule cible, peut être introduit dans la gamme étalon, cela afin de normaliser le signal de ladite molécule cible. La molécule utilisée comme standard interne présente avantageusement des propriétés physico- chimiques semblables à celles de la molécule cible. Une concentration constante de ce standard est ajouté à la gamme étalon de la molécule cible avant le dépôt.
On analyse ensuite le spectre de masse pour chaque concentration. La caractéristique spectrale choisie comme signal de comparaison est relevée pour chacune desdites concentrations. Avantageusement, suite à l'obtention des spectres de masse sur chaque point de concentration, on peut utiliser la caractéristique spectrale associée choisie pour établir une courbe d'étalonnage pour ladite molécule. Il suffit ensuite de se référer à cette courbe d'étalonnage pour déterminer de manière précise la concentration dans l'échantillon analysé.
Lorsque le procédé selon l'invention utilise une technique d'imagerie par spectrométrie de masse nécessitant l'emploi d'une matrice, telle que l'imagerie MALDI ou ME-SIMS (Matrix Enhanced Secondary Ion Mass Spectrometry) il est possible d'utiliser une molécule étalon pour obtenir le signal de référence de la molécule cible. Par exemple, on peut ajouter une molécule étalon, de masse moléculaire connue et à une concentration connue, à la matrice MALDI devant être utilisée, l'ensemble étant déposé sur l'échantillon à analyser et sur le support avant l'étape b) d'analyse, le signal obtenu pour la molécule étalon correspondant au signal de référence pour la molécule cible. Par comparaison du signal de la molécule cible et du signal de référence, on peut déduire la quantité relative en molécule cible dans l'échantillon. La molécule étalon est une molécule quelconque dont on connait le poids moléculaire. Préférentiellement, on utilise comme molécule étalon une molécule présentant un poids moléculaire éloigné du poids moléculaire de la molécule cible, de manière à ce que les spectres de masse obtenus soient aisément analysables. La concentration de la molécule étalon, reprise dans une solution de solubilisation (aqueuse ou contenant un solvant), est définie afin de ne pas saturer le signal global. L'ensemble matrice+molécule étalon est déposé uniformément sur l'échantillon ainsi qu'en périphérie de ce dernier, c'est-à-dire sur le support d'analyse, pour permettre le calcul du TEC. Lors du séchage, une co-cristallisation du mélange peut être observée à l'oeil nu. Le signal obtenu pour la molécule étalon, dont la concentration est connue, permet de normaliser les caractéristiques spectrales de la molécule cible, pour permettre sa quantification. Il est alors également possible de tenir compte de l'effet matrice, décrit plus en détail par la suite.
Une autre possibilité pour obtenir un signal de référence est d'utiliser une molécule deutérée, ou une molécule marquée par tout autre isotope adapté. Par exemple, on peut ajouter à l'échantillon à analyser, avant l'étape b) d'analyse, une concentration connue de la molécule cible marquée par des atomes de deutérium. On peut alors suivre simultanément sur l'échantillon analysé la molécule cible et sa complémentaire deutérée. En considérant que leur ionisation sera identique, leur analyse par spectrométrie de masse aboutit au même signal avec une différence de masse induite par la présence de deutérium. Le signal obtenu pour la molécule deutérée correspond au signal de référence pour la molécule cible. La concentration de la molécule deutérée étant connue, le calcul du ratio peut alors être effectué pour aboutir à une quantité relative.
Le procédé selon l'invention peut être avantageusement utilisé avec l'imagerie par spectrométrie de masse. Dans ce cas, il est possible d'utiliser différentes sources d'ionisation, MALDI (Désorption-Ionisation Laser Assistée par Matrice), LDI (Désorption-Ionisation Laser), DESI (Désorption-Ionisation par Electrospray), etc, combinée à différents types d'analyseurs, TOF (Temps de Vol), Orbitrap, FTICR (Résonance Cyclotronique des Ions à Transformée de Fourier), etc. Cette technique d'imagerie permet de quantifier la molécule cible directement sur la carte de densité ionique obtenue pour l'échantillon, correspondant à la répartition spatiale de la molécule cible dans ledit échantillon. On peut en effet comparer le signal pondéré sur ladite carte de densité ionique à un signal de référence spécifique de la molécule d'intérêt. Certaines techniques d'imagerie par spectrométrie de masse, telles que MALDI ou ME-SIMS, nécessitent de recouvrir préalablement l'échantillon à analyser d'une matrice comportant de petites molécules organiques absorbant dans l'UV. Cette matrice permet la désorption et l'ionisation des molécules présentes sur l'échantillon.
Le procédé selon l'invention peut être utilisé quelle que soit la matrice choisie.
Ces matrices se présentent sous forme solide (cristallisation sur l'échantillon) ou liquide et sont dites ioniques ou non. Le choix de la matrice s'effectue selon la gamme de masse analysée. Elles sont le plus souvent préparées extemporanément dans un mélange solvant-solution aqueuse.
Plusieurs modes de dépôt de la matrice sont possibles, et notamment le dépôt manuel à l'aide d'une pipette, qui permet de déposer un volume précis de matrice directement sur l'échantillon. Il également possible de déposer la matrice par spray ou nébulisation, la matrice étant sprayée ou nébulisée directement sur le tissu à l'aide d'un robot ou manuellement. De même, un dépôt par microgouttelettes par lequel la matrice est spottée sur l'échantillon via des systèmes piézo-électriques, acoustique ou pousse-seringue peut être envisagé. Il est également possible de déposer la matrice par tamisage, afin de déposer la matrice sous forme solide.
Avantageusement, dans le cas où le procédé selon l'invention utilise l'imagerie par spectrométrie de masse de type MALDI, on prévoit une étape d'évaluation de l'homogénéité du dépôt de matrice sur l'échantillon. En effet, le signal correspondant à la matrice utilisée peut renseigner quant à la qualité/uniformité du dépôt de ladite matrice. Les défauts de matrice à la surface de l'échantillon peuvent ensuite être corrélés à la non-détection ou à la perte d'intensité du signal de la molécule cible dans l'échantillon considéré. L'évaluation de l'homogénéité de la matrice peut se faire selon des critères qualitatifs, en observant au microscope optique l'homogénéité du dépôt à la surface de l'échantillon, et/ou selon des critères quantitatifs, en suivant les variations du signal relatif à la matrice elle-même sur l'échantillon. En ce qui concerne les critères qualitatifs, il faut s'assurer que la matrice a été déposée le plus uniformément possible sur la surface considérée, qu'il n'existe pas de 20 zones vide de matrice et que sa cristallisation est optimale. Pour l'évaluation quantitative de l'homogénéité du dépôt de matrice, on considère la matrice comme une molécule propre dont le signal est détecté au même titre que le signal de la molécule cible, au moment de l'analyse d'un échantillon. Le signal de la molécule de matrice est ensuite comparé à son signal de référence. Le signal 25 de référence de la matrice correspond dans ce cas au signal émis par la matrice sur un dépôt de matrice de référence, c'est-à-dire sur un échantillon et sur un support d'analyse utilisés spécifiquement pour la mesure du signal de référence de la matrice. Par ces étapes additionnelles, on valide et normalise le signal de la molécule cible pour tenir compte de la variation de la qualité du dépôt de matrice pouvant jouer 30 sur les caractéristiques spectrales de cette dernière. Cette prise en compte de l'effet matrice peut être particulièrement avantageuse dans le cas où on souhaite suivre l'évolution de la présence d'une molécule cible dans le temps, la qualité du dépôt de matrice pouvant varier d'un échantillon à l'autre.
35 Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour l'analyse de toute sorte de molécules, comme par exemple des peptides, des polypeptides, des protéines, des acides aminés, des acides nucléiques, des lipides, des métabolites, etc., et, en général, pour toute molécule active sur le plan pharmaceutique ou autre qui puisse être ionisée par spectrométrie de masse.
Dans le cas où la molécule cible est une protéine de poids moléculaire élevé, il est possible d'effectuer un prétraitement enzymatique de la molécule cible, afin de la cliver en plusieurs peptides (figure 2). La détection et la quantification sont alors réalisées pour au moins un des peptides issus de ladite digestion enzymatique, représentatif de ladite protéine. Par exemple, on peut utiliser de la trypsine, afin de cliver la protéine cible en plusieurs peptides préalablement identifiés.
De même, il est possible de traiter l'échantillon à analyser avec au moins un solvant et/ou au moins un détergent avant l'étape b) de détection, de manière à éliminer des molécules responsables de bruit de fond. Par exemple, un lavage au chloroforme (figure 1 - a) permet de retirer certaines classes de lipides. Un lavage à l'éthanol (figure 1 - b) permet quant à lui une meilleure détection des molécules de masses faibles. Ces deux lavages permettent, dans l'expérimentation illustrée à la figure 1, de retirer certaines molécules, notamment lipidiques, favorisant ainsi la détection de nouveaux ions directement sur le tissu.
Le procédé selon l'invention peut également être utilisé pour détecter et quantifier au moins deux molécules cibles différentes sur un même échantillon, simultanément ou non.
Le procédé selon l'invention est particulièrement adapté à la détection et à la quantification de molécules cibles sur une coupe de tissu biologique, végétale ou animale. Notamment l'analyse sur une coupe d'un animal entier peut permettre de comparer, sur un même échantillon, la distribution de molécules cibles dans différents tissus dudit animal.
Selon l'invention, la normalisation des données sources, c'est-à-dire le TEC de la molécule cible et l'effet matrice, en vue de la quantification peut être effectuée au moyen d'un programme d'ordinateur intégrant tout ou partie de ces facteurs. Ce programme d'ordinateur, ou logiciel de retraitement des données, utilise avantageusement la valeur du TEC pondéré le cas échéant par l'effet de matrice lors du traitement de l'image en cas d'imagerie par spectrométrie de masse.
L'invention a donc également pour objet un support de données lisible par ordinateur comprenant des instructions exécutables par l'ordinateur, comme par exemple la lecture de données brutes issues de l'analyse par spectrométrie de masse, et/ou la détermination des TEC et/ou la détermination de la courbe d'étalonnage, et/ou la normalisation des données brutes par ces derniers afin d'obtenir une valeur quantitative de la molécule cible. Avantageusement, ces instructions exécutables par l'ordinateur sont adaptées pour permettre à un système informatique d'exécuter au moins l'étape c) du procédé selon l'invention. Le support de données comporte avantageusement au moins une base de données du TEC d'au moins une molécule cible dans au moins deux types d'échantillon différents. Préférentiellement, dans le cas d'échantillons biologiques, tels qu'une coupe d'un animal entier, la base de données répertorie le TEC d'au moins une molécule cible dans les différents tissus dudit échantillon. Le support de données peut également comporter une base de données du signal de référence d'au moins une matrice utilisée en imagerie par spectrométrie de masse. Ainsi, il est possible de tenir compte de l'effet matrice lors de l'analyse de l'échantillon par imagerie mettant en oeuvre le support de données.
Brève description des figures Figure 1. Exemples de l'effet de deux lavages en analyse directe par spectrométrie de masse au niveau du coeur. (a) : signal obtenu au niveau du coeur sans aucun lavage préalable au dépôt de matrice. (b) : signal obtenu au niveau du coeur sur une coupe adjacente de (a) à l'aide d'un lavage à l'éthanol 90% préalablement au dépôt de matrice. (c) : signal obtenu au niveau de l'estomac sur une coupe adjacente de (a) à l'aide d'un lavage au chloroforme 100% préalablement au dépôt de matrice ; Figure 2. Spectre de masse MALDI-TOF d'une protéine modèle digérée (de l'albumine sérique bovine avec comme enzyme de digestion, la trypsine) sur (a) un support de référence (lame) et (b) sur un tissu (foie de rat). Exemple du fragment m/z 928 (YLYEIAR) : observation de l'extinction des signaux massiques relatifs au peptide sur le tissu, le TEC étant égale à 1,62 ; Figure 3. Une représentation schématique des principales étapes du procédé de l'invention, selon un exemple de mise en oeuvre utilisant l'imagerie par spectrométrie de masse ; Figure 4. Méthodologie de calcul du coefficient d'extinction tissulaire, dans le cas de l'étude de la distribution du propranolol dans un corps entier de souris. (a) Image optique d'une coupe sagittale de souris témoin permettant de visualiser différents organes ou zones cibles (1 lame, 2 cerveau, 3 rein, 4 poumon, 5 foie, 6 coeur). (b) Image par spectrométrie de masse de la distribution du standard interne (Propranolol, ion [M+H]+ à m/z 260) mélangé à la matrice sur et en dehors de l'échantillon et échelle d'intensité ; Figure 5. Méthodologie de calcul du coefficient d'extinction tissulaire du propranolol dans le rein. Figure 5A : Image optique du rein, délimitation de plusieurs régions d'intérêt (ROI) ou zones de points d'égales dimensions au sein de l'organe cible. Figure 5B : Tableau des intensités moyennes du standard interne par ROI et entre ROI (ROI Moy) ; Figure 6. Figure 6A : Tableau récapitulatif des intensités du propranolol par 10 organes ou zones cibles. Figure 6B : Histogramme des intensités du propranolol par organes ou zones cibles ; Figure 7. Calcul du coefficient d'extinction tissulaire. Figure 7A : Relation mathématique Tableau récapitulatif des TECs calculés pour le propranolol par organes cibles. Figure 7B : Histogramme des TECs calculés pour le propranolol par organes 15 cibles ; Figure 8 : Détermination de la courbe d'étalonnage de la molécule cible. Figure 8A : Image optique des dépôts de la gamme étalon. Figure 8B : Image par spectrométrie de masse de la gamme étalon, distribution de la molécule cible ; Figure 9. Figure 9A : Tableau récapitulatif des intensités moyennes des ROI de 20 la gamme étalon de la molécule cible. Figure 9B : Représentation graphique de la droite d'étalonnage, Figure 9C : Coefficient de corrélations et équation de la droite ; Figure 10. Quantification sur l'image par spectrométrie de masse de la molécule cible (propranolol), dans un corps entier. Figure 10A : Image optique d'une coupe sagittale de souris à 20 min post injection de la molécule cible et visualisation de 25 différents organes ou zones cibles (2 cerveau, 3 rein, 4 poumon, 5 foie, 6 coeur). Figure l0B : Image par spectrométrie de masse de la distribution à T60 min p.i. de la molécule cible (ion [M+H]+ à m/z 260) en intensité. Figure 10C : Image par spectrométrie de masse de la distribution à T20 min p.i. de la molécule cible après normalisation par le TEC et corrélation avec la droite d'étalonnage, accès à la quantité par unité de surface 30 de la molécule cible. Figure 11. Quantification sur l'image MS de la molécule cible, tableau récapitulatif de la quantité de molécule cible suivant les différents organes. Explication de la méthodologie de calcul de cette dernière à partir des intensités moyenne par organe et pixel avec l'utilisation du TEC. 35 Exemple Le procédé selon l'invention va maintenant être décrit plus en détail à l'aide d'un exemple précis et des figures présentées ci-dessus. Cet exemple est donné à titre indicatif et nullement limitatif de l'invention.
Dans l'exemple décrit, on se propose d'étudier distribution d'un médicament (le Propranolol) dans différents organes d'une souris par imagerie par spectrométrie de masse MALDI. Bien entendu, on pourrait de manière sensiblement identique utiliser un autre dispositif d'imagerie que le MALDI, comme par exemple les sources : SIMS, DESI, DIOS, ICP, Microscope MALDI, SNOM, SMALDI, LA-ICP, ESI (extraction liquide sur tissu), MILDI, JEDI, ELDI etc.
Matériel et méthode Matériel 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) de Sigma-Aldrich (Saint-Quentin Fallavier, France), Trifluoroaceticacid (TFA) de Sigma-Aldrich, Methanol de Sigma-Aldrich Propranolol de Sigma-Aldrich
Animaux Des souris mâles de type Swiss de poids 25-40g de chez Charles River (France) ont été utilisées. Le propranolol repris dans une solution à 0.9% NaCl a été injecté à 7.5mg/kg par voie intraveineuse. Les animaux ont été sacrifiés par asphyxie au CO2 20 minutes post-injection.. Les animaux ont ensuite été plongés dans une solution d'isopentane 100% refroidi par de l'azote liquide pour permettre une congélation rapide.
Le stockage a été effectué à -80°C.
Préparation des échantillons pour la spectrométrie de masse Les échantillons ont été coupés à 201um d'épaisseur à l'aide d'un crystat CM1510S (Leica microsystems, Nanterre, France) refroidi à -26°C. Les coupes ont ensuite été déposées sur une lame conductrice ITO (indium tin oxyde) (Bruker Daltonics, Bremen, Allemagne). Enfin les coupes ont été placées 20 minutes au dessiccateur.
Préparation pour l'acquisition en imagerie MALDI Une matrice DHB a été utilisée pour l'analyse de la molécule cible (propranolol) dans les coupes de tissu. Cette matrice a été préparée à 40 mg/mL Methanol/TFA 0.1% (1 :1, v/v). La solution de matrice a été déposée à l'aide du système sprayeur Suncollect (SunChrome, Allemagne). Sur la même lame en dehors de la coupe de tissu, une gamme de dilution du propranolol repris dans de l'eau a été déposée manuellement à l'aide d'une pipette (lui par point) préalablement au dépôt de matrice. Cette gamme de dilution s'étend de 10 à 0.02 pmol/µl et comprend 7 points.
Préparation pour le calcul du TEC Sur une coupe de tissu adjacente à celle utilisée pour l'acquisition en imagerie MALDI, une solution de matrice HCCA à lOmg/ml ACN /TFA 0.1% (7 :3, v/v) a été également préparée, à laquelle une solution de propranolol à l Opmol/µl a été ajoutée. La solution de matrice a été déposée à l'aide à l'aide du système sprayeur Suncollect (SunChrome, Allemagne) pour couvrir la surface de la coupe de tissu.
Acquisition en Imagerie MALDI Les images ont été obtenues à l'aide d'un AutoFlex Speed MALDI-TOF (Bruker Daltonics, Bremen, Allemagne) équipé d'un laser Smartbeam. Les données ont été générées en mode reflectron positif. Un total de 700 spectres a été obtenu sur chaque spot pour une fréquence laser à 1000 Hz pour une résolution spatiale de l'image à 300 x 300 µm2 sur une gamme de masse allant de 100 à 1000 Da. Le logiciel Flexlmaging version 2.1 a été utilisé pour reconstruire les images.
1- Calcul du TEC de la molécule cible (le propranolol) sur un échantillon témoin.
Une coupe sagittale de l'animal entier, préparée comme précisé ci-dessus, et servant d'échantillon témoin est déposée sur une lame. La solution de propranolol servant de standard interne est mélangée à la matrice ci-dessus, avant le dépôt de l'ensemble sur l'échantillon témoin.
On procède ensuite à une analyse par imagerie par spectrométrie de masse de l'échantillon témoin, afin d'obtenir une image de la distribution du standard interne sur l'échantillon témoin et sur la lame support (figure 3B).
Les différents organes d'intérêt peuvent avantageusement être repérés au préalable par imagerie optique de l'échantillon témoin (figure 3A ).
On délimite ensuite sur l'image par spectrométrie de masse de l'échantillon témoin plusieurs régions d'intérêt (ROI) d'égales dimensions pour chacun des organes et sur la lame. On choisie d'utiliser comme signal de référence l'intensité des pics du spectre de masse. On récupère les intensités moyennes du standard interne pour chaque ROI et pour chacun des organes d'intérêt. Pour chaque organe, on calcule une intensité moyenne (ROI moyen) à partir de l'intensité obtenue pour tous les ROIS correspondants. C'est ce ROI moyen qui sera utilisé pour le calcul du coefficient d'extinction du propranolol dans chacun des organes considérés.
La figure 5 montre schématiquement ces différentes étapes pour le rein. La figure 6A récapitule les ROI moyens obtenus pour le propranolol dans les différents organes d'intérêt de l'échantillon témoin, et la figure 6B montre l'histogramme des intensités de signal obtenu correspondant. 20 Le TEC peut alors être calculé (figure 7A) en utilisant les valeurs de ROIS moyens de la lame et de chacun des organes, selon la formule mathématique : Int(Ianme)a TEC = Int(tiscit)x Ainsi, pour une même concentration de propranolol, le signal associé dans le
25 rein est divisé par près de 13 par rapport au signal attendu, c'est-à-dire au signal sur la lame. Par contre, le signal est seulement divisé par 4.82dans le foie et 7.96 dans le coeur. Le signal est divisé par moins de 8 dans les poumons et par 6.18 dans le cerveau. 2- Courbe d'étalonnage du propranolol Dans l'exemple décrit ici à l'aide des figures 8 et 9, le signal de référence pour la molécule cible (propranolol) correspond au signal obtenu pour une gamme étalon de sept concentrations de propranolol.
35 On dépose sur une lame sept gouttes séchées à l'aide d'une pipette de manière manuel d'une solution de propranolol et de matrice, correspondant à sept concentrations 30 différentes de propranolol (de 0 à 3 pmol/µl). Pour une plus grande facilité de lecture, les gouttes sont déposées par concentrations croissantes et de manière suffisamment espacée pour éviter tout risque de chevauchement. L'image obtenue en spectrométrie de masse pour ces différentes concentrations (figure 8B) est normalisée pour tous les points de la gamme en utilisant une ROI de dimensions identiques, à partir de laquelle on définit une intensité moyenne de référence, ou signal de référence, pour le propranolol. Une droite d'étalonnage (figure 9B) peut alors être dessinée, permettant par la suite lors de l'analyse de corréler n'importe quelle intensité de signal obtenue pour le propranolol à une concentration par pixel.
3- Quantification du propranolol directement sur l'image en spectrométrie de masse de l'échantillon On dépose une coupe sagittale de l'animal entier, préparée comme précisé ci-dessus, et si possible dans le même plan que la coupe utilisée comme échantillon témoin lors du calcul du TEC, sur une lame, afin de procéder à une analyse en imagerie par spectrométrie de masse (Figure l0B).
L'intensité du signal obtenu pour le propranolol est augmentée dans chacun des organes d'intérêt en fonction du TEC calculé pour chacun.
On obtient ainsi une image en spectrométrie de masse de la coupe de l'animal entier, dans laquelle l'intensité du signal correspond à une intensité absolue, c'est-à-dire représentative de la seule concentration en propranolol (figure 10C). Cette image peut être corrélée à la droite d'étalonnage réalisée précédemment pour le propranolol, afin de déterminer la quantité de propranolol dans l'échantillon directement en visualisant l'image.
Ainsi, dans l'exemple décrit ici, on constate que le propranolol est pratiquement absent du foie et des poumons, contrairement au cerveau où la distribution du propranolol est la plus importante avec une quantité globale de molécule cible de l'ordre de 5 ng pour cet organe. On observe également du propranolol dans les reins et les poumons, à des quantités allant de 1,28 à 2 ng35
Claims (16)
- REVENDICATIONS1- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon comprenant les étapes suivantes : a) déposer l'échantillon à analyser sur un support ; b) analyser l'échantillon par spectrométrie de masse, de manière à obtenir le spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon ; c) pondérer un signal associé au spectre de masse de la molécule cible dans ledit échantillon par un coefficient d'extinction (TEC) spécifique de la molécule cible et de l'échantillon ; et d) utiliser le signal pondéré de la molécule cible pour déterminer la quantité de molécule cible dans l'échantillon.
- 2- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon la revendication 1, caractérisé en ce que le coefficient d'extinction (TEC) de la molécule cible dans l'échantillon à analyser correspond au ratio signal de la molécule cible dans un milieu de référence / signal de la molécule cible dans l'échantillon.
- 3- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon les revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le TEC est calculé une seule fois pour une molécule cible donnée dans un type d'échantillon à analyser donné, et est réutilisé pour chaque quantification de ladite molécule cible dans le type d'échantillon donné.
- 4- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la molécule cible est une protéine, un peptide, un lipide, un métabolite, ou toute molécule qui puisse être ionisée par spectrométrie de masse.
- 5- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'échantillon analysé est un échantillon organique ou minéral.
- 6- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que la molécule cible est une protéine et en ce qu'on procède à une digestion enzymatique de ladite molécule cible préalablement à l'étape b) de détection, la détection et la quantification étant réalisées pour au moins un des peptides issus de ladite digestion.
- 7- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'on traite l'échantillon avec au moins un solvant et/ou au moins un détergent avant l'étape b) d'analyse, de manière à éliminer des molécules responsables de bruit de fond.
- 8- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le signal associé au spectre de masse de la molécule cible correspond à l'intensité du pic, l'aire du pic ou le ratio signal/bruit dudit spectre de masse.
- 9- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé en ce qu'on utilise l'imagerie par spectrométrie de masse, l'intensité du signal de la molécule cible étant pondérée directement sur l'échantillon analysé, de manière à visualiser simultanément la distribution et la concentration en la molécule cible dans ledit échantillon.
- 10- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'on utilise l'imagerie par spectrométrie de masse, et en ce que avant l'étape b) d'analyse, on évalue l'homogénéité du dépôt de matrice sur l'échantillon, par rapport à un dépôt de matrice de référence.
- 11- Procédé de détection et de quantification par imagerie par spectrométrie de masse d'au moins une cible molécule dans un échantillon selon l'une quelconquedes revendications 1 à 10, caractérisé en ce qu'on détecte et quantifie simultanément au moins deux molécules cibles différentes dans ledit échantillon.
- 12- Procédé de détection et de quantification par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cibles dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 1l, caractérisé en ce que l'échantillon est une coupe d'au moins un tissu, et en ce qu'on détecte et quantifie la molécule cible par imagerie par spectrométrie de masse directement sur le tissu.
- 13- Procédé de détection et de quantification par imagerie par spectrométrie de masse d'au moins une molécule cible dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'échantillon est une coupe d'un animal entier, et en ce qu'on détecte et quantifie la molécule cible par imagerie par spectrométrie de masse directement sur ladite coupe, de manière à comparer simultanément la distribution de ladite cible dans différents tissus de l'animal.
- 14- Support de données lisible par ordinateur comprenant des instructions exécutables par l'ordinateur adaptées pour permettre à un système informatique d'exécuter l'étape c) du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
- 15- Support de données lisible par ordinateur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il comporte une base de données du TEC d'au moins une molécule cible dans au moins deux types d'échantillon différents. 25
- 16- Support de données lisible par ordinateur selon les revendications 14 ou 15, caractérisé en ce qu'il comporte une base de données du signal de référence d'au moins une matrice utilisée en imagerie par spectrométrie de masse.20
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